專利名稱：一種測定甘草及其炮制品中7種成分含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥成分含量的測定方法，特別是涉及一種應(yīng)用高效液相色譜法同時(shí)測定甘草及其炮制品中7種成分含量的方法。甘草為豆科植物甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflate Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根及根莖。收載于中國藥典 2010年版(一部)，味甘，平；歸心、肺、脾、胃經(jīng)。具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功效。主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、陜西、東北、山西等地區(qū)。主要有效成分為皂苷類和黃酮類化合物。甘草黃酮類的代表成分主要有甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素等；皂苷類的主要代表成分為甘草酸。現(xiàn)代研究表明，甘草酸可用于皮質(zhì)激素的替代治療并能防治肝炎，對慢性肝炎的肝細(xì)胞亦有良好的保護(hù)作用； 甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷等為代表的甘草總黃酮類，具有抗心肌缺血以及抑制艾滋病病毒增殖的作用；異甘草苷具有抗?jié)冏饔?；甘草素、異甘草素具有顯著的抗?jié)兒徒獐d作用；異甘草素還具有雌性激素樣作用，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。2010版藥典僅同時(shí)測定了甘草酸、甘草苷兩種成分的含量，采用HPLC法固定波長進(jìn)行了含量測定。評價(jià)指標(biāo)較少，對藥材質(zhì)量的評價(jià)不夠全面；且使用同一波長檢測，系統(tǒng)檢測靈敏度有一定局限性。因此，需要建立一種選取每種待測指標(biāo)最大吸收波長，同時(shí)測定多指標(biāo)的含量測定方法。采用本方法一波長切換高效液相色譜法建立了同時(shí)測定甘草藥材中7種成分含量的分析方法，以更好地控制甘草質(zhì)量。該方法利用C18色譜柱，選取合適的流動相系統(tǒng)，利用波長切換技術(shù)，用梯度洗脫的方式使7種成分達(dá)到了很好的分離。經(jīng)過線性關(guān)系、精密度、 準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為更好地控制甘草藥材及其炮制品的質(zhì)量提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種全面、準(zhǔn)確、簡便的甘草成分含量測定方法。該測定方法選擇了甘草及其炮制品中7種成分作為含量測定指標(biāo)，評價(jià)信息更加全面。利用HPLC法進(jìn)行梯度洗脫，特別加入了波長切換技術(shù)，該技術(shù)選用每種待測指標(biāo)的最大吸收波長進(jìn)行檢測，保證儀器在測定每種物質(zhì)時(shí)的檢測靈敏度達(dá)到最大，使得測定結(jié)果更加準(zhǔn)確、簡便、快速。采用的技術(shù)方案是
一種測定甘草及其炮制品中7種成分含量的方法，其特征在于采用波長切換和梯度洗脫同時(shí)測定7種成分含量，包括下述工藝步驟
1、供試品溶液的制備取不同來源及不同炮制品甘草藥材粉末，過60目篩，約0.3 Ig,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定濃度的乙醇50 100ml，密塞，稱定重量，超聲處理20 50min，放冷，再稱定重量，用相同濃度的乙醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；
2、混合對照品溶液的配制精密稱取芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素對照品適量，分別加甲醇溶解，制成濃度分別為0. 3 2. Omg-mL-1 的對照品儲備液，備用。分別精密量取一定體積上述對照品儲備液溶液，加甲醇稀釋，制成每Iml含芹糖甘草苷20 30μβ、甘草苷30 50μβ、芹糖異甘草苷20 30μβ、異甘草苷1 10Pg、甘草素1 lOPg、甘草酸100 200μβ、異甘草素1 的混合溶液，即得。3、甘草及其炮制品中7種成分含量的測定取步驟1制備的供試品溶液和混合對照品溶液各一份，上色譜柱，進(jìn)樣測定并計(jì)算樣品中7種成分的含量。色譜柱采用Cw柱， 流動相為乙腈與一定濃度磷酸水混合液；梯度洗脫采用七次洗脫，第一梯度洗脫采用乙腈 磷酸水為15% :85%的洗脫液；第二次梯度洗脫采用乙腈磷酸水為25% :75%的洗脫液；第三梯度洗脫采用乙腈磷酸水為32% 68%的洗脫液；第四梯度洗脫采用乙腈磷酸水為34% 66%的洗脫液；第五梯度洗脫采用乙腈磷酸水為36% 64%的洗脫液；第六梯度洗脫采用乙腈磷酸水為42% 58%的洗脫液；第七梯度洗脫采用乙腈磷酸水為51% 49%的洗脫液；檢測波長選擇第一梯度洗脫階段檢測波長為276nm，第二梯度洗脫階段檢測波長為360 nm, 第三梯度洗脫階段檢測波長為276 nm，第四梯度洗脫階段檢測波長為對8 nm，第五梯度洗脫階段檢測波長為370 nm，第六梯度洗脫階段檢測波長為254 nm，第七梯度洗脫階段檢測波長為370 nm，流速為0. 5—2. OmL/min ；柱溫20—30°C ；在上述色譜和梯度洗脫條件下能精確測得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸和異甘草素含量， 理論塔板數(shù)以甘草酸計(jì)不低于3000，分離度> 1. 5 ；上述百分比為體積百分比。線性關(guān)系的考察分別精密量取上述混合對照品溶液2、5、10、15、20μ 注入高效液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。精密度考察取甘草藥材樣品粉末0.5 l.Og，精密稱定。按供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素的RSD值均應(yīng)小于1。重復(fù)性考察取甘草藥材樣品6份，每份粉末0.5 l.Og，精密稱定。按供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素的RSD值均應(yīng)小于m。穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液，在室溫下放置，在Mh內(nèi)，分別取不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析，測定峰面積。芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素峰面積的RSD均應(yīng)小于m。加樣回收率考察稱取已知含量的甘草藥材6份，每份約0. 3 0. 5g，精密稱定。 分別準(zhǔn)確加入芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素對照品儲備液 2. 0 3. 0ml,3. 0 4. OmUO. 4 0. 5ml、1. 7 2. OmUO. 4 0. 8ml,5. 0 6. Oml.O. 2 0. 3mL·按供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算回收率均應(yīng)大于95%，RSD均應(yīng)小于3. 0%。在流動相系統(tǒng)的選擇方面，本方法分別考查了乙腈-水、乙腈-不同濃度的磷酸水、甲醇-水等不同流動相系統(tǒng)，從中篩選出色譜基線平穩(wěn)，7種成分的分離效果好的流動相系統(tǒng)。在檢測波長的選擇方面，由于7種成分結(jié)構(gòu)不同，本方法利用可變波長紫外檢測器波長切換的功能，選擇各成分最大吸收波長為檢測波長。結(jié)合7種成分的出峰順序，依次為芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素，他們的最大吸收波長分別為276nm、276nm、360nm、360nm、276nm、254nm、370nm。最終達(dá)到了檢測靈敏度高， 干擾小的目的。 本發(fā)明測定結(jié)果準(zhǔn)確、簡便、快速，甘草及其炮制品有效成分含量評價(jià)信息更加全面，完善了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1. 一種測定甘草及其炮制品中7種成分含量的方法，其特征在于采用波長切換和梯度洗脫技術(shù)，同時(shí)測定7種成分含量，包括下述工藝步驟(1)、供試品溶液的制備取不同來源及不同炮制品甘草藥材粉末，過60目篩，0.3 Ig,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定濃度的乙醇50 100ml，密塞，稱定重量，超聲處理20 50min，放冷，再稱定重量，用相同濃度的乙醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；(2)、甘草及其泡制品中7種成分含量的測定取步驟1制備的供試品溶液，上色譜柱，進(jìn)樣測定樣品中7種成分的含量；色譜柱采用C18柱，流動相為乙腈與一定濃度磷酸水混合液；梯度洗脫采用七次洗脫，第一梯度洗脫采用乙腈磷酸水為15% 85%的洗脫液；第二次梯度洗脫采用乙腈磷酸水為25% 75%的洗脫液；第三梯度洗脫采用乙腈磷酸水為 32% 68%的洗脫液；第四梯度洗脫采用乙腈磷酸水為34% 66%的洗脫液；第五梯度洗脫采用乙腈磷酸水為36% 64%的洗脫液；第六梯度洗脫采用乙腈磷酸水為似％ 58%的洗脫液；第七梯度洗脫采用乙腈磷酸水為51% 49%的洗脫液；檢測波長選擇第一梯度洗脫階段檢測波長為276nm，第二梯度洗脫階段檢測波長為360 nm,第三梯度洗脫階段檢測波長為 276 nm，第四梯度洗脫階段檢測波長為對8 nm，第五梯度洗脫階段檢測波長為370 nm，第六梯度洗脫階段檢測波長為254 nm，第七梯度洗脫階段檢測波長為370 nm，流速為0.5— 2. OmL/min ；柱溫20—30°C ；在上述色譜和梯度洗脫條件下能精確測得芹糖甘草苷、甘草苷、 芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸和異甘草素含量，理論塔板數(shù)以甘草酸計(jì)不低于 3000，分離度> 1.5 ；上述百分比為體積百分比。
全文摘要
一種測定甘草及炮制品中7種成分含量的方法，是取炮制品甘草粉末過60目篩，約0.3-1g，加乙醇50-100ml，超聲處理20-50min，放冷后同70%乙醇補(bǔ)失量后，上C18色普柱，并進(jìn)行七次梯度洗脫，洗脫液為乙腈與磷酸水混合液，7次洗脫液乙腈與磷酸水配比分別為15%85%、25%75%、32%68%、34%66%、36%64%、42%56%、51%49%，對應(yīng)7次洗脫的波長選擇為276nm、360nm、276nm、248nm、370nm、254nm和370nm，流速為0.5-2.0ml/mis，柱溫20-30℃。能測得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸和異甘草素含量，塔板數(shù)以甘草酸計(jì)不低于3000，分離度＞1.5。
文檔編號G01N30/74GK102297917SQ201110027139
公開日2011年12月28日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者于天禹, 周萃, 夏林波, 張振秋, 張鵬, 徐晶, 才謙, 李可強(qiáng), 李峰, 楊燕云, 訾慧 申請人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)