專利名稱：一種乳中尿素定性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，尤其涉及一種高靈敏度、快速檢測(cè)乳中尿素?fù)郊俚姆椒ā?br> 背景技術(shù)：
牛乳中蛋白質(zhì)含量豐富且易被人體吸收，生理利用率可達(dá)85%，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。隨著人們生活水平的提高和消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，人們對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提出了更高的要求，牛乳恰恰是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的食品，因此越來(lái)越多的人開(kāi)始消費(fèi)乳及乳制品。目前檢測(cè)牛乳中蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮儀，是通過(guò)測(cè)定樣品中氮的含量計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，尿素的含氮量為46. 6%，凱氏定氮儀會(huì)將尿素當(dāng)做蛋白質(zhì)來(lái)計(jì)算，所以，某些不法商販為牟取暴利，對(duì)原料乳及成品純牛奶進(jìn)行尿素?fù)郊佟?br> 因此，迫切需要能夠簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)原料乳及成品純牛奶中尿素?fù)郊俚姆椒āＤ壳皺z測(cè)尿素?fù)郊俪Ｓ枚阴Ｒ浑糠?，但是二乙酰一肟并非只與尿素反應(yīng)時(shí)顯色，與瓜氨酸反應(yīng)也有顯色。一些人使用酶解法與納氏試劑作用進(jìn)行鑒定，但是該法需要購(gòu)制分光光度計(jì)，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(王武生，時(shí)振強(qiáng)等，《酶解法檢測(cè)牛奶中的尿素》，食品科學(xué)， 1993 (4):50-52。)。另外有人采用酶解法與苯酚紅進(jìn)行檢測(cè)，苯酚紅顯色的pH值范圍是 6. 8 (黃)-8. 2 (紅)，牛奶本身pH值是6. 4-6. 8，且該方法使用PBS緩沖液進(jìn)行配制，不利于顯色，另外試紙條的保藏性和酶的固定也有一定困難(徐黎，葉興乾等，《原料乳及成品純牛奶中尿素?fù)郊倏焖贆z測(cè)方法的研究》，中國(guó)乳品工業(yè)，2004 (4):34-35。)。中國(guó)專利申請(qǐng) CN 101398386A中還公開(kāi)了采用試紙的檢測(cè)方法，該方法試紙制作過(guò)程復(fù)雜，且尿素酶使用人工方法從植物中提取，難以保證配制的尿素酶濃度穩(wěn)定，導(dǎo)致實(shí)際操作中，各試紙條的顯色時(shí)間不同，影響測(cè)試精度；同時(shí)，牛乳中的蛋白和脂肪會(huì)影響試紙的測(cè)試靈敏度，延緩顯色時(shí)間并提高檢出限。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，保證測(cè)試中顯色反應(yīng)時(shí)間的穩(wěn)定，同時(shí)提高尿素含量測(cè)試的靈敏度。
本發(fā)明提供了一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，包括a.配制濃度為20mg/ml尿素酶溶液，以及使用乙醇配制得到質(zhì)量含量為0.5%溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液；b.使用奶粉和純水配制復(fù)原乳，其中奶粉和純水的質(zhì)量比為1:7，使用現(xiàn)有的方法準(zhǔn)確測(cè)量復(fù)原乳的尿素含量，以確保復(fù)原乳中尿素含量在正常范圍內(nèi)；c.配制尿素溶液，向復(fù)原乳中添加尿素溶液，使得復(fù)原乳中尿素濃度增加0.2g/L，得到陽(yáng)性對(duì)照乳；d.各取ImL待測(cè)乳和陽(yáng)性對(duì)照乳，離心處理待測(cè)乳和陽(yáng)性對(duì)照乳后，分別取經(jīng)過(guò)離心處理的待測(cè)乳和陽(yáng)性對(duì)照乳的上層清液，兩者中均加入40uL尿素酶溶液和20uL溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液，渦旋混勻分別得到待測(cè)乳清液和陽(yáng)性對(duì)照乳清液；e.將待測(cè)乳清液和陽(yáng)性對(duì)照乳清液靜止lmin，并按照如下方法定性判斷待測(cè)乳清液中的尿素含量；ea.若待測(cè)乳清的顏色比陽(yáng)性對(duì)照乳清液的顏色淺，則待測(cè)乳中的尿素含量小于陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量；eb.若待測(cè)乳清的顏色比陽(yáng)性對(duì)照乳清液的顏色深或顏色一致，則待測(cè)乳中的尿素含量大于或等于陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量。
在一種乳中尿素定性檢測(cè)方法的再一種示意性的實(shí)施方式中，步驟c中離心處理的條件為lOOOOrpm，持續(xù)20min。
在一種乳中尿素定性檢測(cè)方法的另一種示意性的實(shí)施方式中，步驟d中所述渦旋混勻的時(shí)間為k。
使用一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，不需要制作試紙等復(fù)雜工藝，所用的尿素酶不需要從植物種子提取，從廠家直接購(gòu)買高純度的尿素酶產(chǎn)品，稀釋使用，成本低，性能穩(wěn)定， 只需要配置簡(jiǎn)單試劑，檢測(cè)時(shí)間穩(wěn)定且用時(shí)短，用肉眼判斷即可。
使用一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，通過(guò)離心處理待測(cè)乳得到乳清的方式，避免了待測(cè)乳中蛋白質(zhì)和脂肪(尤其是使用涂有尿素酶的試紙條)對(duì)尿素酶催化作用的阻礙，提高了測(cè)試的靈敏度，降低了尿素的檢出限。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的方法做更詳細(xì)的說(shuō)明。
一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，包括如下所述的步驟。
a.配制濃度為20mg/ml尿素酶溶液，以及使用乙醇配制得到質(zhì)量含量為0. 5%溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液。例如在一種示意性實(shí)施方式中，稱取20mg尿素酶，加入Iml三級(jí)水，制成20mg/ml尿素酶溶液；稱取0. 5g溴百里香酚藍(lán)，加入IOOml乙醇，制成質(zhì)量含量約為0. 5%溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液。
b.使用奶粉和純水配制復(fù)原乳，其中所述奶粉和所述純水的質(zhì)量比為1:7，使用現(xiàn)有的方法準(zhǔn)確測(cè)量復(fù)原乳的尿素含量，以確保所述復(fù)原乳中尿素含量在正常范圍內(nèi)。例如在一種示意性實(shí)施方式中，稱取Ig奶粉加入7ml三級(jí)水，渦旋混勻，制成復(fù)原乳，用酶解法檢測(cè)其中的尿素含量為0. 25g/L。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，正常的牛乳中也含有尿素，尿素的含量一般在0. 21 0. ;34g/L 的范圍內(nèi)(J. S. jonker, R. A. Kohn, R. A. Erdman, Using mile urea nitrogen to predict nitrogen excretion and utilization efficiency in lactating dairy cows, Journal of Dairy Science, 1998，81(10) :2682-2692)。
c.配制尿素溶液，向復(fù)原乳中添加制得的尿素溶液，使得復(fù)原乳中的尿素濃度增加0.2g/L，得到陽(yáng)性對(duì)照乳。例如在一種示意性實(shí)施方式中，稱取0. Ig尿素，加入IOml三級(jí)水，制成10g/L尿素溶液；吸取980uL復(fù)原乳，加入20uL的10g/L尿素溶液，混勻，使得復(fù)原乳中尿素濃度增加0. 2g/L，即得到尿素含量為0. 45g/L陽(yáng)性對(duì)照乳。當(dāng)然也可以配制其他濃度的尿素溶液，只要改變加入尿素溶液的量，保證復(fù)原乳中尿素的濃度增加0. 2g/L即可。
d.各取ImL待測(cè)乳和陽(yáng)性對(duì)照乳，離心處理后分別取上層清液，均加入40uL尿素酶溶液和20uL溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液，渦旋混勻后分別得到待測(cè)乳清液和陽(yáng)性對(duì)照乳清液。例如在一種示意性實(shí)施方式中，各量取Iml待測(cè)乳和陽(yáng)性對(duì)照乳，以IOOOOrpm高速離心 20min;分別取離心后的上清液，然后均加入40uL尿素酶溶液和20uL溴百里香酚藍(lán)溶液，渦旋k混勻，得到待測(cè)乳清液和陽(yáng)性對(duì)照乳清液。
e.將待測(cè)乳清液和陽(yáng)性對(duì)照乳清液靜止lmin，并按照如下方法定性判斷待測(cè)乳清液中的尿素含量。
ea.若待測(cè)乳清的顏色比陽(yáng)性對(duì)照乳清液的顏色淺，則說(shuō)明待測(cè)乳中的尿素含量小于陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量。例如在一種示意性實(shí)施方式中，陽(yáng)性對(duì)照乳清液為藍(lán)色，待測(cè)乳清為黃綠色，說(shuō)明待測(cè)乳中的尿素含量小于陽(yáng)性對(duì)照乳中0. 45g/L的尿素含量。
eb.若待測(cè)乳清的顏色比陽(yáng)性對(duì)照乳清液的顏色深或顏色一致，則說(shuō)明待測(cè)乳中的尿素含量大于或等于陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量。例如在另一種示意性實(shí)施方式中， 陽(yáng)性對(duì)照乳清液為藍(lán)色，待測(cè)乳清為深藍(lán)色，說(shuō)明待測(cè)乳中的尿素含量大于陽(yáng)性對(duì)照乳中 0. 45g/L的尿素含量，此時(shí)可以認(rèn)為待測(cè)乳中存在著非正常來(lái)源的尿素，典型的情況通常是尿素?fù)郊佟?br> 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，若有水存在，尿素在尿素酶的特異催化作用下，分解釋放出二氧化碳和氨氣，由于氨氣的作用使得待測(cè)乳的PH值由酸變堿(正常的乳液pH值范圍在6. 3飛.8之間，低于6. 3則乳液已經(jīng)酸敗，而高于6. 8則是酸敗后的乳液加堿矯正過(guò))，從而和待測(cè)乳中預(yù)先加入的PH指示劑發(fā)生顏色變化。由于待測(cè)乳中存在大量的蛋白質(zhì)和脂肪，它們的存在會(huì)阻礙尿毒酶的催化作用以及PH指示劑的顯色反應(yīng)，從而延緩了尿素與水的反應(yīng)，使得PH指示劑的顏色變化變慢；同時(shí)乳中蛋白質(zhì)和脂肪的阻礙會(huì)導(dǎo)致尿素測(cè)試靈敏度的降低，導(dǎo)致尿素的檢出限變高。尤其當(dāng)使用涂有或浸泡過(guò)尿素酶的試紙時(shí)，蛋白質(zhì)和脂肪會(huì)附著在試紙的微孔隙中，阻礙尿素進(jìn)入試紙的孔隙與尿素酶接觸，從而嚴(yán)重的影響了尿素與水的反應(yīng)。
通過(guò)對(duì)待測(cè)乳高速離心，可以分離其中大部分脂肪和蛋白質(zhì)，使得待測(cè)乳中的尿素可以與后加入的尿素酶充分接觸，加快尿素與水的反應(yīng)，并保證反應(yīng)充分進(jìn)行，從而提高了尿素測(cè)量的靈敏度，降低了檢出限。另外，通過(guò)向尿素含量在正常范圍內(nèi)的復(fù)原乳中添加尿素溶液，使得復(fù)原乳中的尿素含量增加到0. 4Γ0. Mg/L，且在尿素含量為0. 41 g/L就能出現(xiàn)PH指示劑的顯色反應(yīng)，并隨著尿素含量的增加pH指示劑的顯色加深，即檢驗(yàn)靈敏度為 0.41 g/L，且檢出限小于0. g/L。相比于背景技術(shù)中提及的其他測(cè)試方法，以上所述的檢測(cè)方法檢出限低，檢測(cè)靈敏度高。
使用如上所述的檢測(cè)方法，不需要制作試紙等復(fù)雜工藝，所用的尿素酶不需要從植物種子提取，從廠家直接購(gòu)買高純度的尿素酶產(chǎn)品，稀釋使用，成本低，性能穩(wěn)定，只需要配置簡(jiǎn)單試劑，檢測(cè)時(shí)間短，用肉眼判斷即可。
另外，通過(guò)離心處理待測(cè)乳得到乳清的方式，避免了待測(cè)乳中蛋白質(zhì)和脂肪(尤其是使用涂有尿素酶的試紙條)對(duì)尿素酶催化作用的阻礙，提高了測(cè)試的靈敏度，降低了尿素的檢出限，對(duì)乳品企業(yè)奶源質(zhì)量和消費(fèi)者飲用“放心奶”、“安全奶”均能起到有力的保證作用，有利于保證消費(fèi)者的健康，保證消費(fèi)者的合法權(quán)益及消費(fèi)市場(chǎng)的有序競(jìng)爭(zhēng)和良性發(fā)展， 保障人們物質(zhì)生活質(zhì)量。
在本文中，“示意性”表示“充當(dāng)實(shí)例、例子或說(shuō)明”，不應(yīng)將在本文中被描述為“示意性”的任何圖示、實(shí)施方式解釋為一種更優(yōu)選的或更具優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)方案。
上文所列出的一系列的詳細(xì)說(shuō)明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施例的具體說(shuō)明， 它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施例或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，包括a.配制濃度為20mg/ml尿素酶溶液，以及使用乙醇配制得到質(zhì)量含量為0.5%的溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液；b.使用奶粉和純水配制復(fù)原乳，其中所述奶粉和所述純水的質(zhì)量比為1:7，使用現(xiàn)有的方法準(zhǔn)確測(cè)量所述復(fù)原乳的尿素含量，以確保所述復(fù)原乳中尿素含量在正常范圍內(nèi)；c.配制尿素溶液，向所述復(fù)原乳中添加所述尿素溶液，使得所述復(fù)原乳中尿素濃度增加0. 2g/L，得到陽(yáng)性對(duì)照乳；d.各取ImL待測(cè)乳和所述陽(yáng)性對(duì)照乳，離心處理所述待測(cè)乳和所述陽(yáng)性對(duì)照乳后，分別取經(jīng)過(guò)離心處理的所述待測(cè)乳和所述陽(yáng)性對(duì)照乳的上層清液，兩者中均加入40uL所述尿素酶溶液和20uL所述溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液，渦旋混勻分別得到待測(cè)乳清液和陽(yáng)性對(duì)照乳清液；e.將所述待測(cè)乳清液和所述陽(yáng)性對(duì)照乳清液靜止lmin，并按照如下方法定性判斷所述待測(cè)乳清液中的尿素含量；ea.若所述待測(cè)乳清的顏色比所述陽(yáng)性對(duì)照乳清液的顏色淺，則所述待測(cè)乳中的尿素含量小于所述陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量；eb.若所述待測(cè)乳清的顏色比所述陽(yáng)性對(duì)照乳清液的顏色深或顏色一致，則所述待測(cè)乳中的尿素含量大于或等于所述陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中步驟c中所述離心處理的條件為IOOOOrpm，持續(xù) 20min。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中步驟d中所述渦旋混勻的時(shí)間為^。
全文摘要
一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，包括配制尿素酶溶液和溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液；使用奶粉和純水配制復(fù)原乳，確保復(fù)原乳中尿素含量在正常范圍內(nèi)；配制尿素溶液，向復(fù)原乳中添加尿素溶液，得到陽(yáng)性對(duì)照乳；各取待測(cè)乳和陽(yáng)性對(duì)照乳，離心處理待測(cè)乳和陽(yáng)性對(duì)照乳后，得到上層清液，兩者中均加入尿素酶溶液和溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液得到待測(cè)乳清液和陽(yáng)性對(duì)照乳清液；按照如下方法定性判斷待測(cè)乳清液中的尿素含量待測(cè)乳清的顏色比陽(yáng)性對(duì)照乳清液的顏色淺，則待測(cè)乳中的尿素含量小于陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量；顏色深或顏色一致，則待測(cè)乳中的尿素含量大于或等于陽(yáng)性對(duì)照乳中的尿素含量。一種乳中尿素定性檢測(cè)方法，成本低，性能穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)間穩(wěn)定。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102539421SQ20101059741
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者劉志楠, 劉曉川, 喻東威, 李梅, 薛志清, 趙源 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司