專利名稱：一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。這種試劑盒的檢 測(cè)方法，主要是將檢測(cè)樣品用預(yù)處理液和液化劑作均相化處理，再使用稀釋液稀釋后作離 心沉淀制片，得到多張病原菌液基薄層涂片，然后進(jìn)行鑒別染色，根據(jù)病原菌的染色反應(yīng)、 形態(tài)和排列方式就可對(duì)樣品中多種病原菌作出快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
呼吸系統(tǒng)感染是一種較為常見的疾病。在肺部感染的各種病原中，以細(xì)菌占首位 (成人約占80%，兒童約占60% )，其次為病毒、支原體等(叢玉隆主編，醫(yī)家金鑒，檢驗(yàn)醫(yī) 學(xué)卷(下)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，PP 974-981)。在上呼吸道感染中較重要的肺炎鏈球菌 在人體抵抗力降低時(shí)引起疾病，尤其對(duì)老人和兒童，最嚴(yán)重可致肺炎、菌血癥、腦膜炎、中耳 炎、鼻竇炎等。在醫(yī)院內(nèi)感染所致的細(xì)菌性肺炎中，肺炎球菌約占30%，金黃色葡萄球菌約 占10%，而需氧革蘭染色陰性桿菌(綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、 腸原桿菌、硝酸鹽陰性桿菌等)則增至約50%。其余為耐青霉素G的金黃色葡萄球菌、真 菌和病毒，一些以往較少報(bào)道的如軍團(tuán)菌等相繼出現(xiàn)，革蘭染色陰性桿菌肺炎的病死率仍 高(30-40% )，老年及危重患者尤為難治。近年來肺真菌病發(fā)病率也逐漸上升，如白色念珠 菌、曲霉菌、放線菌等。在痰液樣品中檢查病原菌的傳統(tǒng)方法是直接涂片法，因該方法簡(jiǎn)便易行，是目前 各實(shí)驗(yàn)室一個(gè)重要的檢查手段。該方法是將經(jīng)部分挑選的痰液樣品手工涂在玻片上，然后 通過痰液樣品的鑒別染色觀察結(jié)果。鑒別染色對(duì)于大多數(shù)病原體的初步分類有極大的幫 助，革蘭染色和抗酸染色是鑒別染色的范例，但革蘭染色只能用于少數(shù)例如肺炎鏈球菌和 白色念珠菌的鑒定，抗酸染色也僅用于特殊的細(xì)菌群如分枝桿菌屬等的鑒定。該方法的缺 點(diǎn)是涂片不均勻，背景較臟，檢測(cè)靈敏度低，這主要是被痰液以及被細(xì)胞包裹的病原菌不易 釋放，能檢測(cè)出的病原菌數(shù)量較少的原因。因此目前臨床診斷治療時(shí)主要還是依靠培養(yǎng)鑒 定方法，但是培養(yǎng)鑒定所需時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足臨床的快速需要。在實(shí)驗(yàn)室中常用人體脫落細(xì)胞液基薄層涂片技術(shù)用于腫瘤細(xì)胞的形態(tài)觀察，例如 宮頸癌和肺癌病理細(xì)胞的診斷。其通常的操作步驟是先將檢測(cè)樣品例如采樣后的宮頸刷或 痰液放入含有酒精成分的細(xì)胞保存液中，完成樣品中脫落細(xì)胞形態(tài)的固定和均相化，以防 止脫落細(xì)胞的自我降解。再將上述已經(jīng)均相化的檢測(cè)樣品和粘附劑混合后加入到離心沉淀 制片組合中(離心沉淀制片組合是由中空離心管的底部和在其下面的載玻片無縫連接，并 共同固定在甩片架底座上組成)，并放入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以小于1，000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速 離心進(jìn)行離心沉淀制片。在離心沉淀制片過程中完成對(duì)人體脫落細(xì)胞的濃縮并使之黏附在 載玻片上，得到分布均勻的細(xì)胞薄層涂片。離心結(jié)束后棄上層液并將離心沉淀制片組合倒 扣浙干，卸下載玻片烘干。然后進(jìn)行鑒別染色，通常一個(gè)樣品得到一張涂片，做一種染色即 可。例如需要觀察宮頸癌細(xì)胞常用巴氏染色，肺癌細(xì)胞常用HE染色。為了解決目前臨床上 存在的不能為含有病原菌的樣品快速靈敏地提供病原菌感染檢測(cè)結(jié)果的問題，本發(fā)明在上述人體脫落細(xì)胞液基薄層涂片技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，提供一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè) 試劑盒及其檢測(cè)方法，可對(duì)樣品中多種病原菌作出快速檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明病原菌液 基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處理液，液化劑，稀釋液，鑒別染色液和耗材組成。這種病原 菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，是在檢測(cè)樣品中加入強(qiáng)堿性液基細(xì)胞學(xué)病原菌樣 品預(yù)處理液和液化劑，通過攪拌實(shí)現(xiàn)樣品的均相化。再使用稀釋劑對(duì)已液化的樣品進(jìn)行稀 釋后，作離心沉淀制片，得到多張分布均勻的病原菌液基薄層涂片。然后進(jìn)行鑒別染色，根 據(jù)病原菌的染色反應(yīng)、形態(tài)學(xué)和排列方式就可對(duì)檢測(cè)樣品中多種病原菌作出快速靈敏的檢 測(cè)。本發(fā)明病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法包含下列步驟(1)取樣取含病原菌的樣品。樣品可以是痰液、支氣管灌洗物、胸腹水、膿液和創(chuàng)傷感染組 織、腦脊液、關(guān)節(jié)液、尿液或糞便。如果是痰液，則可取其全部作為樣品。如果是體積較大的 液態(tài)樣品，則可取其部分作為檢測(cè)樣品。糞便則在去污萃取后，和尿液一樣再通過高速離心 取得病原菌樣品。樣品中含有的病原菌主要是二類(a)細(xì)菌例如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、 結(jié)核桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、軍團(tuán)菌、B型流感嗜血桿菌、鮑曼不動(dòng)桿 菌、肺炎克雷伯菌、腸原桿菌、硝酸鹽陰性桿菌等；(b)真菌例如白色念珠菌、曲霉菌、放線 菌等。(2)樣品的均相化處理在樣品中以樣品和預(yù)處理液1 3-20的體積比加入預(yù)處理液，以樣品和液化劑 1 0-5的體積比加入液化劑，和磁力攪拌子一起放在磁力攪拌儀上加熱45-65°C攪拌5-30 分鐘，轉(zhuǎn)速為1，000-2，000轉(zhuǎn)/分，進(jìn)行樣品的均相化處理，加熱攪拌能加速液化。預(yù)處理 液是取之于由5-50ml氨水(密度0. 88g/ml) U-IOg氯化鈉及余量為水配制的IOOml混合 液。液化劑可以是蛋白酶，例如0. 5-5重量％糜蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶，也可以是 巰基還原劑，例如濃度為3. 0-30. Omg/ml巰基乙醇、濃度為4. 0-40. Omg/ml β -巰基乙醇、 濃度為3. 5-35. Omg/ml 1,4- 二巰基丁二醇、濃度為4. 5-45. Omg/ml 二硫赤蘚糖醇、濃度為 5. 0-50. Omg/ml 二硫蘇糖醇等。樣品的均相化處理使樣品發(fā)生物理變性和化學(xué)變性。物理變性主要是對(duì)粘稠液例 如痰液、腦脊液等樣品進(jìn)行加熱攪拌剪切實(shí)現(xiàn)勻漿化。液化劑作為化學(xué)變性劑，能打開樣品 中蛋白間的化學(xué)鍵，特別是肽鍵、氫鍵和二硫鍵，增加樣品的水溶性，讓被蛋白包裹的病原 菌從中釋放。強(qiáng)堿性的預(yù)處理液能裂解樣品中的脫落細(xì)胞特別是肺泡巨噬細(xì)胞膜和中性粒 細(xì)胞等白細(xì)胞，讓被細(xì)胞包裹的病原菌從中釋放，例如結(jié)核桿菌和軍團(tuán)菌?？梢罉悠返恼吵?程度加入液化劑，如果粘稠程度高體積大，可多加些液化劑，如果是胸腹水或尿液，液化劑 的使用量可適當(dāng)減少或不加。所述的預(yù)處理液和液化劑分開包裝，并在使用時(shí)混合，是為了 防止液化劑失活。(3)液基離心沉淀薄層制片
取上述已均相化的樣品和稀釋液按1 0-6的體積比混合，加入離心沉淀制片組 合中的離心管中。稀釋液為0.5-5重量％的氯化鈉溶液，能使背景干凈和有利于樣品中病 原菌的形態(tài)固定和檢測(cè)，但對(duì)于已經(jīng)很稀薄的樣品，例如支氣管灌洗物，就不需用稀釋液稀 釋。離心沉淀制片組合是由中空離心管的底部和在其下面的載玻片無縫連接，并共同固 定在甩片架底座上組成。然后將離心沉淀制片組合分別放入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以 1，000-3, 000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心5-15分鐘，在離心沉淀制片過程中完成對(duì)病原菌的濃縮和形 態(tài)固定并使之黏附在載玻片上，得到多張分布均勻的薄層涂片。離心結(jié)束后棄上層液，將離 心沉淀制片組合倒扣浙干水分，卸下載玻片30-70°C烘3-10分鐘。樣品中的細(xì)菌個(gè)體很小， 不容易沉淀黏附在玻片上，因此需要較高的離心轉(zhuǎn)速(1，000-3, 000轉(zhuǎn)/分)。如同一樣品 一次所需離心制片的數(shù)量超過吊藍(lán)能存放的數(shù)量，可作兩次以上離心即可得到。(4)鑒別染色在含同一樣品的多張載玻片上鑒別染色使用何種染色液進(jìn)行反應(yīng)，依據(jù)細(xì)菌種類 和可檢出的特點(diǎn)，例如特有的形態(tài)、特有蛋白或抗原，鑒別染色可采用常規(guī)的化學(xué)染色法或 免疫染色法?；瘜W(xué)染色法例如依據(jù)革蘭染色呈陽性的肺炎鏈球菌有莢膜和白色念珠菌有念珠 狀典型形態(tài)和排列特點(diǎn)，采用革蘭染色就可檢出；結(jié)核桿菌可通過抗酸染色檢出。免疫染色法主要是指直接抗體染色法，它包括抗原和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記 抗體特異結(jié)合的直接抗體染色法，就是HRP標(biāo)記的單抗或多抗的Fab段和病原菌抗原特異 結(jié)合，例如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、綠膿桿菌、軍團(tuán)菌、B型流感嗜血桿菌、鮑曼不動(dòng) 桿菌、曲霉菌、放線菌等可通過特異性的酶標(biāo)單抗或多抗，采用直接抗體染色法檢出；也包 括病原菌的特殊蛋白和HRP標(biāo)記的IgG抗體Fc段非特異結(jié)合的直接抗體染色法，HRP標(biāo)記 的IgG抗體是兔IgG抗體或鼠IgG抗體，例如利用金黃色葡萄球菌A蛋白能和HRP標(biāo)記的 兔IgG抗體Fc段結(jié)合的特點(diǎn)，可通過直接抗體染色法檢出金黃色葡萄球菌。采用和辣根過 氧化物酶相對(duì)應(yīng)的顯色劑，它包含三種液體(a)濃度為0. 10-0. 80mg/ml DAB (3，3’ - 二氨 基聯(lián)苯胺)底物液、(b)濃度為0. 33-1重量％。雙氧水和(c)濃度為2. 00-15. 00mg/ml氯化 鈷溶液(或濃度為5. 00-20. 00mg/ml硫酸鎳氨溶液)，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色，有利于病原菌的觀 察。染色次序舉例對(duì)痰液中病原菌的鑒別可以先做革蘭染色，依據(jù)染色反應(yīng)、形態(tài)學(xué) 特征和排列方式就可檢出革蘭染色陽性的如肺炎鏈球菌和白色念珠菌，同時(shí)如發(fā)現(xiàn)革蘭陽 性球菌，則可再通過直接抗體染色，例如針對(duì)金黃色葡萄球菌的鑒別染色，使樣品中的金黃 色葡萄球菌顯出藍(lán)色，和其它細(xì)菌及背景的顏色不同。(5)觀察與計(jì)算結(jié)果在完成染色后，按常規(guī)通過顯微成像系統(tǒng)，較佳用油鏡對(duì)樣品中病原菌的染色反 應(yīng)、形態(tài)學(xué)和排列方式進(jìn)行觀察，并計(jì)算得出結(jié)果，就可對(duì)樣品中多種病原菌作出快速檢 測(cè)。本發(fā)明一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是由下列組成1、預(yù)處理液，是由5_50ml氨水(密度0. 88g/ml)，I-IOg氯化鈉及余量為水配制成 的IOOml混合液。該液基細(xì)胞學(xué)病原菌樣品的預(yù)處理液能裂解樣品中的肺泡巨噬細(xì)胞、中 性粒細(xì)胞等白細(xì)胞，讓被細(xì)胞包裹的病原菌從中釋放，并有利于樣品的液化；
2、液化劑，可以是蛋白酶，例如0. 5-5重量％糜蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶， 也可以是巰基還原劑，例如濃度為3. 0-30. Omg/ml巰基乙醇、濃度為4. 0-40. Omg/ml β -巰 基乙醇、濃度為3. 5-35. Omg/ml 1，4-二巰基丁二醇、濃度為4. 5-45. Omg/ml 二硫赤蘚糖醇、 濃度為5. 0-50. Omg/ml 二硫蘇糖醇等。該液化劑主要用于液化痰等黏液，打開樣品中蛋白 間的化學(xué)鍵，特別是肽鍵、氫鍵和二硫鍵，增加樣品的水溶性，讓被蛋白包裹的病原菌從中 釋放；3、稀釋液，為0. 5-5重量％的氯化鈉溶液。用于對(duì)已均相化的樣品進(jìn)行稀釋，能使 背景干凈和有利于樣品中病原菌的形態(tài)固定和檢測(cè)；4、鑒別染色液，是常規(guī)用的，可分為化學(xué)染色液和免疫染色液?；瘜W(xué)染色液由一瓶或多瓶不同成分的試劑組成，例如革蘭染色液包括結(jié)晶紫、碘 液、脫色劑和復(fù)染劑四種試劑；抗酸染色液包括石炭酸復(fù)紅液，5%鹽酸酒精液和亞甲基藍(lán) 液三種試劑。免疫染色液包含HRP標(biāo)記的抗體溶液和顯色劑。HRP標(biāo)記的抗體溶液，是內(nèi)含 HRP標(biāo)記的針對(duì)病原菌抗原特異的單抗或多抗溶液，例如單抗鼠抗軍團(tuán)菌抗體-HRP溶液， 多抗兔抗鮑曼不動(dòng)桿菌抗體-HRP溶液；也可以是能和病原菌特殊蛋白結(jié)合的內(nèi)含HRP標(biāo) 記的IgG抗體溶液，例如兔IgG-HRP溶液，能和金黃色葡萄球菌上的A蛋白結(jié)合。相對(duì)于 HRP的顯色劑包括三種液體(a)濃度為0. 10-0. 80mg/ml DAB (3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺)底物 液，(b)濃度為0. 33-1重量％。雙氧水和(c)濃度為2. 00-15. 00mg/ml氯化鈷溶液或濃度為 5. 00-20. 00mg/ml硫酸鎳氨溶液。反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色，有利于病原菌的觀察。使用何種染色液反應(yīng)，應(yīng)依據(jù)細(xì)菌的特點(diǎn)，例如特有的形態(tài)、特有的蛋白或抗原來 決定；5、耗材，包括(a)離心沉淀制片組合，可將經(jīng)液化處理后的樣品和稀釋液通過高 速離心過程將病原菌濃縮沉淀到載玻片上，完成薄層涂片過程，(b)磁力攪拌子，用于攪拌 剪切樣品，有利于液化劑的滲透，縮短液化時(shí)間。本發(fā)明一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)1.提供了一種新的病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法本發(fā)明在上述已有技術(shù)人體脫落細(xì)胞液基薄層涂片技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，提供 一種新的病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，可對(duì)樣品中多種病原菌作出快速 檢測(cè)。已有技術(shù)人體脫落細(xì)胞液基薄層離心沉淀制片技術(shù)檢測(cè)的目的物是細(xì)胞，使用的 細(xì)胞保存液主要成分是酒精，能對(duì)人體脫落細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)固定，就是說在人體脫落細(xì)胞的 病理學(xué)觀察中首先要保持人體細(xì)胞的完整，然后離心沉淀制片，由于人體細(xì)胞比較重，較低 的離心轉(zhuǎn)速已滿足，而較高的離心轉(zhuǎn)速反而會(huì)增加背景，不利于腫瘤細(xì)胞的觀察。而本發(fā) 明病原菌液基薄層離心沉淀制片技術(shù)檢測(cè)的目的物是微生物病原菌，要觀察病原菌首先要 將包裹病原菌的細(xì)胞打破，使病原菌從中釋放出來。有些病原菌例如結(jié)核桿菌、軍團(tuán)菌是 在人體白細(xì)胞中，本發(fā)明檢測(cè)試劑盒中包含的強(qiáng)堿性預(yù)處理液不含酒精成分，能裂解樣品 中的肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞，使被人體細(xì)胞包裹的病原菌從中釋放。檢測(cè)試 劑盒中還包含液化劑，能打開樣品中蛋白間的化學(xué)鍵，特別是肽鍵、氫鍵和二硫鍵，增加樣 品的水溶性，讓被蛋白包裹的病原菌從中釋放出來。檢測(cè)試劑盒中還包含稀釋液，能對(duì)已均相化的樣品進(jìn)行稀釋，使背景干凈和有利于樣品中病原菌的形態(tài)固定和檢測(cè)。又因病原 菌個(gè)體相比較于細(xì)胞是小且輕，因此本發(fā)明在離心制片的工藝條件上采用較高的離心轉(zhuǎn)速 1，000-3, 000轉(zhuǎn)/分鐘，不然病原菌是粘不到玻片上的，在離心沉淀制片過程中完成對(duì)病原 菌的濃縮和形態(tài)固定并使之黏附在載玻片上，得到多張分布均勻的薄層涂片。相比較于已有技術(shù)中的檢測(cè)物人體細(xì)胞，本發(fā)明檢測(cè)物病原菌的生物化學(xué)特性也 明顯不同，細(xì)菌沒有細(xì)胞核，因此鑒別染色步驟中的染色液和染色方法兩者也是完全不同 的。最后的結(jié)果鑒別也是不同的，已有技術(shù)是看有沒有腫瘤細(xì)胞，而本發(fā)明離心沉淀制片技 術(shù)得到的多張分布均勻的薄層涂片，根據(jù)病原菌的染色反應(yīng)、形態(tài)學(xué)和排列方式，可以同時(shí) 對(duì)樣品中多種病原菌作出檢測(cè)。2.建立了一種病原菌液基薄層涂片快速靈敏的檢測(cè)方法本發(fā)明病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，在對(duì)含病原菌的樣品進(jìn)行 均相化處理后，只需一步離心就可完成制片，高速離心過程產(chǎn)生的離心力可使溶液中的病 原菌沉淀在玻片上，完成對(duì)樣品的集菌濃縮，得到多張分布均勻的薄層涂片，然后針對(duì)不同 病原菌的特點(diǎn)進(jìn)行鑒別染色，最后根據(jù)病原菌的染色反應(yīng)、形態(tài)學(xué)和排列方式就可對(duì)樣品 中多種病原菌作出快速檢測(cè)，整個(gè)過程一小時(shí)內(nèi)就可完成。相比較于目前常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)鑒 定所需的24-48小時(shí)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，能及時(shí)作出檢測(cè)報(bào)告，為臨床診斷治療提供指 導(dǎo)和依據(jù)。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒中包含的預(yù)處理液能裂解樣品中的肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞 等白細(xì)胞，液化劑能有效打開粘蛋白，致使被人體細(xì)胞或蛋白包裹的病原菌都能從中釋放 出來。再通過液基離心沉淀薄層制片的過程更可完成對(duì)病原菌的濃縮，特別是免疫學(xué)鑒別 染色方法，更有放大作用，顯色劑顯色后呈顯人裸眼更敏感的藍(lán)色，與目前常規(guī)直接涂片法 比較，檢測(cè)的病原菌數(shù)量和細(xì)菌種類大大增加，因而檢測(cè)的靈敏度也大大提高，能更真實(shí)反 映病人的受感染程度。因此本發(fā)明病原菌液基薄層涂片快速靈敏的檢測(cè)方法，解決了目前 臨床上存在的不能為含有病原菌的樣品快速靈敏地提供病原菌感染檢測(cè)結(jié)果的問題，具有 較大的社會(huì)意義。3.本發(fā)明病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法具有高性價(jià)比本發(fā)明病原菌液基薄層涂片檢測(cè)方法已基本實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)化，所有檢測(cè)試劑盒中的 試劑及耗材，和檢測(cè)方法中所用的儀器設(shè)備基本實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化，具有較高的性價(jià)比。檢測(cè)方法 又比較簡(jiǎn)單，可作為一個(gè)實(shí)用的檢測(cè)技術(shù)，在我國(guó)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)中使用，具有較大的臨床推 廣價(jià)值，市場(chǎng)潛力較大。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1痰液(或腦脊液或關(guān)節(jié)液)中結(jié)核桿菌的液基薄層涂片檢測(cè)取200例結(jié)核病人的痰液(或腦脊液或關(guān)節(jié)液)樣品進(jìn)行液基薄層涂片法和直接 涂片法對(duì)比實(shí)驗(yàn)。用于結(jié)核桿菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處理液(由30ml密度為 0. 88g/ml的氨水，4g氯化鈉及余量為水配制成的IOOml混合液)，濃度為20mg/ml巰基乙醇 的液化劑，濃度為0. 9%氯化鈉溶液的稀釋液，包括石炭酸復(fù)紅液、5%鹽酸酒精液和亞甲基 藍(lán)液三種試劑的抗酸染色液和耗材(a)離心沉淀制片組合(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司)和 (b)磁力攪拌子組成。檢測(cè)使用的設(shè)備是磁力攪拌儀(MM-30型，上海微銀生物技術(shù)有限公司)、吊藍(lán)式離心機(jī)(Cytopr印-1型，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司)、恒溫烘片機(jī)(MW-50型，上海 微銀生物技術(shù)有限公司)和常規(guī)的顯微成像系統(tǒng)和系統(tǒng)軟件。將痰樣品全部(或5ml腦脊液或關(guān)節(jié)液)直接放入采樣杯中，再以樣品和預(yù)處理 液1 10的體積比加入預(yù)處理液、以樣品和液化劑1 1的體積比加入液化劑和磁力攪拌 子，杯子用上蓋蓋緊，放在磁力攪拌儀上，轉(zhuǎn)速2，000轉(zhuǎn)/分，加熱56°C攪拌15分鐘。然后 將已均相化的樣品和稀釋液按1 3的體積比稀釋，加入離心沉淀制片組合中的離心管中， 將離心沉淀制片組合分別放入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以1，500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，作液 基薄層離心沉淀制片。離心結(jié)束后棄上層液，將離心沉淀制片組合倒扣，浙干多余水分，卸 下載玻片后放在恒溫烘片機(jī)上70°C烘10分鐘，然后進(jìn)行抗酸染色，用石炭酸復(fù)紅液加熱初 染、水清洗后再經(jīng)5%鹽酸酒精液脫色，水清洗后再經(jīng)亞甲基藍(lán)液復(fù)染，用水沖洗，65°C烘5 分鐘，結(jié)核桿菌染成桿狀紅色，其它細(xì)菌或細(xì)胞均染成藍(lán)色。通過常規(guī)的顯微成像系統(tǒng)用油 鏡觀察和系統(tǒng)軟件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，結(jié)核桿菌為陽性。結(jié)果判斷按《結(jié)核病診斷實(shí) 驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》的要求進(jìn)行(中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)，中國(guó)教育文化出版社，P. 16， 2006年1月)。直接涂片法(常規(guī)法實(shí)驗(yàn)步驟省略)從中檢測(cè)出80例，陽性檢出率為40%， 而本發(fā)明液基薄層涂片檢測(cè)法從中檢測(cè)出100例，陽性檢出率為50%，陽性符合率100%。 陽性中9例直接涂片法為+，本發(fā)明方法為+++ ；2例直接涂片法為+，本發(fā)明方法為++++ ；8 例直接涂片法為++，本發(fā)明方法為++++;20例直接涂片法為陰性，本發(fā)明方法為陽性，其中 12例為+，8例為++。實(shí)施例2膿液和創(chuàng)傷感染組織樣品中綠膿桿菌液基薄層涂片檢測(cè)用于綠膿桿菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處理液(由25ml密度為0. 88g/ml 的氨水，Ig氯化鈉及余量為水配制成的IOOml混合液)，濃度為5. Omg/ml 二硫赤蘚糖醇的 液化劑，濃度為氯化鈉溶液的稀釋液，濃度為0. 5μ g/ml雞抗綠膿桿菌抗體(IgY)-HRP 的抗體溶液，顯色劑(顯色劑包括濃度為0. 40mg/ml DAB底物液，濃度為0. 35重量％。雙氧 水和濃度為10mg/ml氯化鈷溶液)和耗材組成，耗材和使用設(shè)備同實(shí)施例1。對(duì)膿液和創(chuàng)傷感染組織樣品有三種情況1.對(duì)于開放性感染，先用無菌生理鹽 水沖洗感染表面，再以無菌試紙采取膿液或病灶深部的分泌物，將無菌試紙?jiān)谘b有預(yù)處理 液的采樣杯中洗脫；2.對(duì)于感染部位的切除組織樣品，研磨后放入裝有預(yù)處理液的采樣杯 中；3.對(duì)于閉鎖性膿腫，可將穿刺或引流的分泌物直接放入裝有預(yù)處理液的采樣杯中。樣 品與預(yù)處理液的體積比為1 5，樣品與液化劑的體積比為1 O。杯子用上蓋蓋緊，放在 磁力攪拌儀上，轉(zhuǎn)速1，500轉(zhuǎn)/分，加熱50°C攪拌25分鐘。然后將已均相化的樣品和稀釋 液按1 1的體積比稀釋，加入離心沉淀制片組合中的離心管中，將離心沉淀制片組合分別 放入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以2，OOO轉(zhuǎn)/分離心12分鐘，作液基薄層離心沉淀制片。離 心結(jié)束后棄上層液，將離心沉淀涂片組合倒扣，浙干多余水分，卸下載玻片后放在恒溫烘片 機(jī)上50°C烘5分鐘。然后進(jìn)行鑒別染色，在烘干的載玻片上加四滴雞抗綠膿桿菌抗體-HRP 溶液，室溫孵育1小時(shí)后，用水沖洗，45°C烘6分鐘，再滴加顯色劑(DAB底物液、雙氧水和氯 化鈷溶液各兩滴)在玻片上混勻，室溫孵育3分鐘后用水沖洗，37°C烘3分鐘，染色反應(yīng)顯 示桿狀深藍(lán)色。通過顯微成像系統(tǒng)用油鏡觀察和系統(tǒng)軟件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，綠膿 桿菌為陽性。取150例膿液和創(chuàng)傷感染組織樣品進(jìn)行液基薄層涂片檢測(cè)，其中146為陽性， 陽性率為97. 3%。
實(shí)施例3痰液(或支氣管灌洗物)樣品中金黃色葡萄球菌和/或肺炎鏈球菌和/ 或白色念珠菌的液基薄層涂片檢測(cè)用于金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌和白色念珠菌聯(lián)合檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處 理液(由37ml密度為0. 88g/ml的氨水，5g氯化鈉及余量為水配制成的IOOml混合液)，濃 度為22mg/ml β -巰基乙醇的液化劑、濃度為1. 5%氯化鈉溶液的稀釋液、包括結(jié)晶紫、碘 液、脫色劑和復(fù)染劑四種試劑的革蘭染色液、濃度為0. 4 μ g/ml兔IgG-HRP的抗體溶液和顯 色劑(顯色劑包括濃度為0. 75mg/ml DAB底物液、濃度為0. 67重量％。雙氧水和濃度為8mg/ ml氯化鈷溶液)以及耗材組成，耗材和使用設(shè)備同實(shí)施例1。將待查病人的痰液或支氣管灌洗物放入采樣杯中，在采樣杯中以樣品和預(yù)處理液 1 12(支氣管灌洗物為1 3)的體積比加入強(qiáng)堿性的預(yù)處理液、以樣品和液化劑1 2 的體積比加入液化劑和磁力攪拌子，杯子用上蓋蓋緊，放在磁力攪拌儀上，轉(zhuǎn)速2，000轉(zhuǎn)/ 分，加熱60°C攪拌15分鐘。然后將已均相化的樣品和稀釋液按1 4(支氣管灌洗物為 1 0)的體積比稀釋，加入離心沉淀制片組合中的離心管中，將離心沉淀制片組合分別放 入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以1，500轉(zhuǎn)/分離心13分鐘，作液基薄層離心沉淀制片。離心 結(jié)束后棄上層液，將離心沉淀制片組合倒扣，浙干多余水分，卸下載玻片后在烘片機(jī)上55°C 烘3分鐘，這樣每例樣品得到兩張載玻片。先將一張玻片做革蘭染色1.初染，結(jié)晶紫染色 1分鐘，水洗；2.媒染，碘液染色1分鐘，水洗；3.脫色，脫色劑用到無紫色脫落為止，水洗； 4.復(fù)染，復(fù)染劑染色30秒，水洗，37°C烘5分鐘后鏡檢。結(jié)果是革蘭陽性呈紫色(革蘭陰性 呈紅色)。依據(jù)革蘭染色陽性，紫色鏈球菌有莢膜結(jié)構(gòu)和/或紫色典型的念珠結(jié)構(gòu)就可檢出 肺炎鏈球菌和/或白色念珠菌(如沒有發(fā)現(xiàn)革蘭陽性球菌，實(shí)驗(yàn)則結(jié)束)。如發(fā)現(xiàn)革蘭陽性 的球狀細(xì)菌，則再在另一張玻片上滴加四滴兔IgG-HRP溶液，室溫孵育10分鐘，雙蒸水沖洗 后40°C烘5分鐘。然后滴加顯色劑(DAB底物液、雙氧水和氯化鈷溶液各兩滴)在玻片上混 勻，室溫孵育3分鐘后用水沖洗，在烘片機(jī)上37°C烘3分鐘。最后通過顯微成像系統(tǒng)用油鏡 觀察和系統(tǒng)軟件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，出現(xiàn)染成深藍(lán)色的串狀葡萄球菌，則顯示金黃 色葡萄球菌陽性。實(shí)驗(yàn)取50例痰液(或支氣管灌洗物)樣品進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果1例為肺 炎鏈球菌，白色念珠菌和金黃色葡萄球菌混合感染例陽性，3例為肺炎鏈球菌和金黃色葡萄 球菌混合感染例陽性，2例為肺炎鏈球菌和白色念珠菌混合感染例陽性，12例為肺炎鏈球 菌陽性，9例為金黃色葡萄球菌陽性，4例為白色念珠菌陽性。實(shí)施例4尿樣品中大腸桿菌的液基薄層涂片檢測(cè)用于大腸桿菌的液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處理液(由40ml密度為0. 88g/ ml的氨水，6g氯化鈉及余量為水配制成的IOOml混合液)，濃度為7. Omg/ml 二硫蘇糖醇的 液化劑，濃度為2. 5%氯化鈉溶液的稀釋液，濃度為0. 5μ g/ml鼠抗大腸桿菌-HRP的抗體溶 液和顯色劑(顯色劑包括濃度為0. 70mg/ml DAB底物液、濃度為0. 57重量％。雙氧水和濃度 為6. 8mg/ml氯化鈷溶液)以及耗材組成，耗材和使用設(shè)備同實(shí)施例1。首先取尿樣品30ml分成兩管，3，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘后棄上清液，將沉淀物挑 進(jìn)采樣杯中，在采樣杯中以樣品和預(yù)處理液1 5的體積比加入強(qiáng)堿性的預(yù)處理液、以樣品 和液化劑1 0.1的體積比加入液化劑和磁力攪拌子，杯子用上蓋蓋緊，放在磁力攪拌儀 上，轉(zhuǎn)速1，500轉(zhuǎn)/分，加熱50°C攪拌5分鐘。然后將已均相化的樣品和稀釋液按1 2 的體積比稀釋，加入離心沉淀制片組合中的離心管中，將離心沉淀制片組合分別放入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以2，500轉(zhuǎn)/分離心9分鐘，作液基薄層離心沉淀制片。離心結(jié)束后棄 上層液，將離心沉淀涂片組合倒扣，浙干多余水分并卸下載玻片，在烘片機(jī)上42°C烘3. 5分 鐘。然后進(jìn)行鑒別染色，滴加四滴鼠抗大腸桿菌-HRP溶液在玻片上，室溫孵育40分鐘，雙蒸 水沖洗后40°C烘5分鐘。接著滴加顯色劑(DAB底物液、雙氧水和氯化鈷溶液各兩滴)在玻 片上混勻，室溫孵育4分鐘，雙蒸水沖洗后41°C烘3分鐘。最后通過顯微成像系統(tǒng)用油鏡進(jìn) 行觀察和系統(tǒng)軟件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。出現(xiàn)染上深藍(lán)色的桿狀細(xì)菌，則顯示大腸桿 菌陽性。實(shí)驗(yàn)取80例尿樣品進(jìn)行液基薄層涂片檢測(cè)，其中33例是陽性，陽性率為41. 3%0實(shí)施例5糞便樣品中沙門氏菌和/或志賀氏菌的液基薄層涂片檢測(cè)用于沙門氏菌和志賀氏菌的液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處理液(由20ml密 度為0. 88g/ml的氨水，3g氯化鈉及余量為水配制成的IOOml混合液)，濃度為30. Omg/ml 1，4-二巰基丁二醇的液化劑，濃度為3. 5%氯化鈉溶液的稀釋液，濃度為0. 3 μ g/ml鼠抗沙 門氏菌-HRP和濃度為0. 4 μ g/ml鼠抗志賀氏菌-HRP的抗體溶液和顯色劑(顯色劑包括濃 度為0. 65mg/ml DAB底物液、濃度為0. 55重量％。雙氧水和濃度為16. 8mg/ml硫酸鎳氨溶 液)以及耗材組成，耗材和使用設(shè)備同實(shí)施例1。首先取糞便樣品一塊用20ml生理鹽水?dāng)噭蛉ノ鄄⑤腿?，萃取液分成兩?00轉(zhuǎn)/ 分鐘離心2分鐘。將前面離心得到的上清液倒入另兩管中，3，000轉(zhuǎn)/分鐘再離心15分鐘， 將該兩管的沉淀物挑出放入采樣杯中，以樣品和預(yù)處理液1 15的體積比加入強(qiáng)堿性預(yù)處 理液，以樣品和液化劑1 0.5的體積比加入液化劑和放入磁力攪拌子。杯子用上蓋蓋緊， 放在磁力攪拌儀上，轉(zhuǎn)速1，600轉(zhuǎn)/分，加熱45°C攪拌10分鐘。然后將已均相化的樣品和 稀釋液按1 2的體積比稀釋，加入離心沉淀制片組合中的離心管中，將離心沉淀制片組合 分別放入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以2，000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，作液基薄層離心沉淀制片。 離心結(jié)束后棄上層液，將離心沉淀涂片組合倒扣，浙干多余水分并卸下載玻片，在烘片機(jī)上 42°C烘3分鐘。然后進(jìn)行鑒別染色，在兩張玻片上分別滴加四滴鼠抗沙門氏菌-HRP溶液和 鼠抗志賀氏菌-HRP溶液，室溫孵育45分鐘，雙蒸水沖洗后38°C烘3分鐘。然后滴加顯色劑 (DAB底物液、雙氧水和硫酸鎳氨溶液各兩滴在每張玻片上混勻)，室溫孵育5分鐘，雙蒸水 沖洗后44°C烘3分鐘。最后通過顯微成像系統(tǒng)用油鏡觀察和系統(tǒng)軟件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果 計(jì)算，兩張玻片上同時(shí)(或僅在一張玻片上)出現(xiàn)染上深藍(lán)色的桿狀細(xì)菌，則顯示沙門氏菌 和(或)志賀氏菌陽性。實(shí)驗(yàn)取80例糞便樣品進(jìn)行液基薄層涂片檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為1例沙 門氏菌和志賀氏菌混合感染陽性，12例沙門氏菌陽性，5例志賀氏菌陽性。實(shí)施例6胸腹水樣品中曲霉菌和/或放線菌液基薄層涂片檢測(cè)用于曲霉菌和放線菌的液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處理液(由15ml密度為 0. 88g/ml的氨水，2g氯化鈉及余量為水配制成的IOOml混合液)，濃度為3%糜蛋白酶的 液化劑，濃度為2. 3%氯化鈉溶液的稀釋液，濃度為0. 6 μ g/ml鼠抗曲霉菌-HRP和濃度為 1 μ g/ml兔抗放線菌-HRP的抗體溶液和顯色劑(顯色劑包括濃度為0. 60mg/ml DAB底物 液、濃度為0. 543重量％。雙氧水和濃度為7. 8mg/ml硫酸鎳氨溶液)以及耗材組成，耗材和 使用設(shè)備同實(shí)施例1。首先取胸腹水樣品30ml分成兩管，3，000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后棄上清液，將兩 管的沉淀物挑出放入采樣杯中，以樣品和預(yù)處理液1 6的體積比加入強(qiáng)堿性預(yù)處理液、以 樣品和液化劑1 0.2的比例加入液化劑和放入磁力攪拌子。杯子用上蓋蓋緊，放在磁力攪拌儀上，轉(zhuǎn)速1，500轉(zhuǎn)/分，加熱48°C攪拌5分鐘。然后將已均相化的樣品和稀釋液按 1 4. 5的體積比稀釋，加入離心沉淀制片組合中的離心管中，將離心沉淀制片組合分別放 入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以1，500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，作液基薄層離心沉淀制片。離心 結(jié)束后棄上層液，將離心沉淀涂片組合倒扣，浙干多余水分并卸下載玻片，在烘片機(jī)上46°C 烘3分鐘。然后進(jìn)行鑒別染色，分別在兩張玻片上滴加四滴鼠抗曲霉菌-HRP溶液和兔抗放 線菌-HRP溶液，室溫孵育30分鐘，雙蒸水沖洗后40°C烘3分鐘。然后滴加顯色劑(DAB底 物液、雙氧水和硫酸鎳氨溶液各兩滴)在每張玻片上混勻，室溫孵育5分鐘，雙蒸水沖洗后 44°C烘3分鐘。最后通過顯微成像系統(tǒng)用油鏡觀察和系統(tǒng)軟件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。 在一張玻片上出現(xiàn)(或不出現(xiàn))染上深藍(lán)色的曲霉菌結(jié)構(gòu)，有(或沒有)染上深藍(lán)色的分 生孢子頭、梗子和頂囊，則顯示曲霉菌陽性(或陰性)。在另一張玻片上出現(xiàn)(或不出現(xiàn)) 染上深藍(lán)色的放線菌結(jié)構(gòu)，有(或沒有)染上深藍(lán)色的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲，則顯 示放線菌陽性(或陰性)。實(shí)驗(yàn)取70例胸腹水樣品進(jìn)行液基薄層涂片檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2 例曲霉菌和放線菌混合感染陽性，12例曲霉菌陽性，3例放線菌陽性。實(shí)施例7支氣管灌洗物樣品中六種病原菌的液基薄層涂片檢測(cè)支氣管灌洗物樣品中六種病原菌是指軍團(tuán)菌、B型流感嗜血桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、 肺炎克雷伯菌、腸原桿菌、硝酸鹽陰性桿菌。用于六種病原菌的液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒是 由預(yù)處理液(由IOml密度為0. 88g/ml的氨水，1. 5g氯化鈉及余量為水配制成的IOOml混 合液)，濃度為2%胃蛋白酶的液化劑，濃度為4. 3%氯化鈉溶液的稀釋液，濃度為0. 5μ g/ ml鼠抗軍團(tuán)菌-HRP、濃度為1. 2 μ g/ml兔抗B型流感嗜血桿菌-HRP、濃度為1. 4 μ g/ml兔 抗鮑曼不動(dòng)桿菌-HRP、濃度為2 μ g/ml兔抗肺炎克雷伯菌-HRP、濃度為2. 5 μ g/ml兔抗腸 原桿菌-HRP和濃度為1. 5 μ g/ml兔抗硝酸鹽陰性桿菌-HRP的抗體溶液和顯色劑(顯色劑 包括濃度為0. 55mg/ml DAB底物液、濃度為0. 53重量％。雙氧水、濃度為18. 8mg/ml硫酸鎳 氨溶液)以及耗材組成，耗材和使用設(shè)備同實(shí)施例1。首先取3ml支氣管灌洗物樣品放入采樣杯中，在采樣杯中以樣品和預(yù)處理液1 4 的體積比加入強(qiáng)堿性的預(yù)處理液和磁力攪拌子，不加液化劑。杯子用上蓋蓋緊，放在磁力攪 拌儀上，轉(zhuǎn)速2，000轉(zhuǎn)/分，加熱56°C攪拌5分鐘。然后將已均相化的樣品(不需要加稀 釋液)加入離心沉淀制片組合中的離心管中，將離心沉淀制片組合分別放入吊籃式離心機(jī) 的吊藍(lán)中，以2，500轉(zhuǎn)/分離心6分鐘，作液基薄層離心沉淀制片。離心結(jié)束后棄上層液， 將離心沉淀制片組合倒扣，浙干多余水分，卸下載玻片后在烘片機(jī)上43°C烘3分鐘。然后 進(jìn)行染色，分別在六張玻片上滴加四滴鼠抗軍團(tuán)菌-HRP溶液、兔抗B型流感嗜血桿菌-HRP 溶液、兔抗鮑曼不動(dòng)桿菌-HRP溶液、兔抗肺炎克雷伯菌-HRP溶液、兔抗腸原桿菌-HRP溶液 和兔抗硝酸鹽陰性桿菌-HRP溶液，室溫孵育40分鐘，雙蒸水沖洗后45°C烘5分鐘。然后滴 加顯色劑(DAB底物液、雙氧水和硫酸鎳氨溶液各兩滴)在每張玻片上混勻，室溫孵育3. 5 分鐘，雙蒸水沖洗后45°C烘3分鐘。最后通過顯微成像系統(tǒng)用油鏡觀察和系統(tǒng)軟件連接計(jì) 算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。在分別和上述不同的抗體-HRP的抗體溶液相對(duì)應(yīng)的六個(gè)玻片上出現(xiàn) 染上深藍(lán)色桿狀的軍團(tuán)菌或/和B型流感嗜血桿菌或/和鮑曼不動(dòng)桿菌或/和和肺炎克雷 伯菌或/和腸原桿菌或/和硝酸鹽陰性桿菌，則顯示軍團(tuán)菌或/和B型流感嗜血桿菌或/ 和鮑曼不動(dòng)桿菌或/和肺炎克雷伯菌或/和腸原桿菌或/和硝酸鹽陰性桿菌為陽性。實(shí)驗(yàn) 取80例樣品進(jìn)行液基薄層涂片檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果1例為軍團(tuán)菌和B型流感嗜血桿菌混合感染陽性，1例為鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌混合感染陽性，2例為軍團(tuán)菌，8例為B型流感嗜 血桿菌，10例為鮑曼不動(dòng)桿菌，20例為肺炎克雷伯菌，5例為腸原桿菌，7例為硝酸鹽陰性桿菌。
權(quán)利要求
一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒，其特征在于檢測(cè)試劑盒是由下列組成(1)預(yù)處理液，是由密度為0.88g/ml的5 50ml氨水，1 10g氯化鈉及余量為水配制成的100ml混合液；(2)液化劑，是蛋白酶或巰基還原劑；(3)稀釋液，為0.5 5重量％的氯化鈉溶液；(4)鑒別染色液，是化學(xué)染色液或免疫染色液；(5)耗材，包括(a)離心沉淀制片組合，(b)磁力攪拌子。
2.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的液化劑蛋白酶是0.5-5重量％糜 蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶。
3.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的液化劑巰基還原劑是濃度為 3. 0-30. Omg/ml 巰基乙醇、濃度為 4. 0-40. Omg/ml β -巰基乙醇、濃度為 3. 5-35. Omg/ml 1， 4- 二巰基丁二醇、濃度為4. 5-45. Omg/ml 二硫赤蘚糖醇或濃度為5. 0-50. Omg/ml 二硫蘇糖
4.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的鑒別染色液為化學(xué)染色液時(shí)，是 革蘭染色液，包括結(jié)晶紫，碘液，脫色劑和復(fù)染劑四種試劑。
5.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的鑒別染色液為化學(xué)染色液時(shí)，是 抗酸染色液，包括石炭酸復(fù)紅液，5%鹽酸酒精液和亞甲基藍(lán)液三種試劑。
6.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的鑒別染色液為免疫染色液，它包 含辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體溶液和相對(duì)于HRP的顯色劑。
7.如權(quán)利要求1或6所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的鑒別染色液為免疫染色液，它 包含的HRP標(biāo)記抗體溶液是內(nèi)含HRP標(biāo)記的針對(duì)病原菌抗原特異的單抗或多抗溶液，或是 能和病原菌特殊蛋白結(jié)合的內(nèi)含HRP標(biāo)記的IgG抗體溶液。
8.如權(quán)利要求1或6所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的鑒別染色液為免疫染色液，它 包含的相對(duì)于HRP的顯色劑包括三種液體(a)濃度為0. 10-0. 80mg/mlDAB (3，3，- 二氨基 聯(lián)苯胺)底物液，(b)濃度為0. 33-1重量％。雙氧水和(c)濃度為2. 00-15. 00mg/ml氯化鈷 溶液或濃度為5. 00-20. 00mg/ml硫酸鎳氨溶液。
9.權(quán)利要求1所述病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于包含下列 步驟(1)取樣取含病原菌的樣品；(2)樣品的均相化處理在樣品中以樣品和預(yù)處理液1 3-20的體積比加入預(yù)處理液， 以樣品和液化劑1 0-5的體積比加入液化劑，和磁力攪拌子一起加熱45-65°C攪拌5-30 分鐘，轉(zhuǎn)速為1，000-2, 000轉(zhuǎn)/分；(3)液基離心沉淀薄層制片取上述已均相化的樣品和稀釋液按1 0-6體積比混合，放 入吊籃式離心機(jī)的吊藍(lán)中，以1，000-3, 000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心5-15分鐘，進(jìn)行液基離心沉淀 制片，得到液基離心沉淀薄層涂片；(4)鑒別染色在含同一樣品的一張以上的載玻片上進(jìn)行鑒別染色，采用常規(guī)的化學(xué)染 色法或免疫染色法；(5)觀察與計(jì)算結(jié)果在完成染色后，按常規(guī)通過顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，并通過系統(tǒng)軟 件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。
10.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(1)步中的樣品是痰 液、支氣管灌洗物、胸腹水、膿液和創(chuàng)傷感染組織、腦脊液、關(guān)節(jié)液、尿液或糞便。
11.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(1)步中樣品含有的 病原菌為二類(a)細(xì)菌是大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、結(jié)核桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色 葡萄球菌、綠膿桿菌、軍團(tuán)菌、B型流感嗜血桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、腸原桿菌或 硝酸鹽陰性桿菌；(b)真菌是白色念珠菌、曲霉菌或放線菌。
12.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(2)步中的預(yù)處理 液是取之于由密度為0. 88g/ml的5-50ml氨水、l_10g氯化鈉及余量為水配制的IOOml混合 液。
13.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(2)步中的液化劑是 蛋白酶或巰基還原劑。
14.如權(quán)利要求9或13所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(2)步中的液 化劑蛋白酶是0. 5-5重量％糜蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶。
15.如權(quán)利要求9或13所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(2)步中的液 化劑巰基還原劑是濃度為3. 0-30. Omg/ml巰基乙醇、濃度為4. 0-40. Omg/ml β -巰基乙醇、 濃度為3. 5-35. Omg/ml 1,4- 二巰基丁二醇、濃度為4. 5-45. Omg/ml 二硫赤蘚糖醇或濃度為 5. 0-50. Omg/ml 二硫蘇糖醇。
16.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(3)步中的稀釋液為 0. 5-5重量％的氯化鈉溶液。
17.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(4)步中的鑒別染色 采用的化學(xué)染色法，是革蘭染色法或抗酸染色法。
18.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(4)步中的鑒別染色 采用的免疫染色法，是HRP標(biāo)記的的單抗或多抗的Fab段和病原菌抗原特異結(jié)合的直接抗 體染色法，或是HRP標(biāo)記的IgG抗體的Fc段和病原菌的特殊蛋白非特異結(jié)合的直接抗體染 色法。
19.如權(quán)利要求18所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(4)步鑒別染色采 用的免疫染色法，是HRP標(biāo)記的兔IgG抗體或鼠IgG抗體的Fc段和病原菌的特殊蛋白非特 異結(jié)合的直接抗體染色法。
20.如權(quán)利要求9，18或19所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(4)步鑒 別染色采用的免疫染色法中，采用和HRP相對(duì)應(yīng)的顯色劑，它包括三種液體(a)濃度為 0. 10-0. 80mg/ml DAB (3，3，- 二氨基聯(lián)苯胺)底物液，(b)濃度為0. 33-1重量％。雙氧水和 (c)濃度為2. 00-15. 00mg/ml氯化鈷溶液或濃度為5. 00-20. 00mg/ml硫酸鎳氨溶液。
21.如權(quán)利要求9所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述第(5)步中通過顯微成 像系統(tǒng)用油鏡進(jìn)行觀察，并通過系統(tǒng)軟件連接計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。
全文摘要
本發(fā)明是一種病原菌液基薄層涂片檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。檢測(cè)試劑盒是由預(yù)處理液，液化劑，稀釋液，鑒別染色液和耗材組成。這種檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，是在檢測(cè)樣品中加入強(qiáng)堿性預(yù)處理液和液化劑進(jìn)行樣品的均相化處理，再加入稀釋劑，作液基離心沉淀薄層制片，得到多張分布均勻的病原菌液基薄層涂片，然后進(jìn)行鑒別染色，根據(jù)病原菌的染色反應(yīng)、形態(tài)學(xué)和排列方式的觀察與計(jì)算，就可對(duì)樣品中多種病原菌作出檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明建立了一種病原菌液基薄層涂片快速靈敏的檢測(cè)方法，整個(gè)過程一小時(shí)內(nèi)就可完成，檢測(cè)方法又比較簡(jiǎn)單，具有較大的臨床推廣價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101974609SQ20101050047
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者劉佳, 吳增斌, 江靜, 潘曙明, 程振球, 賀堅(jiān)慧 申請(qǐng)人:賀堅(jiān)慧