專利名稱：用于檢測檸檬黃的方法及酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測檸檬黃的方法及酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
檸檬黃色素是目前我國批準(zhǔn)使用的六種食用合成色素之一，被廣泛應(yīng)用于食品、 藥品、化妝品、醫(yī)療器具、煙草、飼料、食用包裝、日化品、玩具等領(lǐng)域。其分子結(jié)構(gòu)為偶氮化合物，在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物為對人體具有潛在危害的芳香類化合物。因此，我國對在食品中的檸檬黃色素有嚴(yán)格限制。如果人們長期或一次性大量食用檸檬黃含量超標(biāo)的食品，可能會引起過敏、腹瀉等癥狀，當(dāng)攝入量過大，超過肝臟負(fù)荷時(shí)，會在體內(nèi)蓄積，對腎臟、肝臟產(chǎn)生一定傷害。目前，檸檬黃國家標(biāo)準(zhǔn)所采取的檢測方法是薄層分析及分光光度計(jì)法，近年來， 我國科研工作者在檸檬黃檢測方面做了大量的工作，但都主要集中在理化檢測方面，文獻(xiàn)檢索尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于檸檬黃的ELISA檢測方法的報(bào)道，鑒于此，本發(fā)明研究和建立了檸檬黃的直接競爭ELISA檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有檸檬黃檢測產(chǎn)品中存在的不足，提供一種高特異性、高靈敏度、價(jià)格低廉、操作簡單，能大批量快速檢測檸檬黃的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供利用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測檸檬黃殘留的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下測定原理首先將檸檬黃抗原包被于固相載體，例如酶標(biāo)板上，然后加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，再加入酶標(biāo)記檸檬黃抗體，包被抗原與標(biāo)準(zhǔn)品/待測樣品中的檸檬黃競爭酶標(biāo)抗體，待測樣品檸檬黃含量高時(shí)，則與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就少，反之結(jié)合在固相抗原上的酶標(biāo)抗體就多，與固相抗原結(jié)合酶標(biāo)抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)減弱，百分吸光度值低，反之，則發(fā)色反應(yīng)增強(qiáng)，百分吸光度增高，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)，檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)檸檬黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，即可推算出待測樣品中檸檬黃的濃度。本發(fā)明的具體技術(shù)方案為提供一種檢測檸檬黃的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括檸檬黃抗原和檸檬黃的特異性抗體；所述特異性抗體為檸檬黃的多克隆抗體或單克隆抗體。提供一種檸檬黃殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包含下列成分(1)包被了檸檬黃抗原的酶標(biāo)板(2)酶標(biāo)記檸檬黃抗體工作液(3)檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液(4)底物顯色液(5)反應(yīng)終止液(6)濃縮洗滌液(7)樣品稀釋濃縮液
所述酶標(biāo)板采是96或40孔酶標(biāo)板，酶標(biāo)板孔內(nèi)包被有能與抗檸檬黃抗體特異結(jié)合的檸檬黃抗原，所用的包被液為PH9. 6、0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，碳酸鹽緩沖溶液含1 2g碳酸鈉、2 4g碳酸氫鈉和雙蒸水1L，封閉液為pH7. 4，含有5%山羊血清、10g/L 酪蛋白的0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液。所述酶標(biāo)記檸檬黃抗體工作液為采用過碘酸鹽法將酶與檸檬黃抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。所用標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，本發(fā)明優(yōu)選為辣根過氧化物酶，且采用改良后的過碘酸鹽氧化法進(jìn)行標(biāo)記，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良好的活性。所述檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0μ g/mL、l μ g/mL、3 μ g/mL、9 μ g/mL、27 μ g/mL、 81 μ g/ml0當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，所述底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶時(shí)，所述底物顯色液由底物液和底物緩沖液組成，底物液為對硝基磷酸鹽緩沖液，底物緩沖液為含有過氧化氫或氧化脲的pH = 5. 0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。
所述濃縮洗滌液為含5 %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH = 7. 4，濃度為0. lmol/L,為正常使用濃度的10倍。所述樣品稀釋液為0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH = 7. 4。其中，酶標(biāo)記檸檬黃抗體是如下制備的將檸檬黃抗體與辣根過氧化物(HRP)采用過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。具體方法為a)溶解5mg HRP于Iml超純水中，加入新配制的0. lmol/L多碘酸鈉75 μ L，置室溫或4°C冰箱反應(yīng)20分鐘或30分鐘。b)反應(yīng)完后裝入透析袋，O.OOlmol/L pH = 4. 0醋酸緩沖液4°C透析過夜，期間按
需更換透析液。c)將抗體用0. Olmol/L碳酸緩沖液稀釋至10mg/L，另外用0. Olmol/L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液pH調(diào)至9. 5。將0. 5ml抗體加入HRP溶液中，置室溫或4°C冰箱反應(yīng)2小時(shí)。d)加入100 μ L 4mg/mL硼氫化鈉，4°C冰箱反應(yīng)2小時(shí)。e)對0. Olmol/LPBS透析過夜，加入保存液_20°C保藏備用。其中，酶標(biāo)板的制備方法為用包被緩沖液將檸檬黃抗原按需要稀釋，向酶聯(lián)板微孔中加入抗原稀釋液，放入 37°C環(huán)境進(jìn)行孵育，再放入4°C環(huán)境中過夜孵育，得到的酶聯(lián)板的穩(wěn)定性好，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37°C孵育，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明同時(shí)提供了利用上述酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行食品中檸檬黃檢測的使用方法(1)樣品前處理；(2)使用試劑盒進(jìn)行檢測；
(3)結(jié)果處理與分析。本發(fā)明提供待測樣品前處理方法為當(dāng)所述樣品為液體食品時(shí)，所述樣品前處理方法為將液體食品除去氣體，與樣本稀釋液以體積比1 5-10混合，取混合后樣品用于分析；當(dāng)所述樣品為面糊、調(diào)味果醬類食品時(shí)，所述樣品前處理方法為將待檢物與樣本稀釋液以質(zhì)量體積比為1 10-15混勻，離心，取上清與樣本稀釋以一定比例稀釋后檢測。當(dāng)所述樣品為果醬、半固體復(fù)合調(diào)味料時(shí)，樣品置于水浴溶解/均質(zhì)，加一定量的正己烷脫脂，與樣本稀釋液以質(zhì)量體積比為1 10-15混勻，離心，取下層檢測。使用試劑盒檢測的方法為(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡；(2)將標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入已經(jīng)包被有檸檬黃抗原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，然后每孔加入酶標(biāo)記物，輕拍混勻，孵育；(3)洗滌；(4)每孔加入底物顯色液，輕拍混勻，避光孵育；(5)每孔加入反應(yīng)終止液，混合均勻，在波長450nm下，以空氣為空白，酶標(biāo)儀測定各孔吸光值；本發(fā)明提供的檢測結(jié)果處理與分析方法為以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計(jì)算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)， 檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程式求出對應(yīng)對應(yīng)樣品的檸檬黃濃度。所述百分吸光度值的計(jì)算式為百分吸光度值(％) = (B/B0) X 100其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Btl為0 μ g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。檸檬黃線性檢測范圍為0-135 μ g/ml，檢測限為1 μ g/ml，整個(gè)檢測過程只需30分鐘就可以完成。本發(fā)明提供了一種檢測樣品中的檸檬黃含量的方法，包括以下步驟1)用檸檬黃抗原包被酶標(biāo)板；2)加入檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品；3)加入酶標(biāo)記的檸檬黃特異性抗體，孵育，洗滌；4)加入底物顯色液顯色；5)加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)；6)通過比較檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的顏色，推測出待測樣品中的檸檬黃含量； 或者，測定各孔的吸光度，建立檸檬黃濃度相對于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線由待測樣品的吸光度推算出待測樣品中的檸檬黃含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的試劑盒采用直接競爭ELISA檢測模式，采用高特異性、高親合力的抗體， 減少了操作步驟，提高了檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度；采用包被抗原進(jìn)行酶標(biāo)板的包被，相對于抗體包被，更有利于達(dá)到較好的包被效果與較長的保存時(shí)間，從而提高了試劑盒檢測的精密度與穩(wěn)定性；另外本試劑盒利用酶標(biāo)板標(biāo)記抗體技術(shù)，且采用改良后的過碘酸鹽氧化法進(jìn)行標(biāo)記，將酶直接標(biāo)記于檸檬黃特異性抗體上，將檸檬黃特異性抗體與酶兩種最重要的反應(yīng)物合二為一，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良好的活性，不僅大大簡化了操作步驟和反應(yīng)時(shí)間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，而且無需再試劑盒內(nèi)再配置抗抗體，同時(shí)也節(jié)約了檸檬黃特異性抗體與酶的用量，從而大大降低了試劑盒的成本另外，本試劑盒選用單底物液，相對其他同類試劑盒的雙底物液，操作更為方便?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，本試劑盒非常適用于檸檬黃殘留的痕量分析與批量檢測，具有重要的現(xiàn)
眉、ο


圖1為檸檬黃ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1抗原的制備檸檬黃抗原的制備a. IOmg純化的檸檬黃加入到0. 5mL 0. 01mol/L磷酸緩沖液PBS，攪拌溶解；b.上述反應(yīng)液中加入50 μ mol EDC和50 μ mol NHS,室溫下反應(yīng)2小時(shí)；c.將上述活化的檸檬黃滴加到BSA溶液中(IOmg BSA溶入ImlPBS溶液)，室溫反應(yīng)2小時(shí)，然后用0. lmol/L pH7. 2的PBS透析3天，每天換透析液3次，分裝凍干后，_20°C保存。實(shí)施例2抗體的制備檸檬黃鼠單克隆抗體制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以檸檬黃半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為60μ g/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，腹腔注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑濕合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按4 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭酶聯(lián)免疫方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用顯微克隆法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5 X IO6個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在-70°C超低溫冰箱中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入 37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c 8周齡的小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5 X IO6個(gè)/只，7-10天后采集腹水。用免疫層析法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，"200C保存。實(shí)施例3酶標(biāo)記檸檬黃抗體的制備將檸檬黃抗體與辣根過氧化物(HRP)采用過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。具體方法為
7
a)溶解5mg HRP于Iml超純水中，加入新配制的0. lmol/L多碘酸鈉75 μ L，置室溫或4°C冰箱反應(yīng)20分鐘或30分鐘。b)反應(yīng)完后裝入透析袋，O.OOlmol/L pH = 4. 0醋酸緩沖液4°C透析過夜，期間需要更換透析液幾次。c)將抗體用0. 01mol/L碳酸緩沖液稀釋至10mg/mL，另外用0. 01mol/L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液pH調(diào)至9. 5。將0. 5ml抗體加入HRP溶液中，置室溫或4°C冰箱反應(yīng)2小時(shí)。d)加入100 μ L 4mg/mL硼氫化鈉，4°C冰箱反應(yīng)2小時(shí)。e)對0. 01mol/L PBS透析過夜，加入保存液_20°C保藏備用。實(shí)施例4酶聯(lián)免疫試劑盒組分的配制(1)濃縮洗滌緩沖液的配制含0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液 PH7. 4，濃度為0. lmol/L，為正常使用濃度的10倍。(2)樣品稀釋液的配制pH7. 4,0. Olmol/L、含有0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。(3)封閉液的配制含有5%山羊血清、10g/L酪蛋白的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。(4)底物顯色液的配制過氧化氫或過氧化脲與鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)的混合液終止液的配制(5)終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液，按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制。(6)酶標(biāo)板微孔板的包被包被抗原用pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成0. 1 0. 5 μ g/mL，其中碳酸鹽緩沖溶液含1 2g碳酸鈉和2 4g碳酸氫鈉以及雙蒸水 IL0在酶標(biāo)板的每孔加100μ L，37°C包被1小時(shí)后，4°C下包被過夜，傾去包被液，用PBST洗滌5次，拍干，然后在每孔中加入200 μ 1 0 5. 0%脫脂奶粉，放入37°C溫箱中2小時(shí)，甩干，干燥后封入鋁箔袋中4°C保存。(7)檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取檸檬黃標(biāo)樣10mg，溶于0. ImL 0. Imol/ L鹽酸溶液，然后用樣品稀釋液分別配制O μ g/mL、1 μ g/mL、3 μ g/mL,9 μ g/mL、27 μ g/mL、 81 μ g/mL檸檬黃溶液，4°C保存。(8)試劑分裝各種試劑按要求配制，測定合格后無菌分裝。酶標(biāo)記檸檬黃抗體工作液7ml/瓶，檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)樣品Iml/瓶，底物顯色液7ml/瓶，終止液7ml/瓶，濃縮洗液50mL/ 瓶，樣品稀釋液50mL/瓶。分裝后貼標(biāo)簽，注明批號和有效期，4°C保存。(9)試劑盒的組裝分別將可拆卸包被好抗原的微孔板1塊，酶標(biāo)記檸檬黃抗體工作液、底物顯色液、終止液、濃縮洗液、樣品稀釋液各1瓶，檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，使用說明書 1份置試劑盒內(nèi)指定位置。試劑盒檢驗(yàn)合格后封裝，4°C保存。實(shí)施例5組建檢測檸檬黃的酶聯(lián)免疫試劑盒，包含下述組分(1)包被檸檬黃抗原的96孔酶標(biāo)板，或根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格的需要選用40孔酶標(biāo)板；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記檸檬黃單克隆抗體，7mL/瓶；( 檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度分別為0 μ g/mL、1 μ g/mL,3 μ g/mL,9 μ g/mL、 27 μ g/mL、81 μ g/mL, ImL/ 瓶；(4)底物顯色液，7mL/瓶；⑶終止液，7mL/瓶；
(6)濃縮洗滌液，50mL/瓶；(7)樣品稀釋液，50mL/瓶；(8)使用說明書，1份；(9)蓋板膜，2張;(10)自封袋(含干燥劑)，1個(gè)。實(shí)施例6樣品處理方法1、飲料類食品(稀釋倍數(shù)5)如汽水、飲料等，取適量液體食品樣品anl，加入8ml樣本稀釋液，混勻，取50 μ 1進(jìn)行檢測2、面糊、調(diào)味果醬類食品(稀釋倍數(shù)10)取Ig樣品，加入9ml樣本稀釋液，混勻10分鐘；5000rpm，離心10分鐘，取上清 50 μ 1檢測。3、果醬、半固體復(fù)合調(diào)味料(稀釋倍數(shù)20)取Ig樣品，加入19ml樣本稀釋液，混勻，加入IOml正己烷，混勻10分鐘；5000rpm， 離心10分鐘，取上清50 μ 1檢測。實(shí)施例7使用試劑盒的檢測方法(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫，即20 ，平衡30分鐘以上，將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的條板固定于支架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按順序編號。(2)在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50yL標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50yL待測樣品。然后每孔加入 50 μ L酶標(biāo)記物，輕拍混勻。蓋上蓋板膜，在室溫孵育20分鐘。(3)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打，每輪洗板拍打3次，以保證完全除去孔中的液體。用250 μ L蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復(fù)操作5遍。(4)每孔加入100 μ L顯色液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，暗處室溫孵育15分鐘。(5)加入50 μ L反應(yīng)終止液到微孔中?；旌虾迷诓ㄩL450nm或492nm，測定各孔吸光值，必須在加入終止液后立刻讀取吸光度值。檢測結(jié)果計(jì)算與分析以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計(jì)算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)， 檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。見圖1。Y = -17. 657X+96. 476 ；R2 = 0. 9921。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程式求出對應(yīng)樣品的檸檬黃濃度。所述百分吸光度值的計(jì)算式為其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Btl為Oyg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。實(shí)施例8試劑盒精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗(yàn)從3批按照實(shí)施例1中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽出10個(gè)微孔，測定9 μ g/m標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)CV，結(jié)果見表1。表1標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種檢測檸檬黃的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括檸檬黃抗原和檸檬黃的特異性抗體；所述特異性抗體為檸檬黃的多克隆抗體或單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包含下列成分(1)包被了檸檬黃抗原的酶標(biāo)板，(2)酶標(biāo)記檸檬黃抗體工作液，(3)檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品溶液，(4)底物顯色液，(5)反應(yīng)終止液，(6)濃縮洗滌液，(7)樣品稀釋液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板為96或40孔酶標(biāo)板，包被有能與檸檬黃抗體特異結(jié)合的檸檬黃抗原，并封閉微孔表面未吸附檸檬黃抗原的位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記檸檬黃抗體工作液是采用戊二醛法或過碘酸鹽氧化法將標(biāo)記酶與檸檬黃抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到，所述標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶；所述檸檬黃抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或基因工程抗體的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，所述底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲，四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶時(shí)，所述底物顯色液為底物液和底物緩沖液，底物液為對硝基磷酸鹽緩沖液，底物緩沖液為含有過氧化氫或氧化脲的pH = 5. 0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含0.5 1. 5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，ρΗ7· 4，濃度為0. lmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述樣品稀釋液為PH7.4 8. 0,0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品液的濃度分另1J為0 μ g/mL、l μ g/mL、3 μ g/mL、9 μ g/mL、27 μ g/mL、81 μ g/mL。
9.一種檢測樣品中的檸檬黃含量的方法，包括以下步驟1)用檸檬黃抗原包被酶標(biāo)板；2)加入檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品；3)加入酶標(biāo)記的檸檬黃特異性抗體，孵育，洗滌；4)加入底物顯色液顯色；5)加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)；6)通過比較檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的顏色，推測出待測樣品中的檸檬黃含量；或者，測定各孔的吸光度，建立檸檬黃濃度相對于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線由待測樣品的吸光度推算出待測樣品中的檸檬黃含量。
10.一種檢測樣品中的檸檬黃含量的方法，其特征在于包括以下步驟1)樣品前處理；2)使用如權(quán)利要求1-8所述的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測；3)結(jié)果處理與分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測檸檬黃的方法及酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測檸檬黃的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括檸檬黃半抗原和檸檬黃的特異性抗體；所述特異性抗體為所述檸檬黃的多克隆抗體或單克隆抗體。本試劑盒中采用高特異性的檸檬黃單克隆抗體，保證了檢測結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本試劑盒具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)；本試劑盒的主要試劑都采用工作液形式，使用方便，成本低廉。用本發(fā)明試劑盒檢測檸檬黃的方法，操作簡便，對樣品的前處理要求低，能同時(shí)快速檢測大批量樣品。因此，利用本發(fā)明酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測的方法，能夠進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣品的定性和定量篩查。
文檔編號G01N33/577GK102331500SQ20111003548
公開日2012年1月25日 申請日期2011年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月1日
發(fā)明者張波, 張霞, 徐德順, 易建, 王飛, 王鵬, 薛秋艷, 郗日沫 申請人:天津百鷗瑞達(dá)生物科技有限公司