專利名稱：三聚氰胺elisa檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及三聚氰胺含量的試劑盒，特別是檢測飼料中三聚氰胺含量的酶聯(lián) 免疫檢測(ELISA)試劑盒，ELISA (Enzyme LinkedlmmunosorbnentAssay)是酶聯(lián)免疫吸附 劑測定的簡稱，它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種酶免技術(shù)。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)三聚氰胺簡稱三胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，白 色結(jié)晶粉末，動物長期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響，導致產(chǎn)生結(jié)石， 亦在動物源食品中形成殘留，威脅人們的健康，目前三聚氰胺檢測方法有氣相色譜質(zhì)譜法 (GC-MS)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，液相色譜法等。這些方法操作復(fù)雜、成本較高， 推廣使用受到限制。
(三)實用新型內(nèi)容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的三聚氰胺含量檢測試劑盒，其 操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術(shù)含量不高，可進行一次 連續(xù)多個樣品中三聚氰胺含量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。本實用新型的技術(shù)方案是一種飼料中三聚氰胺含量檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒，包 括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的15個下凹瓶位、一 個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶標板作為固相 載體，酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶 標反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，在試劑盒酶標板微孔條上預(yù)包被三聚氰胺偶聯(lián)抗原制成檢測 板，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋 板膜大小與酶標板橫切面大小一致，將14瓶試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶盛裝并固 定在下凹瓶位中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書、質(zhì)控報告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于 攜帶和運輸。14瓶試劑分別為7瓶Iml標準品溶液、Iml酶標二抗?jié)饪s液、7ml三聚氰胺抗 體工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復(fù)溶 液。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準分析孔)，既可進行一次連續(xù)多 個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可 以保證試劑盒檢測結(jié)果的準確性。檢測時，樣本中的三聚氰胺將和酶標板微孔條上預(yù)包被 的三聚氰胺偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度 值與樣本中所含三聚氰胺的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即 可得出樣品中三聚氰胺含量，其操作簡便易行。經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度飼料樣本的最低檢測限為500μ g/kg ； 相對于其他三聚氰胺檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、離心機、振蕩機和 微量加樣器等，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于三聚氰胺含量的檢測。

圖1為本實用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實用新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見附圖酶標反應(yīng)微孔條2預(yù)包被三聚氰胺偶聯(lián)抗原3固定于酶標板的外框支 撐架1上，酶標反應(yīng)微孔條2可隨要求拆卸；蓋板膜4用于酶標板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時 封蓋酶標反應(yīng)微孔條2，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料試 劑瓶5用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明PE塑料試劑瓶5用于封裝50ml濃縮復(fù) 溶液；白色帽6的白色PE塑料試劑瓶7用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽6的黑色PE塑 料試劑瓶7用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽6的白色PE塑料試劑瓶7用于封裝7ml終止 液，紅色帽的白色PE塑料試劑瓶8用于封裝Iml酶標二抗?jié)饪s液，綠色帽的白色PE塑料試 劑瓶8用于封裝7ml三聚氰胺抗體工作液，黑色帽的半透明PE塑料試劑瓶9用于封裝Iml/ 瓶的標準品溶液；泡沫塑料模具10有15個下凹瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶 位18，50ml濃縮復(fù)溶液11，7ml顯色液A液瓶位14，7ml顯色液B液瓶位13，7ml終止液瓶 位12，7ml三聚氰胺抗體工作液瓶位16，Iml酶標二抗?jié)饪s液瓶位15，7個Iml/瓶各種濃度 的標準品溶液瓶位17，盒體為19是硬紙盒。
具體實施方式
一、樣本的前處理1.配液配液1:0. IM鹽酸取4. 15ml濃鹽酸加去離子水溶解定溶至500ml ；配液2:提取工作液稱取2. Og氯化鉀溶于IOOml 0. IM鹽酸，混勻；配液3:復(fù)溶工作液用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1 1進行稀釋；配液4 洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個月。2.飼料樣本處理步驟稱取2. 0士0. 05g粉碎的飼料樣本，至50ml聚苯乙烯離心管中；加入IOml提取工 作液，用振蕩器振蕩5min ；3000g以上，室溫(20_25°C )離心IOmin ；移取Iml上清液加入三 聚氰胺飼料凈化小柱，用2ml離心管收集，讓其自由滴落30min，丟棄三聚氰胺飼料凈化小 柱；移取上述收集濾液50 μ 1至950 μ 1復(fù)溶工作液中，充分混勻；取50 μ 1用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟[0028]1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20_25°C )平衡30min以上，注意每種 液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記 錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品/樣本加標準品/樣本50μ1到對應(yīng)的微孔中，然后用抗體以10 1 的體積比進行稀釋酶標二抗?jié)饪s液，混合，立即加入混合液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋 板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ 1/孔，充分洗滌 4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、顯色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用 蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。8、測定加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處(建議用雙 波長450/630nm檢測，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止 液用目測法可進行判定)。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與三聚氰胺含量成負相關(guān)。1、用樣本的平均吸光度值與標準品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(μ g/L)。 假設(shè)樣本ι的吸光度值為0. 351，樣本2的吸光度值為0. 801，標準液吸光度值分別是 0 μ g/L 為 2. 014 ； 1 μ g/L 為 1. 518 ;3 μ g/L 為 1. 182 ；9 μ g/L 為 0. 648 ；27 μ g/L 為 0. 287 ； 81 μ g/L為0. 105。則樣本1的濃度范圍是45 μ g/L-135 μ g/L再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即 可得出樣本中三聚氰胺含量的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是15 μ g/L-45 μ g/L再乘以其 對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中三聚氰胺含量的濃度范圍。2、定量分析(1)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即
權(quán)利要求一種三聚氰胺ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告，其特征在于酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被三聚氰胺偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別為7瓶標準品溶液、酶標二抗?jié)饪s液、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標 板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶標 二抗?jié)饪s液用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液 用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色 PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍色帽的半透明PE塑料 瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶標反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔 預(yù)包被三聚氰胺偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液7瓶，Iml/ 瓶；酶標二抗?jié)饪s液1瓶，Iml ；抗體工作液1瓶，7ml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1 瓶，7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶，40ml ；濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測飼料中三聚氰胺含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗?jié)饪s液、三聚氰胺抗體工作液、三聚氰胺7個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)檢報告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的三聚氰胺將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中三聚氰胺的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在三聚氰胺的含量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/543GK201740783SQ20102028418
公開日2011年2月9日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者萬宇平, 何麗霞, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 汪善良, 王建霞, 羅曉琴, 趙正苗 申請人:北京望爾生物技術(shù)有限公司;北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司