專利名稱：一種水產(chǎn)中硝基呋喃類代謝物的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測水產(chǎn)中硝基呋喃類代謝物的快速檢測方法，具體涉及一種檢測水產(chǎn)中呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物以及呋喃它酮代謝物的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
硝基呋喃類藥物是一類人工合成的抗菌藥物，主要指呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林以及呋喃它酮。硝基呋喃類藥物對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用，而且價格低、藥效好，曾經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。大劑量或長時間使用硝基呋喃類藥物均能對養(yǎng)殖動物產(chǎn)生毒性作用和“三致”作用?！叭隆弊饔弥钢掳?、 致畸、致突變作用。硝基呋喃類化合物是直接致變劑，它不用附加外源性激活系統(tǒng)就可以引起細菌的突變。呋喃它酮為強致癌性藥物，呋喃唑酮具中等強度致癌性。高劑量飼喂食用魚和觀賞魚，可誘導(dǎo)魚的肝臟發(fā)生腫瘤。繁殖毒性結(jié)果表明，呋喃唑酮能減少精子的數(shù)量和胚胎的成活率。當含有硝基呋喃類抗生素殘留的水產(chǎn)品為人所食用后，這些代謝物就可以在胃酸作用下從蛋白質(zhì)中釋放而被人體吸收，造成嚴重危害。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)代謝迅速，代謝的部分化合物分子與細胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，可長期保持穩(wěn)定。所以在食品安全的檢測中主要是檢測硝基呋喃代謝物。 近幾年因為硝基呋喃類藥物殘留超標阻礙我國水產(chǎn)品出口貿(mào)易的事例屢見報道。 2002年3月，歐盟以從我國進口的某些水產(chǎn)品測出呋喃西林等硝基呋喃類藥物殘留為原由，開始全面停止進口我國動物源性產(chǎn)品。造成大量產(chǎn)品積壓和企業(yè)停產(chǎn)。2005年11月， 日本對中國大陸和臺灣省的烤鰻分別檢測出硝基呋喃類代謝產(chǎn)物AOZ超標。2006年2月， 寧波慈溪某進出口公司的27. 5t凍烤鰻由于被檢出硝基呋喃類代謝產(chǎn)物AOZ超標，被日本方面全部退回，損失達54. 6萬美元。鑒于硝基呋喃類藥物殘留的嚴重危害，歐盟已于1995年禁止在食用物中使用，并決定自2002年3月開始對進口的食品類產(chǎn)品進行此類藥物的現(xiàn)場檢測。2003年歐盟委員會通過決議，確定水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物及代謝物的限值為不得檢出。我國農(nóng)業(yè)部也于 2002年4月發(fā)布193號公告，公布了《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》，規(guī)定硝基呋喃類抗生素在所有食品動物中禁止使用，2003年又將水產(chǎn)品硝基呋喃代謝物納入殘留監(jiān)控計劃。目前用于檢測此類藥物及其代謝物殘留的方法主要有高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)是目前國內(nèi)測定硝基呋喃類代謝物使用最多、也是比較權(quán)威的方法，靈敏度高、精度高。但該法的樣品前處理相對復(fù)雜，檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多、操作時需要專門的技術(shù)人員，難以滿足現(xiàn)代檢測快速、簡捷、現(xiàn)場化的要求。分光光度法可以判定水產(chǎn)品中是否存在硝基呋喃類代謝物，且不需昂貴的儀器與試劑，樣品前處理操作簡單，有較好的推廣及應(yīng)用價值，缺點是測定結(jié)果準確度較低。酶聯(lián)免疫吸附法是應(yīng)用抗原抗體特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用來測定硝基呋喃類代謝物的免疫分析方法，具有特異性高、靈敏度高、快速、簡便等優(yōu)點。但是ELISA法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，由此易造成測定結(jié)果重復(fù)性較差。此外ELISA試劑壽命短，因此需要低溫保藏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對水產(chǎn)中的硝基呋喃類代謝物殘留展開研究，提供一種用于現(xiàn)場快速篩選水產(chǎn)中呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物以及呋喃它酮代謝物的方法，制備檢測呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物以及呋喃它酮代謝物的免疫膠體金快速檢測試劑板。本發(fā)明試劑板操作簡單便捷，靈敏度高，實驗結(jié)果肉眼可直觀判斷，無需配備儀器設(shè)備，檢測既可在實驗室中進行，也可在野外、水產(chǎn)市場等地方進行， 5-10min完成對樣品中硝基呋喃類代謝物的定性和半定量測定。本發(fā)明制備一種免疫膠體金快速檢測試劑板，試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。其中樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l(wèi)_2mm的重疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應(yīng)時間，樣品墊上的緩沖體系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結(jié)合墊上的金標抗體順利發(fā)生反應(yīng)。膠體金結(jié)合墊上包被有抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜上從樣品 墊到吸水墊方向依次包被有硝基呋喃類代謝物-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質(zhì)控線。偶聯(lián)硝基呋喃類代謝物的載體蛋白可為牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白(OVA)、血藍蛋白(KLH)。本發(fā)明制備一種免疫膠體金快速檢測試劑板，試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測水產(chǎn)中的硝基呋喃類代謝物殘留。如果樣品溶液含有硝基呋喃類代謝物殘留，硝基呋喃類代謝物先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的硝基呋喃類代謝物占據(jù)而無法與檢測線上硝基呋喃類代謝物特異性抗原結(jié)合；當樣品中的硝基呋喃類代謝物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中硝基呋喃類代謝物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。本發(fā)明制備一種免疫膠體金快速檢測試劑板，試劑板的各部分組成成分與功能如下塑料模板，起固定試紙條及標示功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，其上標記有抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，是樣品溶液中的有效成分與金標抗體發(fā)生反應(yīng)的場所。
硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多余的溶液吸收。本發(fā)明試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本發(fā)明試劑板的抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體對硝基呋喃類代謝物的交叉反應(yīng)率均為100%，與其他種類的抗生素包括磺胺類藥物、氯霉素、孔雀石綠等沒有交叉反應(yīng)。(2)靈敏度高。本發(fā)明試劑板的靈敏度可達到0. 5 μ g/kg，符合國家檢測要求，完全可以滿足市場的檢測需求。(3)操作簡便快速。本發(fā)明試劑板將免疫層析反應(yīng)所需的大部分原料已整合到試劑條中，滴樣后抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進行，大大縮短了檢樣時間，滴樣后5 8分鐘內(nèi)即可讀取結(jié)果。本發(fā)明試劑板的操作不需任何專業(yè)培訓(xùn)，普通人員均可操作，只需按說明滴樣后用肉眼判讀即可。(4)不依賴于實驗設(shè)備。本發(fā)明試劑板在直接滴樣跑板后，通過肉眼判斷硝酸纖維素膜上檢測線和控制線的顏色深淺對比來判讀結(jié)果，整個檢測過程無需用到任何實驗設(shè)備，真正做到了對實驗設(shè)備零要求，尤其適合于野外及現(xiàn)場操作，易于推廣。(5)成本低，效益好。本發(fā)明試劑板生產(chǎn)工藝簡單，可實現(xiàn)單個樣本檢測，生產(chǎn)成本低，大大降低了檢測費用。


圖1為硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品墊，2為膠體金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠， 8為PVC板。圖2為硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。具體實施方法本發(fā)明試劑板的制備包括載體蛋白偶聯(lián)物的制備、抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體的制備、膠體金溶液、膠體金標記抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體的制備和硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。1.半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)硝基呋喃類代謝物對醛基苯甲酸衍生物合成稱取3g對醛基苯甲酸于IOmL蒸餾水中，滴加二甲基甲酰胺(DMF)至對醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入l.Og硝基呋喃類代謝物(呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物或者呋喃它酮代謝物)，室溫反應(yīng)2h，過濾水洗得白色固體即為硝基呋喃類代謝物對醛基苯甲酸衍生物。硝基呋喃類代謝物對醛基苯甲酸衍生物-牛血清蛋白(BSA)的合成稱取23. 4mg 硝基呋喃類代謝物對醛基苯甲酸衍生物溶于2mLDMF，攪拌加入27. 5mg的DCC，14. 4mg的 NHS，4°C反應(yīng)過夜，5000r/min離心lOmin，取上清液標記為A液。取170mg的BSA溶于IOmL 0. lmol/L的PBS (pH 8. 0)緩沖溶液，加入ImL的DMF溶解，標記為B液。將A液逐滴加入到B液中，同時攪拌。4°C下密封反應(yīng)4h。5000r/min下離心lOmin，取上清液，4°C下PBS(pH 7. 4)透析3d，每天換液2次。反應(yīng)產(chǎn)物_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ寐亚宓鞍?OVA)替代BSA，采用同樣方法制備硝基呋喃類代謝物對醛基苯甲酸衍生物-卵清蛋白偶聯(lián)物。2.抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強免疫1次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合按常規(guī)方法進行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初篩選擇10mg/L BSA包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠 IgG-HRP(l 1000)，0PD顯色。篩選出的陽性孔再用卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養(yǎng)上清與2X10_3mol/L硝基呋喃類代謝物溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標板中。另外用PBS(0. Olmol/L、pH7. 4)替代硝基呋喃類代謝物溶液作對照，其余步驟同上。若硝基呋喃類代謝物阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經(jīng)2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細胞株擴大培養(yǎng)，細胞濃度達5 X IOVmL時停止換液，細胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細胞株IO7個細胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標記抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體的制備取已制備好的膠體金溶液1001^，用0.111101/1碳酸鉀溶液調(diào)？!1到8.0。邊攪拌邊加入2mg抗硝基呋喃類代謝物單抗，攪拌20min，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇 20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min,棄上清液，加入 IOmL pH 7. 4 的 PBS 緩沖液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用IOmL #2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4) 溶解，用0. 22 μ m無菌過濾器過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝用點膜機把適當濃度的載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質(zhì)控線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標記硝基呋喃類代謝物單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。檢測試劑組成為一個PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. 1樣品制備取一定量的去脂肪組織樣本，用剪刀剪碎，稱取2g剪碎樣本于50mL離心管中，并加入4mL去離子水，0. 5mL lmol/L的鹽酸，0. ImL樣本衍生化試劑，充分混合3min ；60°C水浴條件下孵育lh，取出后加入5mL 0. lmol/L的磷酸氫二鉀，0.4mL lmol/L的氫氧化鈉，6mL 提取劑，充分混合lmin，4000r/min，離心5min，移取上層溶液3mL于5mL離心管中，60°C下空氣吹干，向吹干的試管中加入ImL凈化劑，加蓋振蕩lmin，然后加入0. 3mL復(fù)溶液，充分混勻，4000r/min，離心Imin (或靜置至明顯分層)，吸取0. 1 μ L下層溶液，待檢。6. 2檢測步驟吸取待檢樣品溶液100 μ L滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；結(jié)果應(yīng)在3 5min 讀取，其他時間判讀無效。觀察時，試劑板水平放置于觀察者正面。6. 3結(jié)果判斷讀取結(jié)果時，將試劑板水平置于觀察者正面。陰性㈠T線顯色(檢測線，靠近加樣孔一端)比C線(對照線)深或一樣深，表示樣品中硝基呋喃類代謝物殘留含量低于檢測限或不含硝基呋喃類代謝物殘留。陽性⑴Τ線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中硝基呋喃類代謝物殘留含量高于檢測限，T線顯色比C線越淺，表示樣品中硝基呋喃類代謝物含量越高。無效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新的試劑板重新測試。
權(quán)利要求
1.一種檢測水產(chǎn)中硝基呋喃類代謝物的快速檢測方法，其特征在于所制備的試劑板的醋酸纖維膜上的膠體金結(jié)合墊上包被有抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體-膠體金標記物， 從樣品墊到吸水墊方向依次是檢測線和質(zhì)控線，包被有硝基呋喃類代謝物-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG。
2.如權(quán)利要求1所說的快速檢測方法，其特征在于將膠體金與抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體按一定比例混勻，使膠體金與抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體形成穩(wěn)定的膠體金顆粒，通過濃縮形成抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體_膠體金標記物。
3.如權(quán)利要求書1所說的快速檢測方法，其特征在于檢測線上偶聯(lián)硝基呋喃類代謝物的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血藍蛋白(KLH)。
4.如權(quán)利要求1所說的快速檢測方法，其特征在于樣品中的硝基呋喃類代謝物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性；反之，當樣品中硝基呋喃類代謝物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。
5.如權(quán)利要求1所說的快速檢測方法，其特征在于工藝流程包括制備BSA偶聯(lián)物、制備抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體、制備膠體金溶液、制備膠體金標記抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體和組裝硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板。
全文摘要
本發(fā)明一種檢測水產(chǎn)中硝基呋喃類代謝物的快速檢測方法，具體涉及一種檢測水產(chǎn)中呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物以及呋喃它酮代謝物的快速檢測方法。本發(fā)明制備一種免疫膠體金快速檢測試劑板，試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和質(zhì)控線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需2h，且無需任何昂貴實驗設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合工商部門、檢驗檢疫機構(gòu)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、加工企業(yè)對水產(chǎn)中的硝基呋喃類代謝物進行大規(guī)?？焖贆z測。
文檔編號G01N33/577GK102175866SQ201010619520
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者周崇盈, 張少恩, 桑麗雅 申請人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司