專利名稱：一種改性多孔板的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械改性領(lǐng)域和納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種在酶標(biāo)板表面修飾 納米金粒子層的方法，采用修飾了納米金粒子層的多孔板(包括酶標(biāo)板)可顯著提高傳統(tǒng) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測(cè)限。
背景技術(shù)：
在基于固相載體的多種免疫診斷領(lǐng)域中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試(ELISA)作為一種最 重要的疾病診斷技術(shù)具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，低成本，適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用 于科研及醫(yī)療領(lǐng)域。然而，對(duì)于很多惡性疾病的早期階段，血液中相關(guān)特征蛋白含量極其微量，往往低 于市售的商品化ELISA試劑盒的檢測(cè)限。其中一個(gè)重要原因在于，市售ELISA試劑盒中酶 標(biāo)板由于自身理化性質(zhì)的局限，而使得其對(duì)樣品中疾病特征抗原的結(jié)合量較低，結(jié)合上的 抗原表位的暴露不充分。因此，對(duì)酶標(biāo)板表面進(jìn)行改性以提高單位面積特征抗原的結(jié)合量 并促進(jìn)抗原表位的充分暴露已成為提高檢測(cè)限的必然途徑?，F(xiàn)有技術(shù)中，常用的方法有以下幾種(1)通常采用紫外照射法，等離子體處理法等方法來處理酶標(biāo)板表面以提高其對(duì) 抗原的結(jié)合能力；但這種方法都需要特殊設(shè)備，成本高，操作較為復(fù)雜，此外，這些方法改性 后的表面只能一定程度上增加抗原的結(jié)合量，并不能促進(jìn)抗原表位的充分暴露。(2)而珠式、管式及磁性球ELSIA法雖然可以解決這一問題，但是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程復(fù) 雜，成本高，需要特殊的儀器設(shè)備。因此，需要研發(fā)一種成本低且工藝簡(jiǎn)單的修飾改性多孔板(包括酶標(biāo)板)的方法， 使得改性后的多孔板對(duì)樣品中疾病特征抗原的結(jié)合量提高，能充分暴露結(jié)合上的抗原表 位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改性多孔板的制備方法，得改性后的多孔板對(duì)樣品中疾 病特征抗原的結(jié)合量提高，能充分暴露結(jié)合上的抗原表位。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種改性多孔板的制備方法，包括以下 步驟(1)在0 25°C范圍內(nèi)，配制含有碳酸氫鉀、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用堿溶 液將溶液PH調(diào)節(jié)至8. 0 10. 0，然后在0 4°C冷卻；最終所得溶液中，碳酸氫鉀、葡萄糖、 氯酸金的終濃度依次為20-60mg/mL，2-8mg/mL，2-8mg/mL ；(2)以每孔50 250 μ L的量，將步驟(1)所得溶液加入到多孔板的孔中，然后于 25 50°C下加熱1 6小時(shí)，棄去孔中溶液，再用去離子水沖洗至少2次后，即制得穩(wěn)定的 納米金顆粒聚集體修飾的多孔板。上述技術(shù)方案中，碳酸氫鉀、葡萄糖，氯金酸粉末均為分析純，所用溶劑水為去離子水。上述技術(shù)方案中，所述堿溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的中強(qiáng)堿，不與反應(yīng)體系中 物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)且能將最終溶液的PH值調(diào)節(jié)到8. 0 10. 0即可，如氫氧化鈉、氫氧化鉀或碳 酸鈉。上述技術(shù)方案中，所述多孔板包括商用384孔板、96孔組織培養(yǎng)板、96孔酶標(biāo)板、 可拆卸的酶標(biāo)板、48孔組織培養(yǎng)板或M孔組織培養(yǎng)板等。本發(fā)明的原理是采用化學(xué)還原的方法生成金納米粒子并通過物理沉降作用吸附 在多孔板(包括酶標(biāo)板)表面形成穩(wěn)定、形貌均一的納米金顆粒聚集層，由于這種納米金聚 集層巨大的比表面積和獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，這種經(jīng)過修飾的表面可以提高蛋白結(jié)合量，因此， 修飾后的多孔板可以實(shí)現(xiàn)超高靈敏度的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試。由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出特點(diǎn)1.本發(fā)明所述技術(shù)方案中，配制好反應(yīng)溶液后，將溶液于冰浴中冷卻平衡至低溫， 然后再將這種冷卻的反應(yīng)液加入到微孔板中，然后將微孔板置于25 50°C下反應(yīng)；由于進(jìn) 行了低溫冷卻操作，降低了溶液中初始氧化還原反應(yīng)速率，從而有利于形成粒徑較小的金 納米粒子，這種最初形成的極細(xì)粒徑的金納米粒子與高溫時(shí)反應(yīng)生成的較大粒徑的金納米 粒子聚集體相比更容易在微孔板表面形成穩(wěn)定，致密的吸附層；反應(yīng)過程中，隨著微孔板內(nèi) 反應(yīng)液溫度達(dá)到25 50°C時(shí)，溶液反應(yīng)速率增大，后續(xù)快速形成的金納米粒子以先前沉積 的小金納米粒子為晶種，在其表面發(fā)生聚集，并最終形成了我們所得到的穩(wěn)定的金膜。2.本發(fā)明所述技術(shù)方案中，選擇pH值8-10的條件進(jìn)行金納米粒子的均勻沉積，較 低的PH值不能及時(shí)消除反應(yīng)產(chǎn)成的酸性物質(zhì)，阻礙了反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行；而較高的pH值導(dǎo) 致金納米粒子的快速生成和團(tuán)聚。因此，只有PH值8-10的條件才能在微孔板表面產(chǎn)生穩(wěn) 定均勻的金膜。3.本發(fā)明所述修飾多孔板的方法無污染，低成本，工藝簡(jiǎn)單，工藝過程容易控制， 整個(gè)制備反應(yīng)過程溫度不超過50°C ；利用本方法制備的納米金聚集層修飾的多孔板，可以 根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需要，來進(jìn)行多種形式的免疫檢測(cè)。如在本發(fā)明制備的多孔板表面上吸附上 含待測(cè)抗原的樣本就可以進(jìn)行間接法或競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)；預(yù)先吸附上檢測(cè)特征抗原的抗體就可 以進(jìn)行雙抗體夾心法檢測(cè)。4.本發(fā)明對(duì)材料的適用性好，材料可以是各種常見的多孔板，如商用384孔板，96 孔組織培養(yǎng)板，96孔酶標(biāo)板、可拆卸的酶標(biāo)板，48孔組織培養(yǎng)板或M孔組織培養(yǎng)板。5.本方法為純粹的化學(xué)方法，不需要紫外光照，等離子體等昂貴設(shè)備處理，經(jīng)濟(jì) 可行；采用化學(xué)還原的方法生成金納米粒子并通過物理沉降作用吸附在多孔板(包括酶標(biāo) 板)表面形成穩(wěn)定、形貌均一的納米金顆粒聚集層，由于這種納米金聚集層巨大的比表面 積和獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，這種經(jīng)過修飾的表面可以提高蛋白結(jié)合量，因此，修飾后的多孔板可 以實(shí)現(xiàn)超高靈敏度的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試。


圖1中為實(shí)施例一中利用間接法ELISA分別于普通96孔高吸附酶標(biāo)板以及經(jīng)過 納米金聚集層修飾過的酶標(biāo)板(由100 μ L工作液形成)檢測(cè)單一抗凝血酶溶液中抗凝血 酶含量的結(jié)果對(duì)比；
圖2中為實(shí)施例二中利用間接法ELISA分別于普通96孔高吸附酶標(biāo)板以及經(jīng)過 納米金聚集層修飾過的酶標(biāo)板(由250 μ L工作液形成)檢測(cè)人血漿稀釋液中抗凝血酶含 量的結(jié)果對(duì)比。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例提供了金納米顆粒修飾多孔板的制備方法，以及修飾后的多孔板在疾 病診斷中的應(yīng)用，是通過化學(xué)方法在普通多空板表面形成三維的金納米顆粒聚集層，再以 這種經(jīng)過修飾的多孔板進(jìn)行超低檢測(cè)限的間接法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例一(1)將0. 3g碳酸氫鉀(分子量100)，0. 03g葡萄糖(分子量198)，30mg氯金酸粉 末溶解于6mL去離子水中，并用氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)到9. 0。(2)吸取該工作溶液100 μ L加入酶標(biāo)板中，再將酶標(biāo)板置于25°C烘箱中反應(yīng)6小 時(shí)。棄去孔中反應(yīng)液，再用去離子水沖洗3次即制得納米金顆粒聚集體修飾的酶標(biāo)板。(3)將人抗凝血酶用碳酸鹽緩沖液(pH = 9. 6)進(jìn)行逐級(jí)稀釋，得到濃度依次為 96ng/mL, 19. 2g/mL, 3. 84ng/mL,0. 768ng/mL的蛋白溶液。以每孔100 μ L用量將上述梯度溶 液包被于普通酶標(biāo)板和經(jīng)過修飾的酶標(biāo)板中，于37°C烘箱溫育2小時(shí)。棄去板中包被溶液， 用洗板液洗滌3次后于吸水紙上拍干多孔板中殘余液體，以每孔300 μ L加入含1. 5%牛血 清白蛋白的封閉液，于37°C封閉1小時(shí)。棄去封閉液，于吸水紙上拍干多孔板中殘余液體。 每孔加入100 μ L羊抗人抗凝血酶抗體稀釋液(1 1000稀釋)，于37°C溫育1小時(shí)。棄去 板中抗體溶液，用洗板液洗滌5次后于吸水紙上拍干多孔板中殘余液體。每孔加入100 μ L 堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗羊二抗稀釋液(1 2500稀釋)，于37°C溫育1小時(shí)。棄去板中抗 體溶液，用洗板液洗滌5次后于吸水紙上拍干多孔板中殘余液體。每孔加入100μ Llmg/mL 對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液后，于37。C反應(yīng)15分鐘后每孔加入50 μ L 2mol/L的氫氧化鈉水溶 液終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板中顯色溶液以每孔IOOyL轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板空白孔中。在酶標(biāo)儀上于 405nm讀取各孔吸光值。結(jié)果如圖1所示，普通酶標(biāo)板的檢測(cè)限是1. 92ng，而經(jīng)過修飾的酶標(biāo)板的檢測(cè)限 為0. 0768ng(S/N = 2，吸光值彡0. 1被認(rèn)為是有效信號(hào))?？梢娊?jīng)過修飾的酶標(biāo)板顯著放 大了信號(hào)，降低了檢測(cè)限。實(shí)施例二(1)將0. 3g碳酸氫鉀(分子量100)，0. 03g葡萄糖(分子量198)，30mg氯金酸粉 末溶解于6mL去離子水中，并用氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)到9. 0。(2)吸取該工作溶液250 μ L加入酶標(biāo)板中，再將酶標(biāo)板置于50°C烘箱中反應(yīng)1小 時(shí)。棄去孔中反應(yīng)液，再用去離子水沖洗3次即制得納米金顆粒聚集體修飾的酶標(biāo)板。(3)將人血漿用碳酸鹽緩沖液(pH = 9.6)進(jìn)行逐級(jí)稀釋稀釋，稀釋度依次為 1 100，1 500，1 2500，1 12500，1 62500，然后以每孔 100 μ L 包被于普通酶標(biāo)板 及經(jīng)過修飾的酶標(biāo)板中，于37°C烘箱溫育2小時(shí)。棄去板中包被溶液，用洗板液洗滌3次后 于吸水紙上拍干多孔板中殘余液體，以每孔300 μ L加入含1.5%牛血清白蛋白的封閉液， 于37°C封閉1小時(shí)。棄去封閉液，于吸水紙上拍干多孔板中殘余液體。每孔加入100 μ L羊抗人抗凝血酶抗體稀釋液，于37°C溫育1小時(shí)。棄去板中抗體溶液，用洗板液洗滌5次后于 吸水紙上拍干多孔板中殘余液體。每孔加入100 μ L堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗羊二抗稀釋液， 于37°C溫育1小時(shí)。棄去板中抗體溶液，用洗板液洗滌5次后于吸水紙上拍干多孔板中殘 余液體。每孔加入100 μ L lmg/mL對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液后，于37。C反應(yīng)15分鐘后每孔加 入50 μ L 12mol/L的氫氧化鈉水溶液終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板中顯色溶液以每孔100 μ L轉(zhuǎn)移 至酶標(biāo)板空白中。在酶標(biāo)儀上于405nm讀取各孔吸光值。 結(jié)果如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)所采用的稀釋度范圍內(nèi)普通酶標(biāo)板不能得到有效信號(hào)， 而經(jīng)過修飾的酶標(biāo)板在稀釋度為1 500時(shí)仍能得到有效信號(hào)(S/N = 2，吸光值彡0. 1被 認(rèn)為是有效信號(hào))。可見對(duì)于混合蛋白溶液，經(jīng)過修飾的酶標(biāo)板仍然可以顯著放大信號(hào)，從 而檢測(cè)出極低含量的蛋白。
權(quán)利要求
1.一種改性多孔板的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)在0 25°C范圍內(nèi)，配制含有碳酸氫鉀、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用堿溶液將 溶液PH調(diào)節(jié)至8. 0 10. 0，然后在0 4°C冷卻；最終所得溶液中，碳酸氫鉀、葡萄糖、氯金 酸的終濃度依次為20-60mg/mL，2-8mg/mL，2-8mg/mL ；(2)以每孔50 250μ L的量，將步驟(1)所得溶液加入到多孔板的孔中，然后于25 50°C下加熱1 6小時(shí)，棄去孔中溶液，再用去離子水沖洗2 3次后，即制得穩(wěn)定的納米 金顆粒聚集體修飾的多孔板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述堿溶液選自氫氧化鈉、氫氧化鉀 或碳酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械改性領(lǐng)域和納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種改性多孔板的制備方法，包括以下步驟(1)在0～25℃范圍內(nèi)，配制含有碳酸氫鉀、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用堿溶液將溶液pH調(diào)節(jié)至9.0～10.0，然后冷卻；(2)以每孔50～250μL的量，將步驟(1)所得溶液加入到多孔板的孔中，然后于25～50℃下加熱1～6小時(shí)，棄去孔中溶液，再用去離子水沖洗2～3次后，即制得穩(wěn)定的納米金顆粒聚集體修飾的多孔板。本發(fā)明采用化學(xué)還原的方法生成金納米粒子并通過物理沉降作用吸附在多孔板表面形成穩(wěn)定、形貌均一的納米金顆粒聚集層，由于這種納米金聚集層巨大的比表面積和獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，這種經(jīng)過修飾的表面可以提高蛋白結(jié)合量，因此，修飾后的多孔板可以實(shí)現(xiàn)超高靈敏度的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102072955SQ20101053294
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者周峰, 袁琳, 陳紅 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)