專利名稱：Nat2基因擴(kuò)增用引物對、含有其的nat2基因擴(kuò)增用試劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增NAT2基因的引物對、含有其的NAT2基因擴(kuò)增用試劑及其用途。
背景技術(shù)：
N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(NATs)是與利用N-結(jié)合將芳香族胺或雜環(huán)胺的芳胺代謝成無毒且穩(wěn)定的物質(zhì)的代謝途徑有關(guān)的酶。其中，NATs亞型中的NAT2關(guān)系到異煙胼(INH)、磺胺二甲嘧啶、其它的磺胺類、普魯卡因胺、胼酞嗪、咖啡因、氨苯砜等同素環(huán)和雜環(huán)芳胺、胼樣藥物的解毒過程及2-氨基芴、4-氨基聯(lián)苯、聯(lián)苯胺、β -萘胺、蛋白質(zhì)的熱分解物質(zhì)中存在的雜環(huán)芳胺等表達(dá)性生理物質(zhì)、環(huán)境物質(zhì)等的活化。已知ΝΑΤ2顯示多態(tài)性，在人體中有 19種多態(tài)性。這些多態(tài)性中，ΝΑΤ2*5類(ΝΑΤ2*5Α 5D)為ΝΑΤ2基因的mRNA中的341位的T (胸腺嘧啶)突變成C (胞嘧啶)的多態(tài)性，NAT2*6類(NAT2*6A、NAT2*6B)為上述mRNA 中的590位的G(鳥嘌呤)突變成A (腺嘌呤)的多態(tài)性，NAT2*7類(NAT2*7A、NAT2*7B)為 mRNA中的857位的G (鳥嘌呤)突變成A (腺嘌呤)的多態(tài)性。已知具有這些突變的患者在服用作為抗拮抗劑的INH時(shí)，會發(fā)生肝功能損傷。其原因在于，由于NAT2基因突變，NAT2活性改變，由此無法充分地進(jìn)行INH的N-乙?；味拘愿叩碾莸漠a(chǎn)生增多。另外，還已知NAT2的基因多態(tài)性與上述普魯卡因胺或柳氮磺胺吡啶等的副作用有關(guān)。因此，確認(rèn)患者NAT2基因多態(tài)性在回避副作用、進(jìn)行適當(dāng)藥物治療時(shí)極為重要。特別是，對于NAT2而言，重要的是確認(rèn)多個(gè)多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)。另外，作為在基因水平解析所有疾病的原因、個(gè)體間的疾病易感性(易患疾病)、 個(gè)體間的藥效不同等的方法，廣泛地進(jìn)行點(diǎn)突變、所謂的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測。點(diǎn)突變的通常檢測方法可以舉出(1)對于試樣的目標(biāo)DNA利用PCR(聚合物酶鏈反應(yīng))將相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域擴(kuò)增、對其全基因序列進(jìn)行解析的直接測序法；(2)對于試樣的目標(biāo)DNA，利用PCR將相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域擴(kuò)增，通過隨著上述檢測對象序列中有無目標(biāo)突變而剪切作用不同的限制酶將該擴(kuò)增產(chǎn)物切斷，進(jìn)行電泳從而進(jìn)行分型的RFLP解析； (3)使用目標(biāo)突變位于3’末端區(qū)域的引物進(jìn)行PCR，通過有無擴(kuò)增來判斷突變的ASP-PCR 法等。但是，這些方法例如必須進(jìn)行由試樣提取的DNA的精制、電泳、限制酶處理等，因此需要功夫和成本。另外，進(jìn)行PCR后，有必要暫時(shí)開啟反應(yīng)容器，因此有上述擴(kuò)增產(chǎn)物混入到之后的反應(yīng)體系內(nèi)，解析精度降低的顧慮。而且，由于自動(dòng)化困難，因此無法解析大量的樣品。另外，對于上述(3)的A SP-PCR法，還存在特異性低的問題。
由該問題出發(fā)，近年來作為點(diǎn)突變的檢測方法，正在實(shí)施對由目標(biāo)核酸和探針形成的雙鏈核酸的融解溫度(Tm)進(jìn)行解析的方法。這種方法由于通過例如Tm解析或上述雙鏈的融解曲線的解析來進(jìn)行，因此稱作融解曲線解析。其為以下的方法。即，首先使用與含有檢測目標(biāo)的點(diǎn)突變的檢測對象序列互補(bǔ)的探針，使檢測試樣中的目標(biāo)單鏈DNA與上述探針形成雜交體(雙鏈DNA)。接著，對該雜交產(chǎn)物實(shí)施加熱處理，通過吸光度等信號的變動(dòng)來檢測伴隨溫度上升的雜交體的解離(融解)。然后，根據(jù)該檢測結(jié)果確定Tm值，從而判斷有無點(diǎn)突變。在雜交產(chǎn)物的同源性越高時(shí)Tm值越高、同源性越低時(shí)Tm值越低。因此，對于含有點(diǎn)突變的檢測對象序列和與其互補(bǔ)的探針的雜交產(chǎn)物，預(yù)先求得Tm值(評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值)， 再測定檢測試樣的目標(biāo)單鏈DNA和上述探針的Tm值(測定值)。上述測定值與評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值相同時(shí)，則可以判斷為匹配、即目標(biāo)DNA中存在點(diǎn)突變，測定值低于評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值時(shí)，則可以判斷為不匹配、即在目標(biāo)DNA上不存在點(diǎn)突變。而且，通過該方法還可以使基因解析自動(dòng)化。但是，對于這種利用Tm解析的檢測方法來說存在如下的問題在PCR中必需特異且高效地?cái)U(kuò)增含有檢測目標(biāo)位點(diǎn)的區(qū)域。特別是由于NAT存在多個(gè)同工酶、編碼它們的序列也極為相似，因此在PCR中，有NAT2以外的同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增的顧慮。另外，當(dāng)其它同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增的情況下，也成為例如在NAT2基因的特定多態(tài)性 (NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)的解析(非專利文獻(xiàn)1或非專利文獻(xiàn)幻中解析結(jié)果的可靠性降低的原因。而且，如此由于解析1個(gè)樣品也需要大量的勞力，因此還具有解析大量樣品方面并不實(shí)用的問題。非專利文獻(xiàn)1 =PMID :8102908Jpn J Hum Genet. 1993Jun ；38 (2) :163-8.非專利文獻(xiàn)2 =PMID :10507782Br J Cancer. 19990 ct ；81 (3) :537-41.

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供用于利用基因擴(kuò)增法特異擴(kuò)增NAT2基因的目標(biāo)區(qū)域的引物對。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的引物對，其特征在于，是用于利用基因擴(kuò)增法擴(kuò)增 NAT2基因的引物對，含有選自由下述引物對(1) (3)所組成的組中的至少一對引物對。引物對(1)含有包含下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對(Fl)與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向5’方向至第20 32個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述鳥嘌呤堿基(G)為3’末端，(Rl)與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第17 M個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第 1096位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端；引物對O)含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對
(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20 38個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端，(R2)下述寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’ 方向至第25 40個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1355位的鳥嘌呤堿基(G)互補(bǔ)的胞嘧啶堿基(C)為3’末端，以及與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’ 方向至第21 36個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端；引物對(3)含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對(F3)下述寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號1的堿基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基朝向 5’方向至第21 40個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基⑴為3’末端，以及與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’ 方向至第20 38個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端，(R3)與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21 36個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第 1614位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。另外，本發(fā)明的基因擴(kuò)增用試劑其特征在于，是用于利用基因擴(kuò)增法擴(kuò)增NAT2基因的試劑，其含有上述本發(fā)明的NAT2基因擴(kuò)增用引物對。本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法，其特征在于，其為利用基因擴(kuò)增法制造NAT2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，包含下述(I)工序(I)以試樣中的核酸作為模板，使用本發(fā)明的NAT2基因擴(kuò)增用引物對，在反應(yīng)液中擴(kuò)增上述NAT2基因的工序。本發(fā)明的多態(tài)性解析方法，其特征在于，其為解析NAT2中3個(gè)檢測對象位點(diǎn)的多態(tài)性的方法，包括下述(i) (iv)工序(i)利用本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法，在反應(yīng)液中擴(kuò)增NAT2基因中的含有檢測對象位點(diǎn)的區(qū)域的工序，(ii)準(zhǔn)備含有上述(i)工序的擴(kuò)增產(chǎn)物和能夠與上述檢測對象位點(diǎn)雜交的探針的反應(yīng)液的工序，(iii)改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴(kuò)增產(chǎn)物與上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的工序，
(iv)由伴隨溫度變化的上述信號值的變動(dòng)，確定上述檢測對象位點(diǎn)的多態(tài)性的工序。利用本發(fā)明的引物對，可以在反應(yīng)液中特異且高效地?cái)U(kuò)增NAT2基因中的、含有檢測目標(biāo)多態(tài)性(NAT2*5或NAT2*6、NAT2*7)發(fā)生位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域。因此，與上述的現(xiàn)有方法不同，可以減少功夫和成本。另外，由于如此特異地?cái)U(kuò)增NAT2基因的含有特定多態(tài)性發(fā)生的檢測對象位點(diǎn)的區(qū)域，因此通過進(jìn)一步使用與檢測對象序列互補(bǔ)的探針，可以使用上述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm解析，將上述多態(tài)性分型。另外，由于可以在一個(gè)反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增、分型，因此還能夠?qū)崿F(xiàn)操作的自動(dòng)化。而且，當(dāng)使用本發(fā)明的引物對時(shí)，例如即便是含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等)，由于可以省略預(yù)處理，因此可以更為迅速且簡單地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。另外，當(dāng)使用本發(fā)明的引物對時(shí)，由于以優(yōu)于以往的擴(kuò)增效率進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此還能夠縮短擴(kuò)增反應(yīng)。因而，利用本發(fā)明的引物對、含有其的試劑、以及使用它們的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法和多態(tài)性解析方法，由于可以迅速且簡單地解析NAT2基因的多態(tài)性，因此在醫(yī)療領(lǐng)域中極為有效。


圖1為表示本發(fā)明實(shí)施例1的Tm解析結(jié)果的圖表。圖2為表示本發(fā)明實(shí)施例2的Tm解析結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式<NAT2基因擴(kuò)增用引物對>本發(fā)明的NAT2基因擴(kuò)增用引物對如上所述，其特征在于，含有選自由上述引物對
(1) C3)所組成的組中的至少一對引物對。通過含有至少任一對引物對，例如可以特異地?cái)U(kuò)增NAT2基因中的特定目標(biāo)區(qū)域。本發(fā)明的NAT2基因擴(kuò)增用引物對例如可以僅含有上述引物對⑴ (3)中的任一種，還可以含有任兩種或者含有引物對⑴ (3)的全部。在后敘述，利用引物對⑴能夠特異擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域?yàn)樵贜AT2基因中含有多態(tài)性NAT2*5發(fā)生位點(diǎn)的區(qū)域，利用引物對
(2)能夠特異擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域?yàn)樵贜AT2基因中含有多態(tài)性NAT2*6發(fā)生位點(diǎn)的區(qū)域，利用引物對(3)能夠特異擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域?yàn)樵贜AT2區(qū)域中含有多態(tài)性NAT2*7發(fā)生位點(diǎn)的區(qū)域。如上所述，已知NAT2基因的這3種多態(tài)性全部為對藥物代謝具有影響的多態(tài)性， 因此重要的是不僅對任1種進(jìn)行研究，還要對任2種或者3種全部進(jìn)行研究。但是，以往方法具有無法在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)解析多個(gè)序列的問題。這是由于如上所述NAT存在多個(gè)同工酶，因此在PCR中，連NAT2以外的同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增。因而，為了研究NAT2基因的3種多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7)中的2種或3種全部多態(tài)性，有必要在各反應(yīng)體系中分別擴(kuò)增含有各個(gè)多態(tài)性發(fā)生位點(diǎn)的區(qū)域，對所得擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行解析。如此，以往的方法難以做到僅將NAT基因中的NAT2基因作為模板、且在NAT2基因中僅特異地?cái)U(kuò)增分別含有上述多態(tài)性發(fā)生位點(diǎn)的2種或3種目標(biāo)區(qū)域。而且，由于解析1個(gè)樣品也需要大量勞力，因此具有解析大量樣品并不實(shí)用的問題。與此相反，通過本發(fā)明的NAT2基因擴(kuò)增用引物對，在含有上述引物對(1) (3)中的任2種或3種全部時(shí)，可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)且特異地?cái)U(kuò)增各個(gè)目標(biāo)區(qū)域。因此，與上述以往方法不同，可以減少功夫和成本。另外，由于在同一反應(yīng)液中特異地?cái)U(kuò)增2個(gè)或3個(gè)目標(biāo)區(qū)域，因此例如通過使用與各個(gè)目標(biāo)區(qū)域的檢測對象序列互補(bǔ)的探針，可以使用上述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm解析，分別對上述2種或3種多態(tài)性進(jìn)行分型。如此，由于可以在同一反應(yīng)液中解析NAT2基因中的2種或3種多態(tài)性， 因此本發(fā)明的NAT2基因擴(kuò)增用引物對例如在含有引物對(1) (3)任一種時(shí)當(dāng)然優(yōu)選，在含有任2種或3種時(shí)也優(yōu)選。使用這種NAT2基因擴(kuò)增用引物對，擴(kuò)增1個(gè)目標(biāo)區(qū)域當(dāng)然是可以的，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增2個(gè)或3個(gè)目標(biāo)區(qū)域時(shí)，也可以較以往更為高效地進(jìn)行NAT2基因的多態(tài)性解析。予以說明，以下有時(shí)將正向引物稱作F引物、將反向引物稱作R引物。上述引物對(1)如上所述，為含有包含下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對。(Fl)與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向5’方向至第20 32個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述鳥嘌呤堿基(G)為3’末端，(Rl)與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第17 M個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第 1096位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端。序列號1所示的堿基序列是人來源的芳胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶NAT等位基因1-2基 13 (Human h NAT allele l~2gene forarylamine N-acetyltransferase) StJ DNA !ψβ], M 如NCBI登錄號No. D10870所登錄的基因。上述引物對(1)為用于擴(kuò)增序列號1中的、含有第1039 第1095區(qū)域的DNA鏈及其互補(bǔ)鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)的第1063位堿基(序列號1的第1063位堿基)存在對NAT2的功能具有影響的點(diǎn)突變(1063T、1063C)，該多態(tài)性為上述NAT2*5。本發(fā)明中，該位點(diǎn)的多態(tài)性在為純合子時(shí)用1063T/T、1063C/C表示，在為雜合子時(shí)用1063T/C表示。予以說明，序列號1中的第1063位堿基相當(dāng)于NAT2基因的mRNA的第341位堿基，因此NAT2*5 的多態(tài)性還可以表示為;341T/T、341C/C、341T/C。以下，將該引物對(1)稱作“NAT2*5用引物對”。予以說明，在僅解析NAT2*5的多態(tài)性時(shí)，可以僅使用NAT2*5用引物對。弓丨物對(1)的Fl引物和Rl引物，只要是起到?jīng)Q定DNA聚合酶擴(kuò)增的起始點(diǎn)的作用的3’末端堿基滿足上述條件即可。如此，通過固定各引物的3’末端的堿基，可以充分地防止引物對(1)例如結(jié)合在類似的其它同工酶基因(例如NATl、NAT6、NAT8、NAT9基因等) 上。這樣，F(xiàn)l引物和Rl引物由于只要其3’末端的堿基被固定即可，因此各引物的長度本身并無特別限定，可以適當(dāng)調(diào)整至普通的長度。作為引物長度的一例，例如為13 50mer 的范圍、優(yōu)選為14 45mer、更優(yōu)選為15 40mer。作為具體例，上述Fl引物優(yōu)選為如下 與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向5’方向至第 20 32個(gè)堿基(優(yōu)選第M 30個(gè)堿基、更優(yōu)選第25 四個(gè)堿基)的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸。另外，上述Rl引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第17 M個(gè)堿基(優(yōu)選第19 23個(gè)堿基、更優(yōu)選第20 22個(gè)堿基)的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸。予以說明，由于Fl引物和Rl引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的區(qū)域例如如上所述為序列號1的第1039 第1095的區(qū)域，所得擴(kuò)增產(chǎn)物的整個(gè)長度隨所用引物的長度而改變。另外，Rl引物可以是與序列號1所示的堿基序列并非完全互補(bǔ)的寡核苷酸、Fl引物可以是與上述堿基序列的互補(bǔ)鏈并非完全互補(bǔ)的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端堿基以外的部分中，可以與完全互補(bǔ)的寡核苷酸有1個(gè) 5個(gè)堿基不同。以下舉出Fl引物和Rl引物的具體例子，本發(fā)明并非限于此。另外，這些Fl弓丨物和Rl引物的組合并無任何限定，這些中，特別優(yōu)選含有包含序列號5或序列號7的寡核苷酸的F1’引物和包含序列號16或序列號18的寡核苷酸的R1’引物的引物對(1’)。予以說明，下述表的“Tm(°C)”是下述表的序列和與其完全互補(bǔ)的序列雜交時(shí)的Tm(°C)，通過MELTCALC軟件(http://WWW. meltcalc. com)、將參數(shù)設(shè)為寡核苷酸濃度0. 2 μ M、鈉當(dāng)量 (Na eq.)50mM而計(jì)算的數(shù)值(以下相同)。上述Tm值例如可通過現(xiàn)有公知的MELTCALC 軟件(http://www.meltcalc.com)等計(jì)算，另外，還可以通過鄰接法(Nearest Neighbor Method)確定(以下相同)。表 1
引物序歹丨.Tm(0C)序列號F1引物 NAT2*5用5'-ccctccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'6425'-cctccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'62.735'-ctccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'61.445'-tccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'60.955'-ccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'60.165'-cagttaacaaatacagcactggcatgg-3'58.675'-agttaacaaatacagcactggcatgg-3'57.785'-gttaacaaatacagcactggcatgg-3'56.8g5'-ttaacaaatacagcactggcatgg-3'55.8105'-taacaaatacagcactggcatgg-3'55.3115'-aacaaatacagcactggcatgg-3'55.6125'-acaaatacagcactggcatgg-3'55.2135'-caaatacagcactggcatgff-3'53.614R1引物 NAT2*5用5'-gccacatctgggaggagcttccag-3'62.5155'-ccacatctgggaggagcttccag-3'60.1165 '-cacatctgggaggagcttccag-3'58.2175'-acatctgggaggagcttccag-3'57.1185'-catctgggaggagcttccag-3'55.6195'-atctgggaggagcttccag-3'54.2205'-totgggaggagcttccag-3'53.8215·—ctgggaggagcttccag-3'52.222接著，上述引物對( 如上所述，為含有包含下述(F》的寡核苷酸的正向引物和包含下述(似)的寡核苷酸的反相引物的一對引物對。(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20 38個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端，(R2)下述寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’ 方向至第25 40個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1355位的鳥嘌呤堿基(G)互補(bǔ)的胞嘧啶堿基(C)為3’末端，以及與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’ 方向至第21 36個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。上述引物對⑵為用于擴(kuò)增序列號1中的、含有第1279 第13M區(qū)域或第 1279 第1613區(qū)域的DNA鏈及其互補(bǔ)鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)的第1312位堿基(序列號1的第1312位堿基)存在對NAT2的功能具有影響的點(diǎn)突變(1312G、1312A)，該多態(tài)性為上述NAT2*6。本發(fā)明中，該位點(diǎn)的多態(tài)性在為純合子時(shí)可用1312G/G、1312A/A表示，在為雜合子時(shí)可用1312G/A表示。予以說明，序列號1中的第1312位堿基相當(dāng)于NAT2基因的 mRNA中的第590位堿基，因此NAT2*6的多態(tài)性，例如還可以表示為590G/G、590A/A、590G/ Α。以下，將該引物對(2)稱作“NAT2*6用引物對”。予以說明，在僅解析NAT2*6的多態(tài)性時(shí)，可以僅使用NAT2*6用引物對。本發(fā)明中，從與上述引物對(1)相同的理由出發(fā)，引物對O)的F2引物和R2引物只要是起到?jīng)Q定DNA聚合酶的擴(kuò)增起始點(diǎn)的作用的3’末端的堿基滿足上述條件即可。因此，F(xiàn)2引物和R2引物的長度本身并無特別限定，可以舉出與上述同樣的長度。作為具體例， 上述F2引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第 1堿基朝向5’方向至第20 38個(gè)堿基(優(yōu)選第21 38個(gè)堿基、更優(yōu)選第22 38個(gè)堿基)的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸。另外，上述(R2)引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第25 40個(gè)堿基(優(yōu)選第27 35個(gè)堿基、更優(yōu)選第觀 34個(gè)堿基)的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸或者與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’ 方向至第21 36個(gè)堿基(優(yōu)選第23 36個(gè)堿基、更優(yōu)選第M 36個(gè)堿基)的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸。予以說明，由于F2引物和R2引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的區(qū)域通常為序列號1的第1279 第13M區(qū)域或第1279 第1613區(qū)域，所得擴(kuò)增產(chǎn)物的整個(gè)長度隨所用引物的長度改變。另外，R2引物可以是與序列號1所示的堿基序列并非完全互補(bǔ)的寡核苷酸、F2引物可以是與上述堿基序列的互補(bǔ)鏈并非完全互補(bǔ)的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端的堿基外的部分，可以與完全互補(bǔ)的寡核苷酸有1個(gè) 5個(gè)堿基不同。以下舉出F2引物和R2引物的具體例子，本發(fā)明并非限于此。另外，這些F2弓丨物和R2引物的組合并無任何限定，這些中，特別優(yōu)選含有包含序列號33或序列號109的寡核苷酸的F2’引物和包含序列號39或序列號48的寡核苷酸的R2’引物的引物對(2’ )。表 權(quán)利要求
1.一種探針，其特征在于，其為用于檢測NAT2基因的多態(tài)性的探針， 其由下述(1)的寡核苷酸構(gòu)成，(1)與序列號1中的、以第1056位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第 13 19個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述鳥嘌呤堿基(G)互補(bǔ)的胞嘧啶堿基為3’末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，所述寡核苷酸(1)為序列號87 92和116 123中任一個(gè)寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，所述寡核苷酸(1)為選自由序列號90的寡核苷酸、序列號91的寡核苷酸、序列號118的寡核苷酸以及序列號122的寡核苷酸組成組中的至少一個(gè)寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，所述探針為熒光標(biāo)記探針。
5.一種試劑，其特征在于，其為用于檢測NAT2基因的多態(tài)性的試劑，其含有權(quán)利要求1 所述的探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其還包含由下述(2)的寡核苷酸構(gòu)成的探針和由下述 (3)的寡核苷酸構(gòu)成的探針，(2)與序列號1中的、以第1302位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第 18 27個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基為5’ 末端，(3)與序列號1中的、以第1583位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第 16 21個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基為3’ 末端。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的探針，所述( 的寡核苷酸為序列號93 102中任一個(gè)寡核苷酸，所述(3)的寡核苷酸為序列號103 108中任一個(gè)寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的探針，所述(2)的寡核苷酸為由序列號99的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；所述⑶的寡核苷酸為選自由序列號105的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸、以及由序列號107的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸中的至少一個(gè)寡核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，所述探針為熒光標(biāo)記探針。
10.一種多態(tài)性解析方法，其特征在于，其為解析NAT2基因的檢測對象位點(diǎn)的多態(tài)性的方法，包括下述(i) (iv)工序(i)以試樣中的核酸為模板，在反應(yīng)液中擴(kuò)增NAT2基因中含有檢測對象位點(diǎn)的區(qū)域的工序，( )準(zhǔn)備含有上述(i)工序的擴(kuò)增產(chǎn)物和權(quán)利要求1所述的探針的反應(yīng)液的工序，(iii)改變所述反應(yīng)液的溫度，測定所述擴(kuò)增產(chǎn)物與所述試劑中的探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的工序，(iv)由伴隨溫度變化的所述信號值的變動(dòng)，確定所述檢測對象位點(diǎn)的多態(tài)性的工序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多態(tài)性解析方法，其中，在所述(i)工序中，在擴(kuò)增反應(yīng)之前，向所述反應(yīng)液中添加權(quán)利要求1所述的探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多態(tài)性解析方法，所述試樣為生物體試樣。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性解析方法，所述生物體試樣為全血。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多態(tài)性解析方法，在所述(i)工序中，使用下述引物對 (1)，在反應(yīng)液中進(jìn)行所述NAT2的擴(kuò)增，引物對⑴含有包含下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對(Fl)與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向 5’方向至第20 32個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述鳥嘌呤堿基(G)為3’末端，(Rl)與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向 3’方向至第17 M個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1096 位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多態(tài)性解析方法，在所述(ii)工序中，所述反應(yīng)液還含有由下述( 的寡核苷酸構(gòu)成的探針，在所述(i) 工序中，還使用下述引物對0)，在反應(yīng)液中進(jìn)行所述NAT2的擴(kuò)增，(2)與序列號1中的、以第1302位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第 18 27個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基為5’ 末端，引物對⑵含有包含下述(^)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(似)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向 5’方向至第20 38個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端，(R2):下述寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第25 40個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1355位的鳥嘌呤堿基(G)互補(bǔ)的胞嘧啶堿基(C)為3’末端，以及與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21 36個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多態(tài)性解析方法，在所述(ii)工序中，所述反應(yīng)液還含有由下述C3)的寡核苷酸構(gòu)成的探針，在所述(i) 工序中，還使用下述引物對(3)，在反應(yīng)液中進(jìn)行所述NAT2的擴(kuò)增，(3)與序列號1中的、以第1583位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第 16 21個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基為3’ 末端，引物對⑶含有包含下述(F!3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述0 )的寡核苷酸的反向引物的一對引物對(F3):下述寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號1的堿基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基朝向5’ 方向至第21 40個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基⑴為3’末端，以及與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20 38個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3，末端，(R3)與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向 3’方向至第21 36個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614 位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
全文摘要
本發(fā)明提供一種引物對，其為用于利用基因擴(kuò)增法擴(kuò)增NAT2基因中的含有檢測目標(biāo)位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域的引物對，其能夠特異地?cái)U(kuò)增上述區(qū)域。使用分別包含含有序列號7、序列號33和序列號60的堿基序列的正向引物和包含序列號18、序列號48和序列號81的堿基序列的反向引物的3對引物對。通過使用該引物對，可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)擴(kuò)增NAT2基因的分別含有3種多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)發(fā)生位點(diǎn)的3個(gè)區(qū)域。
文檔編號G01N21/64GK102154274SQ20111003464
公開日2011年8月17日 申請日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者平井光春, 間島智史 申請人:愛科來株式會社