專利名稱：用于抗原提取過(guò)程的方法和裝置的制作方法
用于抗原提取過(guò)程的方法和裝置背景診斷細(xì)胞成像使用多種方法，通過(guò)這些方法，可使細(xì)胞或組織產(chǎn)生的分子特異定位到那些細(xì)胞或組織。這給研究者提供那些所給分子的產(chǎn)生或活性的部位方面的信息。對(duì)于常規(guī)病理學(xué)中蛋白的特異定位，常規(guī)利用稱為免疫組織化學(xué)(IHC)的程序。在IHC中，將用于特異抗原的抗體施加到識(shí)別已知特異分子的固定組織樣品作為第一步驟。然后用已與酶(如辣根過(guò)氧化物酶)化學(xué)偶合的第二抗體檢測(cè)此抗體。在用顯色底物(如二氨基聯(lián)苯胺(DAB))培養(yǎng)后，在已于關(guān)注蛋白的特異部位結(jié)合到第一抗體的第二抗體部位產(chǎn)生有色沉積。此程序目前用于臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中超過(guò)200種抗體，在研究環(huán)境中多更多。組織處理的性質(zhì)需要樣品在嵌入石蠟和在切片機(jī)上微切片之前“固定”，以產(chǎn)生適用于免疫染色的組織切片。在此過(guò)程期間，用產(chǎn)生保持組織細(xì)胞特征的化學(xué)交聯(lián)的甲醛處理保存蛋白。甲醛主要通過(guò)使蛋白中的伯胺基與蛋白或DNA中的其它鄰近氮原子通過(guò)-CH2-鍵交聯(lián)而保存或固定組織或細(xì)胞。然而，組織固定的過(guò)程經(jīng)常掩蓋對(duì)診斷和預(yù)測(cè)目的所期望檢測(cè)的特異蛋白上的抗原。為了檢測(cè)單個(gè)靶分子，一般使程序最佳化，并且在需要時(shí)，為了檢測(cè)另外的靶分子，以不同方式處理連續(xù)切片。隨著檢測(cè)單一樣品中多種抗原的能力的提高，需要與檢測(cè)多種蛋白相容的一致的組織處理。簡(jiǎn)述第一方面，本發(fā)明提供甲醛固定的組織樣品的抗原提取的方法，所述方法包括以下步驟在大于90°C的溫度在第一抗原提取溶液中培養(yǎng)甲醛固定的組織樣品，將組織樣品轉(zhuǎn)移到第二抗原提取溶液，并在大于90°C的溫度在第二抗原提取溶液中培養(yǎng)組織樣品。第二方面，本發(fā)明提供用于提取甲醛固定的組織樣品中的抗原的試劑盒，所述試劑盒包含提取樣品中至少一部分未提取抗原的第一抗原提取溶液，和提取樣品中至少一些另一部分未提取抗原的第二抗原提取溶液。第三方面，本發(fā)明提供用于進(jìn)行抗原提取方法的樣品處理裝置，所述樣品處理裝置包含樣品處理子系統(tǒng)、試劑分配子系統(tǒng)和信號(hào)檢測(cè)子系統(tǒng)。附圖當(dāng)參考附圖閱讀以下詳細(xì)描述時(shí)，本發(fā)明的這些和其他特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將變得更好理解，其中在全部附圖中相同的符號(hào)代表相同的部件

圖1為用于使甲醛固定的組織樣品與抗原提取溶液接觸的代表性樣品處理裝置。圖2為顯示與一步程序比較用二步程序的增強(qiáng)染色的單色顯微相片(在20X或 63X放大倍數(shù))。圖3顯示單色顯微相片(在20X放大倍數(shù))，其顯示在BrCA腫瘤的多元分析FISH 中用二步程序的增強(qiáng)染色。圖4為人工二步抗原提取方法與自動(dòng)方法比較的定量分析結(jié)果的條形圖。圖5顯示在通過(guò)人工二步抗原提取方法或兩種自動(dòng)抗原提取方法之一制備的樣品上對(duì)抗原-S6染色的漂白作用的單色顯微相片(在20X放大倍數(shù))。詳述
為了更清楚和簡(jiǎn)要地描述和指出要求保護(hù)的本發(fā)明的主題，對(duì)在以下說(shuō)明及其所附權(quán)利要求中使用的具體術(shù)語(yǔ)提供以下定義。定義“抗體”是指特異結(jié)合到另一個(gè)分子的特定空間和極性組織從而定義為與所述特定空間和極性組織互補(bǔ)的免疫球蛋白。抗體可以為單克隆或多克隆，并且可通過(guò)在本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備，例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或者通過(guò)制備連續(xù)雜交細(xì)胞系，并收集分泌的蛋白(單克隆)，或者通過(guò)克隆和表達(dá)核苷酸序列或其誘變處理的變種， 至少對(duì)天然抗體的特異結(jié)合所需的氨基酸序列編碼?？贵w可包括完全免疫球蛋白或其片段，這些免疫球蛋白包括不同種類和同種型，如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a, IgG2b和IgG3、 IgM0功能抗體片段可包括能夠保持以相似親合力結(jié)合到全長(zhǎng)抗體的抗體部分(例如，F(xiàn)ab、 Fv和F(ab' )2或？油')。另外，在適當(dāng)時(shí)，可使用免疫球蛋白或其片段的聚集體、聚合物和綴合物，只要實(shí)質(zhì)保持對(duì)特定分子的結(jié)合親合力?！翱乖笔侵缚山Y(jié)合抗體或抗體片段的物質(zhì)?？乖梢詾閮?nèi)源性，由此使它們由于正常或異常細(xì)胞代謝或由于病毒或胞內(nèi)細(xì)菌感染在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。內(nèi)源性抗原包括異種(異源)、自體和個(gè)體基因型或同種(同源)抗原。抗原也可以為腫瘤特異抗原或由腫瘤細(xì)胞展現(xiàn)。在此情況下，將它們稱為腫瘤特異抗原(TSA)，一般產(chǎn)生于腫瘤特異突變。抗原也可以為由腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞展現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。抗原也包括CD抗原，CD抗原是指由白細(xì)胞表達(dá)的任何一些細(xì)胞-表面標(biāo)記，并且可用于區(qū)分細(xì)胞譜系或發(fā)育階段。這些標(biāo)記可通過(guò)特異單克隆抗體識(shí)別，并且通過(guò)它們的分化簇編號(hào)?！癋ISH”和“CISH”分別指熒光原位雜交和顯色原位雜交。FISH是用于檢測(cè)和定位在染色體上是否存在特異DNA序列或在轉(zhuǎn)錄部位和在細(xì)胞其它部分中是否存在RNA序列的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。FISH使用只結(jié)合到部分染色體的熒光探針，用那些部分它們顯示高度序列相似性。CISH允許在福爾馬林固定的石蠟嵌入(FFPE)組織上在亮視野顯微鏡下用常規(guī)酶促反應(yīng)檢測(cè)基因擴(kuò)增、染色體易位和染色體數(shù)?！懊庖呷旧笔侵笝z測(cè)樣品中特異蛋白的基于抗體的方法。免疫染色包括免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色兩者。免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)染色是指使用靶向細(xì)胞上的抗原的抗體的技術(shù)?？蛇M(jìn)行此染色，以確定存在某些疾病，例如癌癥的類型。免疫組織化學(xué) (IHC)染色是指通過(guò)使用標(biāo)記的抗體作為特異試劑通過(guò)抗原-抗體相互作用使組織切片中的抗原染色和定位，所述相互作用通過(guò)標(biāo)記可視化，所述標(biāo)記比如熒光團(tuán)、反應(yīng)的酶底物、 放射性元素或膠體金?！疤结槨笔侵妇哂薪Y(jié)合劑和標(biāo)記(如信號(hào)發(fā)生劑或酶)的劑。在一些實(shí)施方案中， 結(jié)合劑和標(biāo)記(信號(hào)發(fā)生劑或酶)在單一實(shí)體中具體化。本文所用的“結(jié)合劑”是指能夠與另一個(gè)分子(如結(jié)合到抗體的抗原)反應(yīng)或締合的分子。結(jié)合劑和標(biāo)記可直接(例如，通過(guò)結(jié)合到結(jié)合劑的熒光分子)或間接(例如，通過(guò)連接劑，可包括分裂部位)結(jié)合，并在單一步驟施加到組織樣品。在供選的實(shí)施方案中，結(jié)合劑和標(biāo)記在離散的實(shí)體中具體化(例如，能夠結(jié)合靶和酶的第一抗體或能夠結(jié)合第一抗體的信號(hào)發(fā)生劑標(biāo)記的第二抗體)。在結(jié)合劑和標(biāo)記(信號(hào)發(fā)生劑或酶)為分離的實(shí)體時(shí)，它們可在單一步驟或多個(gè)步驟施加到組織樣品。術(shù)語(yǔ)“熒光探針”是指具有偶合到熒光信號(hào)發(fā)生劑的結(jié)合劑的劑?！靶盘?hào)發(fā)生劑”是指能夠提供用一種或多種檢測(cè)技術(shù)(例如光譜測(cè)定法、量熱法、光譜法或目測(cè))可檢測(cè)的信號(hào)的分子?？蓹z測(cè)信號(hào)的適合實(shí)例可包括光學(xué)信號(hào)和電學(xué)信號(hào)或放射信號(hào)。信號(hào)發(fā)生劑的實(shí)例包括一種或多種生色團(tuán)、熒光團(tuán)、拉曼活性標(biāo)記或放射性標(biāo)記。如上所述，關(guān)于探針，在一些實(shí)施方案中，信號(hào)發(fā)生劑和結(jié)合劑可存在于單一實(shí)體中(例如，具有熒光標(biāo)記的靶結(jié)合蛋白)?；蛘?，結(jié)合劑和信號(hào)發(fā)生劑可以為在引入樣品前或引入樣品后相互締合的離散實(shí)體(例如，受體蛋白和對(duì)抗那種特定受體蛋白的標(biāo)記的抗體)?！盁晒鈭F(tuán)”或“熒光信號(hào)發(fā)生劑”是指在通過(guò)曝露于特定光波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)發(fā)射不同波長(zhǎng)的光的化合物。熒光團(tuán)可根據(jù)它們的發(fā)射分布或“顏色”來(lái)描述。綠色熒光團(tuán)(例如， Cy3、FITC和Oregon Green)可表征為其一般在515至540納米范圍波長(zhǎng)的發(fā)射。紅色熒光團(tuán)(例如，Texas Red、Cy5和四甲基若丹明)可表征為其一般在590至690納米范圍波長(zhǎng)的發(fā)射。熒光團(tuán)的實(shí)例包括但不限于4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸基芪_2，2' - 二磺酸、吖啶、吖啶和吖啶異硫氰酸酯的衍生物、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N_[3-乙烯基磺?；?苯基]萘二甲酰亞胺-3，5-二磺酸鹽(Lucifer Yellow VS)、 N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來(lái)酰亞胺、氨基苯甲酰胺、Brilliant Yellow、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7_氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)、焰紅染料(cyanosine)、4'，6_ 二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)、5'， 5〃 -二溴連苯三酚-砜酞出1~0111叩71~呢￡11101徹(1)、7-二乙基氨基-3-(4'-異硫氰酸基苯基)4-甲基香豆素，_，4，4' -二異硫氰酸基二氫-芪_2，2' -二磺酸、4，4' - 二異硫氰酸基芪_2，2' -二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)、曙紅、曙紅衍生物(如，曙紅異硫氰酸酯)、赤蘚紅、赤蘚紅衍生物(如赤蘚紅B和赤蘚紅異硫氰酸酯)； 乙啶；熒光素和衍生物，如5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素 (DTAF)、2' 7' -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基熒光素(JOE)、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、QFITC (XRITC)；熒光胺衍生物(在與胺反應(yīng)后為熒光性)；IR144 ；IR1446 ；孔雀綠異硫氰酸酯；4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅，B-藻紅素；鄰苯二甲醛衍生物(在與胺反應(yīng)后為熒光性)；芘和衍生物，如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亞氨基 1-芘丁酸酯；Reactive Red 4(Cibacron. RTM. Brilliant Red 3B_A)、若丹明和衍生物(如 6-羧基-X-若丹明(ROX)、6_羧基若丹明(R6G)、麗絲胺若丹明B磺酰氯、若丹明(Iihod)、 若丹明B、若丹明123、若丹明X異硫氰酸酯、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明 101的磺酰氯衍生物(Texas Red) ；N,N,N' ,N'-四甲基_6_羧基若丹明(TAMRA)；四甲基若丹明，四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)；核黃素；玫紅酸和鑭系螯合物衍生物，量子點(diǎn)， 菁，吡喃鐺(pyreIium)染料和方酸?！鞍小笔侵复嬖谟诮M織樣品時(shí)可檢測(cè)的組織樣品組分。靶可以為存在天然產(chǎn)生的特異結(jié)合劑(例如，抗體)或可制備特異結(jié)合劑(例如，小分子結(jié)合劑或適配體)的任何物質(zhì)。通常，結(jié)合劑可通過(guò)靶的一個(gè)或多個(gè)離散化學(xué)部分或靶的三維結(jié)構(gòu)組分(例如，產(chǎn)生于肽折疊的3D結(jié)構(gòu))結(jié)合到靶。靶可包括一種或多種天然或改性肽、蛋白(例如，抗體、親和體或適配體)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或適配體)、多糖(例如，凝集素或糖)、脂質(zhì)、酶、酶底物、配體、受體、抗原或半抗原。在一些實(shí)施方案中，靶可包括蛋白或核酸。在一些實(shí)施方案中，靶可包括蛋白和核酸二者。本發(fā)明包括總的來(lái)說(shuō)涉及應(yīng)用于分析、診斷或預(yù)測(cè)應(yīng)用(如分析物檢測(cè)、組織化學(xué)、免疫染色、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫熒光)的方法的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可特別應(yīng)用于免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，描述了一種方法，其中處理從病理學(xué)取樣得到的組織切片，然后蛋白檢測(cè)用于生物標(biāo)記評(píng)價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括兩步程序，此程序可應(yīng)用于多種蛋白抗原，并且可提供高水平抗原提取。在某些實(shí)施方案中，這允許臨床相關(guān)樣品的多元診斷。在一些實(shí)施方案中，組織樣品包括來(lái)自健康或患病組織的組織切片(例如，來(lái)自結(jié)腸、乳腺組織、前列腺的組織切片)。組織樣品可包括組織切片的單一部分或片，例如，從組織切片切割的組織或細(xì)胞的薄片。在一些實(shí)施方案中，組織樣品的相同切片可在形態(tài)學(xué)和分子水平兩者分析。在一些實(shí)施方案中，可首先使組織樣品固定，然后通過(guò)醇的遞增系列脫水，滲透， 并用石蠟或其它切片介質(zhì)嵌入，以便可切割組織樣品。在供選的實(shí)施方案中，可切割組織樣品，隨后固定。在一些實(shí)施方案中，可在石蠟中嵌入組織樣品并處理。可使用的石蠟的實(shí)例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuecan。一旦嵌入組織樣品，就可將樣品通過(guò)切片機(jī)切成切片。切片的厚度可根據(jù)組織和分析的類型改變。在某些實(shí)施方案中，切片可具有約2微米至約5微米范圍的優(yōu)選厚度。一旦切割，就可用粘合劑使切片附著到玻片。玻片粘合劑的實(shí)例可包括但不限于硅烷、明膠、聚L-賴氨酸。在實(shí)施方案中，如果石蠟用作嵌入材料，則可使組織切片去石蠟， 并在水中重新水合。組織切片可例如用有機(jī)劑(如二甲苯或醇的逐漸遞減系列)去石蠟。在其他實(shí)施方案中，甲醛固定的組織樣品可粘著到固體載體上，以允許其在制備和成像過(guò)程期間分析、轉(zhuǎn)移和移動(dòng)。通過(guò)物理吸附、共價(jià)鍵形成或其組合，可使組織樣品固定在固體載體上。固體載體可包括聚合、玻璃或金屬材料。固體載體的實(shí)例包括膜、微量滴定板、珠料、過(guò)濾器、試片、玻片、蓋片和試管。在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種方法，其中使甲醛固定的組織樣品與第一抗原提取溶液接觸，并加熱到大于90°C的溫度經(jīng)歷大于10分鐘的時(shí)間，更優(yōu)選約20分鐘時(shí)間。加熱可用高壓鍋、高壓滅菌器、水浴、熱板、微波或蒸汽加熱器進(jìn)行，以對(duì)浸入抗原提取溶液的組織樣品提供均勻加熱。然后，不用另外的處理，將組織樣品轉(zhuǎn)移到第二抗原提取溶液(其預(yù)熱到大于90°C的溫度)經(jīng)歷相似時(shí)間。預(yù)熱可用高壓鍋、高壓滅菌器、水浴、熱板、微波、 蒸汽加熱或其組合進(jìn)行，并且可在加熱第一抗原提取溶液時(shí)進(jìn)行。在第二抗原提取溶液培養(yǎng)樣品優(yōu)選在大氣壓并且通過(guò)只在熱溶液中浸漬而進(jìn)行。這可防止組織損害。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗原提取溶液為具有約5和約7之間范圍pH的緩沖溶液。第一抗原提取溶液可以為用于保持PH在微酸性至中性范圍的常用緩沖溶液。在某些實(shí)施方案中，緩沖劑可包括檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N'-雙 O-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其組合。在其它實(shí)施方案中，緩沖溶液可以為在升高的溫度具有約6. 0的pH的檸檬酸磷酸鈉緩沖溶液。利用加熱，第一抗原提取溶液可作用于使在樣品固定期間在福爾馬林和抗原之間可能形成的交聯(lián)鍵水解。這導(dǎo)致提取樣品中至少一些部分抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二抗原提取溶液為具有約7. 5至約11范圍的堿性pH的緩沖溶液。第二抗原提取溶液可以為用于保持PH在微堿性范圍的常用緩沖溶液。在某些實(shí)施
7方案中，緩沖溶液可包含三(羥基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(TAPS)、N， N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4_2_羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPEQ、2-{[三(羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TEQ或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖溶液可以為在升高的溫度具有約10的pH的TRIS-HCl緩沖劑。與第一抗原提取溶液一樣，第二抗原提取溶液可作用于使在樣品固定期間在福爾馬林和抗原之間可能形成的交聯(lián)鍵水解。被提取的抗原部分為樣品中未提取抗原的至少一些另一部分。應(yīng)了解，在其它實(shí)施方案中，第一抗原提取溶液可以為約7. 5至約11范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液可以為約5至約7范圍的緩沖溶液。通過(guò)暴露于第一和第二抗原提取溶液提取的抗原可對(duì)免疫染色更敏感，以允許分析和功能形態(tài)學(xué)研究?jī)烧摺Ｃ庖呷旧庖呓M織化學(xué)(IHC)染色和免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC) 染色兩者。在某些實(shí)施方案中，改良可包括增加的正染色強(qiáng)度，并減小背景染色。在某些實(shí)施方案中，在施加第二抗原提取溶液后，可進(jìn)行樣品的免疫染色?？墒箍贵w溶液(例如，探針)經(jīng)歷足夠時(shí)間并在適用于使標(biāo)記抗體結(jié)合到抗原的條件下與組織切片接觸?？墒褂脙煞N檢測(cè)方法直接或間接。在直接檢測(cè)中，信號(hào)發(fā)生劑標(biāo)記的第一抗體 (例如，熒光團(tuán)標(biāo)記的第一抗體)可用抗原在組織樣品中培養(yǎng)，這可以可視化，不用其它抗體相互作用。在間接檢測(cè)中，未綴合的第一抗體可用抗原培養(yǎng)，然后，可使標(biāo)記的第二抗體結(jié)合到第一抗體。可發(fā)生信號(hào)擴(kuò)增，因?yàn)閿?shù)個(gè)第二抗體可以與第一抗體上的不同表位反應(yīng)。 在可使第二抗體綴合到酶促標(biāo)記的實(shí)施方案中，可加入顯色或熒光底物，以提供抗原的可視化。在一些實(shí)施方案中，可使兩種或更多種(最多四種)第一抗體(標(biāo)記或未標(biāo)記)與組織樣品接觸。然后，可使未標(biāo)記抗體與相應(yīng)的標(biāo)記的第二抗體接觸。在一些實(shí)施方案中， 其它方法可用于信號(hào)增強(qiáng)，例如使用標(biāo)記的第三或第四抗體。在一些實(shí)施方案中，在抗原提取過(guò)程后，將核酸探針施加到樣品，以進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)或顯色原位雜交(CISH)。可用檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自探針中的信號(hào)發(fā)生劑的信號(hào)。所用檢測(cè)系統(tǒng)的性質(zhì)可取決于所用信號(hào)發(fā)生劑的性質(zhì)。檢測(cè)系統(tǒng)可包括電子自旋共振(ESR)檢測(cè)系統(tǒng)、電荷耦合器件(CCD)檢測(cè)系統(tǒng)(例如，對(duì)于放射性同位素)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)、電檢測(cè)系統(tǒng)、照相軟片檢測(cè)系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)、酶檢測(cè)系統(tǒng)、原子力顯微鏡(AFM)檢測(cè)系統(tǒng)和掃描隧道顯微鏡 (STM)檢測(cè)系統(tǒng)(兩者例如用于檢測(cè)微珠)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、近場(chǎng)檢測(cè)系統(tǒng)或總內(nèi)反射(TIR) 檢測(cè)系統(tǒng)?？捎靡环N或多種上述技術(shù)觀察來(lái)自第一信號(hào)發(fā)生劑的第一信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)特征。在一些實(shí)施方案中，可用一種或多種上述技術(shù)測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度、信號(hào)波長(zhǎng)、信號(hào)位置、信號(hào)頻率或信號(hào)轉(zhuǎn)移。在一些實(shí)施方案中，可觀察、檢測(cè)并記錄信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)前述特征。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)發(fā)生劑可包括熒光團(tuán)，并且可用熒光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定熒光波長(zhǎng)或熒光強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，可原位觀察信號(hào)，即，可從通過(guò)結(jié)合劑結(jié)合到組織樣品中的靶的信號(hào)發(fā)生劑直接觀察信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，可在組織樣品內(nèi)分析來(lái)自信號(hào)發(fā)生劑的信號(hào)，排除單獨(dú)的基于陣列的檢測(cè)系統(tǒng)的需要。在其它實(shí)施方案中，在探針結(jié)合后，可使信號(hào)從結(jié)合劑分離，并離開(kāi)生物樣品檢測(cè)。分離信號(hào)的方法可包括但不限于ELISA和質(zhì)譜法、雜化微陣列。在一些實(shí)施方案中，觀察信號(hào)可包括捕獲組織樣品的圖像。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本文公開(kāi)的方法，可用連接到成像裝置的顯微鏡作為檢測(cè)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，可激發(fā)信號(hào)發(fā)生劑(如，熒光團(tuán))，并可觀察得到的信號(hào)(如，熒光信號(hào))，并以數(shù)字信號(hào)的形式記錄(如，數(shù)字化圖像)。對(duì)于用適合的熒光過(guò)濾器結(jié)合在樣品中的不同信號(hào)發(fā)生劑(如果存在)，可重復(fù)相同程序?？墒够瘜W(xué)劑施加到組織樣品以修改信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)修改可包括一種或多種信號(hào)特征變化，例如，信號(hào)強(qiáng)度減小、信號(hào)峰轉(zhuǎn)移、共振頻率變化或?qū)е滦盘?hào)去除的信號(hào)發(fā)生劑分裂(去除)。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)劑可以為溶液的形式，并且可使組織樣品與化學(xué)劑溶液接觸預(yù)定量的時(shí)間?；瘜W(xué)劑溶液的濃度和接觸時(shí)間可取決于期望的信號(hào)修改的類型。在一些實(shí)施方案中，可選擇用于化學(xué)劑的接觸條件，使得結(jié)合劑、靶、組織樣品和結(jié)合劑與靶之間的結(jié)合可不受影響。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)劑可只影響信號(hào)發(fā)生劑，化學(xué)劑可不影響靶/結(jié)合劑結(jié)合或結(jié)合劑完整性。因此，例如，結(jié)合劑可包括第一抗體或第一抗體/第二組合。根據(jù)本文公開(kāi)方法的化學(xué)劑可只影響信號(hào)發(fā)生劑，第一抗體或第一抗體/第二抗體組合可基本保持不受影響。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合劑(如，第一抗體或第一抗體/第二抗體組合)可在使樣品與化學(xué)劑接觸后保持結(jié)合到組織樣品中的靶。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合劑可在使樣品與化學(xué)劑接觸后保持結(jié)合到組織樣品中的靶，并且結(jié)合劑整體性可保持基本不受影響(例如，在化學(xué)劑存在下抗體可實(shí)質(zhì)上不變性或洗脫)。在其它實(shí)施方案中，化學(xué)劑可影響靶/結(jié)合劑結(jié)合或結(jié)合劑/信號(hào)接觸/連接。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)“脫去探針并重新探測(cè)樣品來(lái)檢測(cè)多個(gè)靶。脫去一般指任何方法，例如但不限于浸入非標(biāo)記溶液或其它物質(zhì)或通過(guò)重新施加非標(biāo)記溶液或其它物質(zhì)(所述其它物質(zhì)比如但不限于水、鹽水、緩沖鹽水或乙醇)沖洗，以提供用于從樣品離解、 分散和去除探針的介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可用光熒光漂白報(bào)道基因或信號(hào)發(fā)生劑，從而允許信號(hào)發(fā)生劑重新用于新的探針上而檢測(cè)多個(gè)靶?？煞磸?fù)重復(fù)這些過(guò)程，以達(dá)到相同樣品的多重探測(cè)。在一些實(shí)施方案中，可在使樣品與化學(xué)劑接觸后觀察信號(hào)的特征，以確定信號(hào)修改的有效性。例如，可在施加化學(xué)劑之前觀察顏色，在施加化學(xué)劑之后顏色可不存在。在另一個(gè)實(shí)例中，可在與化學(xué)劑接觸之前和在與化學(xué)劑接觸之后觀察來(lái)自熒光信號(hào)發(fā)生劑的熒光強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，可將信號(hào)強(qiáng)度減小預(yù)定量稱為信號(hào)修改。在一些實(shí)施方案中， 信號(hào)修改可以指信號(hào)強(qiáng)度減小大于約50%范圍的量。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)修改可以指信號(hào)強(qiáng)度減小大于約60%范圍的量。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)修改可以指信號(hào)強(qiáng)度減小大于約80%范圍的量。在一些實(shí)施方案中，可用本文以上對(duì)第一探針?biāo)龅囊环N或多種程序使組織樣品與第二探針接觸。第二探針可能夠結(jié)合到不同于第一探針結(jié)合的靶的靶上。在其中多個(gè)探針可與組織樣品在第一探針接觸步驟中接觸的實(shí)施方案中，第二探針可能夠結(jié)合不同于第一探針組結(jié)合的靶的靶。在一些實(shí)施方案中，可使組織樣品與多個(gè)探針在第二探針接觸步驟中接觸。可用一種或多種上述檢測(cè)方法觀察來(lái)自第二信號(hào)發(fā)生劑(存在于隨后探針)的隨后(例如，第二、第三等)信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)特征。在一些實(shí)施方案中，可用一種或多種上述技術(shù)測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度、信號(hào)波長(zhǎng)、信號(hào)位置、信號(hào)頻率或信號(hào)轉(zhuǎn)移。與第一信號(hào)類似，得到的隨后信號(hào)(例如，熒光信號(hào))可以數(shù)字信號(hào)形式記錄(如，數(shù)字化圖像)。在一些實(shí)施方案中，觀察隨后信號(hào)也可包括捕獲組織樣品的光學(xué)圖像。在一些實(shí)施方案中，在使樣品與隨后(例如，第二、第三等)探針接觸后，可重復(fù)劑修改(agent modification)和隨后的探針給予多次。在一些實(shí)施方案中，在觀察來(lái)自第二探針的第二信號(hào)后，可使組織樣品與化學(xué)劑接觸，以修改來(lái)自第二探針的信號(hào)。另外，可使第三探針與組織樣品接觸，其中第三探針可能夠結(jié)合不同于第一和第二探針的靶。同樣， 可觀察來(lái)自第三探針的信號(hào)，隨后施加化學(xué)劑以修改信號(hào)。可用能夠結(jié)合到另外的靶的第 η個(gè)探針?lè)磸?fù)重復(fù)接觸、結(jié)合和觀察步驟多次，以用多種探針和/或信號(hào)發(fā)生劑為使用者提供關(guān)于多個(gè)靶的信息。在一些實(shí)施方案中，可使一系列探針與組織樣品以連續(xù)方式接觸，以得到組織樣品的多元分析。在一些實(shí)施方案中，可使一系列探針組(在一組中包括約4個(gè)探針)與組織樣品以序列方式接觸，以得到組織樣品的多元分析。多元分析一般指用相同的檢測(cè)機(jī)制分析組織樣品中的多個(gè)靶。在某些實(shí)施方案中，提供了可用于進(jìn)行上述抗原提取方法的試劑盒。試劑盒可包含一種或多種抗原提取溶液。試劑盒也可進(jìn)一步包含使用說(shuō)明書。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種用于免疫染色和檢測(cè)的另外的試劑。 例如，在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包含信號(hào)發(fā)生劑，如生色團(tuán)、熒光團(tuán)、拉曼活性標(biāo)記或放射性標(biāo)記。試劑盒也可包含能夠如上所述改善檢測(cè)或放大信號(hào)的試劑，包括但不限于聚合酶酶、其它緩沖劑、金屬陽(yáng)離子和鹽。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，如圖1所示，描述了用于使甲醛固定的組織樣品15與上述抗原提取溶液和其它洗滌和染色溶液接觸的樣品處理裝置10。樣品處理裝置可包含樣品處理子系統(tǒng)20和試劑分配子系統(tǒng)30。在某些實(shí)施方案中，裝置也可包括信號(hào)檢測(cè)子系統(tǒng)40。 在一個(gè)實(shí)施方案中，可將樣品處理裝置作為分析裝置的組件(如自動(dòng)高通量系統(tǒng))結(jié)合，所述分析裝置能夠使甲醛固定的組織樣品在一個(gè)系統(tǒng)中染色和成像并仍進(jìn)一步分析圖像。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，系統(tǒng)可包括為了定位和移動(dòng)用于分析的甲醛固定的組織樣品的樣品處理子系統(tǒng)，和使樣品與第一抗原提取溶液、第二抗原提取溶液和免疫染色試劑的至少一種接觸的試劑分配子系統(tǒng)。樣品處理系統(tǒng)可包括多種組件，并允許樣品從一個(gè)區(qū)域移到下一個(gè)區(qū)域。例如，可用一個(gè)裝置使樣品與試劑接觸，移動(dòng)并固定到用于成像的臺(tái)(stage)，臺(tái)的移動(dòng)是可控制的。臺(tái)可結(jié)合到顯微鏡，并且能夠使樣品移動(dòng)通過(guò)成像視野。系統(tǒng)也可包括信號(hào)檢測(cè)子系統(tǒng)(未顯示)，以通過(guò)染色過(guò)程捕獲樣品的圖像。圖像可用各種照明源捕獲。在某些實(shí)施方案中，圖像捕獲可以為能夠以不同放大倍數(shù)捕獲和轉(zhuǎn)移樣品的數(shù)字圖像的成像顯微鏡的部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，自動(dòng)系統(tǒng)可包括計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述可讀介質(zhì)可包括分析經(jīng)染色甲醛固定組織樣品的自動(dòng)技術(shù)的說(shuō)明書。在其它實(shí)施方案中，樣品處理裝置可能夠循環(huán)通過(guò)抗原提取、熒光標(biāo)記、成像和脫去熒光探針的多個(gè)步驟。染色也可包括免疫過(guò)氧化物酶標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用醇可溶性過(guò)氧化物酶底物，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，隨后去除AEC沉淀物，任選用溫和過(guò)氧化物處理進(jìn)一步使過(guò)氧化物酶失活，并重復(fù)染色。在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)化學(xué)處理、熱處理或其組合脫去熒光探針。取樣處理裝置可自動(dòng)化，使得可原位進(jìn)行多個(gè)循環(huán)，以使樣品位移最大限度地減小，并幫助在一個(gè)組織切片或細(xì)胞樣品中映射多個(gè)標(biāo)記。試驗(yàn)方法利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)方法分析影響信噪比(ration)的變量，所述信噪比為系統(tǒng)靈敏度的反映。變量包括溫度、暴露時(shí)間、PH和洗滌次序。圖像用kiss Axilmager Zl顯微鏡在20x或63x放大倍數(shù)獲得。圖像定量用GNU圖像操作程序(GIMP)軟件進(jìn)行，在從未染色區(qū)域減去背景像素強(qiáng)度后計(jì)算平均像素強(qiáng)度/面積。將平均像素強(qiáng)度計(jì)算為相同組織的 10個(gè)圖像的平均值。研究使用以下材料人存檔組織來(lái)自多種來(lái)源，并包括乳腺、前列腺、肺、結(jié)腸、胎盤、唾液腺、淋巴結(jié)、腦和皮膚的樣品。所有樣品來(lái)自組織存檔。所用的用于固定的細(xì)節(jié)未知，并假定具有以下標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)實(shí)踐。用于AR的抗體從Lab Vision Corporation (Thermo Fisher Scientific的一部分)得到，并用標(biāo)準(zhǔn)程序在室內(nèi)與Cy3和Cy5熒光染料綴合?；跈幟仕猁}的抗原提取溶液從Vector Laboratories得到，并以6.0的最終pH值1 20 稀釋?；赥ris的緩沖劑由IOmM Tris (三(羥基甲基)氨基甲烷)、lmM EDTA(乙二胺四乙酸)、l%Tween-20(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯)組成，得到8的pH值(從新制備的IOx原料溶液制備)。用設(shè)定在HI功率的標(biāo)準(zhǔn)家用高壓鍋加熱20分鐘，并人工監(jiān)控。福爾馬林固定的石蠟嵌入組織切片通過(guò)如下處理在65°C烘烤玻片1小時(shí)，并用 histochoice清潔劑從樣品切片去除蠟。發(fā)現(xiàn)不需要烘烤樣品，但作為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐自始至終使用。然后使樣品通過(guò)一系列遞減濃度的醇洗液(一般100、95、70、50% )處理，各MlO 分鐘洗滌，然后帶到PBS溶液中的鹽水條件10分鐘。然后，在包含0. 3% Triton X-100的 PBS中用簡(jiǎn)短處理滲透(premeablize)樣品，隨后進(jìn)行提取過(guò)程。提取過(guò)程包括將樣品放入高壓鍋或微波中的溶液A (Tris pH 8. 0，具有Tween 20)經(jīng)歷約20分鐘。在加熱循環(huán)結(jié)束，將樣品放入在加熱室中的預(yù)熱溶液B (檸檬酸鹽溶液PH 6)，不用另外加熱。在兩種熱溶液之間，樣品不轉(zhuǎn)移到冷PBS溶液，也不在第二溶液中暴露于另外加熱。在第二溶液中的樣品已達(dá)到室溫后(約20分鐘)，在PBS中徹底清洗樣品，然后進(jìn)行任何另外的處理步驟，例如封閉或過(guò)氧化物酶處理(用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活)。樣品可然后經(jīng)歷免疫檢測(cè)。在第一輪免疫檢測(cè)后，可使樣品消除信號(hào)，并重新探測(cè)另外的抗原。或者，使用類似于人工過(guò)程條件的程序設(shè)置，用Discovery XT自動(dòng)染色機(jī) (Ventana Medical Systems, Inc.)處理玻片。在樣品條形編碼并制備試劑后，將玻片裝入自動(dòng)染色機(jī)，并如下處理將樣品加熱，通過(guò)在EZ-pr印試劑(用于Ventana Discovery XT 的除蠟溶液)中清洗脫蠟。分別使用CCl和CC2 (Ventana提供的用在Discovery XT自動(dòng)染色機(jī)上的用于抗原提取的兩種溶液)、Tris和檸檬酸基溶液進(jìn)行抗原提取。為了與人工二步方法比較的目的，進(jìn)行短時(shí)和中間時(shí)間抗原提取，這在Discovery XT自動(dòng)染色機(jī)程序中作為溫和和標(biāo)準(zhǔn)參考。應(yīng)了解，在自動(dòng)系統(tǒng)上，組織樣品在兩個(gè)抗原提取步驟之間清洗，這是本文所述人工方法和自動(dòng)方法之間的關(guān)鍵差異。然后隨著二步人工方法處理的樣品將玻片人工染色。結(jié)果和觀察為了分析，最初選擇雄激素受體抗體用于檢測(cè)人檔案前列腺組織切片中的AR。選擇此組合是由于在沒(méi)有表位解掩蔽(未顯示)存在下進(jìn)行染色時(shí)缺乏可檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生。利用用于抗原解掩蔽的兩種一般緩沖劑(檸檬酸鹽或Tris)并在高壓鍋中處理樣品20分鐘， 用熒光染料產(chǎn)生中度強(qiáng)度染色。使用的檸檬酸鹽解掩蔽條件代表通過(guò)多種抗體檢測(cè)AR的常用方案。試驗(yàn)了不同條件，包括單獨(dú)檸檬酸鹽(組1)、單獨(dú)Tris (組2、、先Tris然后檸檬酸鹽(組幻和先檸檬酸鹽然后Tris (組4)。所有條件在玻片上三重試驗(yàn)，除了將10個(gè)玻片染色以建立基線測(cè)量的對(duì)照樣品。第一系列試驗(yàn)使用Lab Vision AR抗體，隨后用驢抗兔Cy3第二抗體檢測(cè)。所有數(shù)據(jù)采集使用相等的暴露時(shí)間，并且在染色后立即收集圖像。如圖2所示，二步方法與單獨(dú)檸檬酸鹽或Tris比較時(shí)提供對(duì)AR染色的顯著增強(qiáng)。圖2為染色的單色圖像，在右側(cè)顯示使用二步程序增強(qiáng)的染色。通常，對(duì)于各組玻片，與對(duì)照樣品比較，利用二步方法對(duì)AR觀察到染色強(qiáng)度增加到二倍或更多?？刂票┞队诩訜崛芤旱臅r(shí)間，并且所有玻片接受總共50分鐘時(shí)間。對(duì)于所有試驗(yàn)玻片，在家用高壓鍋中在壓力下進(jìn)行第一加熱步驟。在25分鐘后，將來(lái)自組1和 2的玻片放入新的一瓶預(yù)熱溶液(在第一步驟正在進(jìn)行的同時(shí)在單獨(dú)瓶中加熱的與第一步驟相同的溶液)，并使之在高壓鍋中冷卻(不在壓力下)另外25分鐘。然后在PBS中洗滌玻片，并用第一抗體在4°C染色過(guò)夜。對(duì)于來(lái)自組3和組4的玻片，將溶液在處理的后25分鐘期間改變到上述各自條件，并與其它組平行處理。也試驗(yàn)對(duì)二步程序的數(shù)個(gè)變換。在一個(gè)變換中，其中使用兩種溶液的次序不影響結(jié)果。如果首先使用酸性溶液，隨后使用堿性溶液，觀察不到結(jié)果差異，反之亦然。方法中的其它變換證明對(duì)過(guò)程有害。這些包括對(duì)樣品重新加壓第二時(shí)間，和在第一和第二步驟之間在PBS中洗滌。這兩種變化均導(dǎo)致組織從玻片顯著損失，因此要避免。在對(duì)AR的第一抗體的試驗(yàn)并且用第二抗體檢測(cè)后，試驗(yàn)Cy5_直接綴合的AR抗體。用直接綴合物發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，其中在其它市售抗體的寬取樣試驗(yàn)中觀察到增強(qiáng)的染色。 此方法也導(dǎo)致用一些市售級(jí)磷酸基-表位增強(qiáng)的染色，這些磷酸基-表位通常不穩(wěn)定，并傾向于在提取過(guò)程中降解。此程序也可應(yīng)用于其它應(yīng)用，例如，從FFPE組織的蛋白分離，其中抗原提取方法已顯示提高蛋白提取和回收。此程序也可用于來(lái)自FFPE組織的激光捕獲顯微切割，所述 FFPE組織作為蛋白組學(xué)分析的蛋白源。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可在FISH或CISH分析之前用于FFPE樣品上。一般在DNA變性和探針雜化之前使正經(jīng)過(guò)FISH或CISH分析的FFPE樣品暴露于加熱預(yù)處理步驟。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在FISH或CISH分析前，二步程序可代替加熱預(yù)處理步驟或用于制備組織樣品的其它程序。圖3顯示單色顯微相片(在20X和63X放大倍數(shù))，其顯示用不同抗體在BrCA腫瘤的多元FISH分析中用二步程序的增強(qiáng)染色。方法比較也用Discovery XT自動(dòng)染色機(jī)評(píng)價(jià)自動(dòng)過(guò)程。在自動(dòng)染色機(jī)和涉及儀器操作的人工二步方法之間有過(guò)程條件差異。例如，自動(dòng)染色機(jī)用加熱和清潔劑使樣品脫蠟，而人工方法使用無(wú)毒HistochoiceTM蠟清潔試劑(Amresco)。在通過(guò)本文所述人工二步抗原提取或使用Discovery XT自動(dòng)染色機(jī)的兩種類似方法制備細(xì)胞后，對(duì)于S6、磷酸基-S6ser235/236或磷酸基-S6Serf40/M4將福爾馬林固定的石賭嵌入(FFPE) LNCaP 細(xì)胞(American Type Culture Collection (ATCC,Maryland))染色。雖然抗原提取用人工或自動(dòng)方法完成，但在連續(xù)信號(hào)去除/修改和重新染色中觀察到差異。在大多數(shù)情況下，使用自動(dòng)系統(tǒng)，染色減小產(chǎn)生于1或5個(gè)信號(hào)修改步驟。對(duì)于S6， 使用自動(dòng)方法在恰好一輪信號(hào)修改后導(dǎo)致完全染色損失。在所有情況下，人工二步方法提供各抗原的最佳保存。在使任一種磷酸基-表位染色時(shí)，人工二步方法也顯示較小靈敏度。差異示于圖4中，圖4為與兩種自動(dòng)方法比較通過(guò)人工二步抗原提取方法提供的較大表位穩(wěn)定性的定量分析的圖解表示。平均像素強(qiáng)度顯示評(píng)價(jià)對(duì)抗原-S6的漂白作用。 通過(guò)三種不同的脫蠟和抗原提取方法制備玻片，并在染色前經(jīng)過(guò)0、1和5輪漂白。定量分析指示人工二步方法最佳保存抗原。在相同蛋白上的不同表位對(duì)漂白差別化反應(yīng)，這可表明占主導(dǎo)的表位作用，不損失蛋白。這也顯示于圖5中，圖5為人工二步抗原提取方法與兩種自動(dòng)方法比較對(duì)抗原-S6的漂白作用的單色顯微相片(在20X放大倍數(shù))。在不脫離其精神或基本特征下，本發(fā)明可以其他具體形式具體化。因此，前述實(shí)施方案在所有方面應(yīng)認(rèn)為是說(shuō)明性，而不是對(duì)本文所述發(fā)明的限制。因此，本發(fā)明的范圍由附加權(quán)利要求而非前述說(shuō)明指示，在權(quán)利要求的等價(jià)的含義和范圍內(nèi)的所有變化因此旨在包含于其中。
權(quán)利要求
1.一種甲醛固定的組織樣品的抗原提取的方法，所述方法包含以下步驟在大于90°C的溫度在第一抗原提取溶液中培養(yǎng)甲醛固定的組織樣品；將甲醛固定的組織樣品轉(zhuǎn)移到第二抗原提取溶液；并且在大于90°C的溫度在第二抗原提取溶液中培養(yǎng)甲醛固定的組織樣品。
2.權(quán)利要求1的方法，其中第一抗原提取溶液包含具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液包含具有約7. 5和約11之間pH范圍的緩沖溶液；或者第一抗原提取溶液包含具有約7. 5和約11之間pH范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液包含具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液。
3.權(quán)利要求2的方法，其中具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液包含檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N'-雙O-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其組合。
4.權(quán)利要求3的方法，其中具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液包含檸檬酸。
5.權(quán)利要求2的方法，其中具有約7.5和約11之間pH范圍的緩沖溶液包含三(羥基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(TAPS)、N，N_雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、 N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2_羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2_ {[三 (羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TEQ或其組合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中具有約7.5和約11之間pH范圍的緩沖溶液包含TRIS。
7.前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中甲醛固定的組織樣品嵌入石蠟中。
8.前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中甲醛固定的組織樣品為器官或組織、體液、 組織或微陣列的切片部分。
9.前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中利用第一抗原提取溶液和第二抗原提取溶液的培養(yǎng)步驟包含在加熱裝置中培養(yǎng)大于10分鐘的時(shí)間。
10.權(quán)利要求9的方法，其中加熱裝置為高壓鍋、高壓滅菌器、水浴、熱板、微波、蒸汽加熱或其組合。
11.前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包含抗原免疫染色的步驟。
12.權(quán)利要求11的方法，其中免疫染色包含連續(xù)免疫過(guò)氧化物酶標(biāo)記和清除。
13.前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中甲醛固定的組織樣品經(jīng)歷FISH或CISH分析。
14.一種用于提取甲醛固定的組織樣品中的抗原的試劑盒，所述試劑盒包含提取樣品中至少一部分未提取抗原的第一抗原提取溶液；和提取樣品中至少一些另一部分未提取抗原的第二抗原提取溶液。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中第一抗原提取溶液為具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液為具有約7. 5和約11之間pH范圍的緩沖溶液。
16.權(quán)利要求14或15的試劑盒，其中第一抗原提取溶液包含檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N'-雙O-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其組合。
17.權(quán)利要求15或16的試劑盒，其中第一抗原提取溶液包含檸檬酸。
18.權(quán)利要求14至17中一項(xiàng)或多項(xiàng)的試劑盒，其中第二抗原提取溶液包含三(羥基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(TAPS)、N，N_雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、 N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2_羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2_ {[三 (羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TEQ或其組合。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中第二抗原提取溶液包含TRIS。
20.權(quán)利要求14至19中一項(xiàng)或多項(xiàng)的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含一種或多種免疫染色劑。
21.一種用于進(jìn)行權(quán)利要求11的方法的樣品處理裝置，所述樣品處理裝置包含樣品處理子系統(tǒng)和試劑分配子系統(tǒng)。
22.權(quán)利要求21的裝置，其中試劑分配子系統(tǒng)能夠使樣品與第一抗原提取溶液、第二抗原提取溶液和免疫染色試劑中的至少一種接觸。
23.權(quán)利要求21或22的裝置，其中試劑分配子系統(tǒng)能夠使樣品與試劑接觸，以去除免疫染色試劑。
24.權(quán)利要求21、22或23的裝置，其中樣品處理裝置能夠運(yùn)行多于一個(gè)試劑分配循環(huán)。
25.權(quán)利要求21至M中一項(xiàng)或多項(xiàng)的裝置，所述裝置進(jìn)一步包含信號(hào)檢測(cè)子系統(tǒng)。
26.權(quán)利要求25的裝置，其中樣品處理子系統(tǒng)、試劑分配子系統(tǒng)或信號(hào)檢測(cè)子系統(tǒng)中的一個(gè)或多個(gè)為自動(dòng)化。
全文摘要
本發(fā)明提供甲醛固定的組織樣品的抗原提取的方法，所述方法包括在大于90℃的溫度在第一抗原提取溶液中培養(yǎng)甲醛固定的組織樣品，將組織樣品轉(zhuǎn)移到第二抗原提取溶液，并在大于90℃的溫度在第二抗原提取溶液中培養(yǎng)組織樣品。本發(fā)明還提供進(jìn)行所述方法的試劑盒和樣品輸送裝置。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102597740SQ201080038562
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者A·蘇德, C·J·塞文斯基, M·J·格爾德斯 申請(qǐng)人:通用電氣公司