專(zhuān)利名稱(chēng)：艾滋病(hiv-1/2)尿液快速檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利是涉及醫(yī)學(xué)免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是艾滋病病毒的尿液檢測(cè)試劑。
2.
背景技術(shù)：
免疫膠體金技術(shù)是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)， 其原理與雙夾心ELISA相似，不同的是使用膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物作為探針，且所使用的試劑事先都被固定在具有微孔的硝酸纖維素膜上。使用時(shí)將一端置于檢測(cè)液中， 硝酸纖維素膜可被液體穿過(guò)，若檢測(cè)液中含有相關(guān)的抗原或抗體。在檢測(cè)區(qū)就會(huì)出現(xiàn)淡紅色線(xiàn)條。否則為陰性。該技術(shù)問(wèn)世以來(lái)已在臨床上不斷被采用，該方法不依賴(lài)于精密的儀器、不依賴(lài)于熟練的技術(shù)人員、操作步驟簡(jiǎn)捷，比起目前常用的酶聯(lián)免疫法具有更大的優(yōu)點(diǎn)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程約在5分鐘內(nèi)就可以完成。因而需要的樣品量少，檢測(cè)更為敏感和準(zhǔn)確。 建立上述快速、簡(jiǎn)便、特異的免疫分析方法，對(duì)于艾滋病等傳染病的臨床診斷及獻(xiàn)血人群中血液病毒性感染的篩查是一種不可缺少的重要工具。本項(xiàng)目的技術(shù)來(lái)源于免疫標(biāo)記學(xué)原理的發(fā)展和應(yīng)用.免疫標(biāo)記創(chuàng)立于60年代初期，開(kāi)始是以放射免疫分析為代表，以后相繼派出許多其它的免疫標(biāo)記分析，80年代末90 年代初，更為理想和血清診斷方法開(kāi)始出現(xiàn)，即快速滲濾和層析膠體金免疫診斷試劑。膠體金是由氯金酸在還原膠如白磷、抗壞血酸和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金一顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)為膠體金。利用它在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基本籍靜電吸引而形成牢固結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理特性， 其在免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)及細(xì)胞生物標(biāo)記研究中均得到了廣泛應(yīng)用，已成為快速診斷病毒感染之首選。在病毒和細(xì)菌等原生物引起的傳染病中，實(shí)驗(yàn)診斷有著極重要的價(jià)值。實(shí)驗(yàn)室診斷分為病原學(xué)診斷和血清學(xué)(即免疫學(xué))診斷兩大部分。前者雖具有確診感染和疾病的優(yōu)點(diǎn)但檢出效果很不理想。因此，免疫學(xué)診斷已成為許多傳染病和主要檢測(cè)手段。在艾滋病診斷試劑盒的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中，目前國(guó)外已開(kāi)發(fā)出了基于雙抗原夾心法原理，檢測(cè)血清和血漿中HIV抗體的膠體金診斷試劑盒，已獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，并在我國(guó)SFDA注冊(cè)。以尿液為標(biāo)本檢測(cè)HIV抗體的膠體金診斷試劑盒和以尿液為標(biāo)本檢測(cè)HIV抗體和抗原檢測(cè)試劑盒也已相繼問(wèn)世，但在我國(guó)尚無(wú)產(chǎn)品正式注冊(cè)。但以下問(wèn)題仍未完全解決(1)采血過(guò)程具創(chuàng)傷性，難以為受檢者接受；( 采血過(guò)程存在污染和擴(kuò)散傳播的潛在危險(xiǎn)；(3)檢測(cè)方法以血清或血漿為樣品，需抽血分離血清或血漿，難在家中進(jìn)行自我檢測(cè)。艾滋病人尿液中存在特異性抗體已為大量的研究和調(diào)查所證實(shí)。以尿液為檢樣檢測(cè)艾滋病抗體和循環(huán)抗原的快速診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)，可以解決目前以血清或血漿為樣品并單純檢測(cè)抗體檢測(cè)方法所存在的上述缺陷和問(wèn)題?？梢灶A(yù)測(cè)，以尿液為檢樣檢測(cè)艾滋病抗體的快速膠體金免疫診斷試劑盒有著極好的市場(chǎng)前景。艾滋病尿液快速檢測(cè)試劑盒是以尿液為樣本檢測(cè)艾滋病抗體，檢測(cè)過(guò)程只需5-10 分鐘完成。準(zhǔn)確率99.6%，特異性100%，靈敏性99%。我國(guó)目前艾滋病檢測(cè)主要是血源檢測(cè)，是用血清.血槳或全血檢測(cè).因血液傳染性強(qiáng)，醫(yī)院檢驗(yàn)人員進(jìn)行血檢有感染艾滋病危險(xiǎn)。所以，發(fā)展尿液檢測(cè)試劑對(duì)檢驗(yàn)人員和受檢人員都安全，本項(xiàng)目艾滋病檢測(cè)用尿液直接檢測(cè)，避免血液的交叉感染.該技術(shù)是國(guó)際先進(jìn)水平，在國(guó)內(nèi)該技術(shù)處于領(lǐng)先水平。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外使用最廣泛的血清診斷方法為酶聯(lián)免疫吸收附試驗(yàn)(ELISA)，檢測(cè)的目標(biāo)物可為抗體、亦可為可溶性循環(huán)抗原，與以往使用的血清學(xué)診斷方法(如間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、免疫熒光法和放射免疫試驗(yàn)等)相比較、該類(lèi)方法具有敏感性強(qiáng)、特異性高、操作相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。但該方法操作步驟多、技術(shù)要求高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2-3小時(shí)，結(jié)果需借助儀器判讀且結(jié)果無(wú)法保存。這些缺點(diǎn)限制了其在基層和現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用和推廣，更無(wú)法直接進(jìn)入家庭。本項(xiàng)目艾滋病尿液快速膠體金免疫診斷試劑盒與ELISA方法比較，除具有與其同樣的特異性，敏感性和精確性外，尚具有操作簡(jiǎn)便快速，結(jié)果判定容易且可長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)。該方法一出現(xiàn)便顯示了其強(qiáng)勁的生命力。在歐美等國(guó)家，快速免疫檢測(cè)試劑盒及其相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)值和市場(chǎng)已近60億美元。該技術(shù)因抗體的不同可用于各種免疫診斷試劑的研制，如尿液HIV-1/2等。該技術(shù)在國(guó)內(nèi)基本未用于臨床使用，在國(guó)際國(guó)內(nèi)該技術(shù)處于領(lǐng)先水平。與國(guó)內(nèi)艾滋病血液快速膠體金檢測(cè)試劑盒比較目前艾滋病檢測(cè)的主導(dǎo)手段血液檢測(cè)HIV-I抗體的方法，準(zhǔn)確度較高，但對(duì)檢驗(yàn)人員和受檢者都不安全。2002年艾滋病感染者有100萬(wàn)，發(fā)病率為0. 7%0。若對(duì)高危人群檢驗(yàn)率為計(jì)算，需要檢測(cè)1億人份。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前艾滋病感染人數(shù)為100萬(wàn)左右，且每年以30%的速率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。WHO官員警告，如果中國(guó)的艾滋病狀況不能得到有效的控制，至2010年，其感染人數(shù)將達(dá)到1000 萬(wàn)。
3.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專(zhuān)利的目的在于公開(kāi)一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，檢測(cè)過(guò)程快速準(zhǔn)確，應(yīng)用層析法 (Lateral Flow Immuno-Assay)膠體金免疫診斷技術(shù)的艾滋病尿液快速檢測(cè)試劑。膠體金檢測(cè)系統(tǒng)使用一種特殊的多孔膜(NC膜)作為固相抗原或抗體載體。該膜具有很強(qiáng)的蛋白吸附功能，抗原或抗體吸附于NC膜并經(jīng)干燥處理后即作為固相，可與液相中的相應(yīng)抗體或抗原快速結(jié)合。而在濕潤(rùn)狀態(tài)下，液相(尿液)中含有的抗體或抗原可因“燈信引流現(xiàn)象”作快速定向泳動(dòng)并與固相抗原或抗體結(jié)合成為復(fù)合物結(jié)合物載體上預(yù)先噴點(diǎn)的結(jié)合有膠體金(作為顯色和指示劑)的相應(yīng)第二抗體或抗原亦可與該復(fù)合物快速結(jié)合。由于毛細(xì)作用復(fù)合物沿線(xiàn)條向前移動(dòng)，移動(dòng)至檢測(cè)線(xiàn)處，復(fù)合物被抗人-IgG單克隆抗體捕獲形成 Au-HIVAg-HIV抗體-抗人-IgG單克隆抗體夾心物，呈現(xiàn)出一條紫紅色條帶。陰性標(biāo)本則不會(huì)形成夾心物，游離的膠體金重組HIV抗原移動(dòng)至對(duì)照線(xiàn)處被HIV單克隆抗體捕獲呈現(xiàn)出一條紫紅色條帶，對(duì)照線(xiàn)的出現(xiàn)表明測(cè)試是有效的。4.
具體實(shí)施例方式由于這種結(jié)合過(guò)程為物理過(guò)程，反應(yīng)可在數(shù)分鐘內(nèi)完成且結(jié)合非常穩(wěn)定。這一技術(shù)的創(chuàng)新點(diǎn)為加有輔助劑使抗原或抗體與固相膜載體牢固結(jié)合；應(yīng)用特殊干燥技術(shù)使與固相膜載體結(jié)合的蛋白保持穩(wěn)定，從而達(dá)到試劑盒可在常溫下保存18 個(gè)月到1年；膠體金制備和結(jié)合技術(shù)膠體金結(jié)合物的干燥和在常溫下長(zhǎng)期保存技術(shù)；測(cè)試條中各種參試組分的最佳配比為達(dá)到整個(gè)測(cè)試反應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)一步完成對(duì)測(cè)試條中各種原材料的測(cè)試選定和參試組分的最佳配比。解決的技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題(1)，以HIV重組抗原構(gòu)建高靈敏度的雙抗原夾心法系統(tǒng)，用于檢測(cè)尿液中的特異性HIV抗體；( 高靈敏度的雙抗原夾心法系統(tǒng)和高靈敏度的雙抗體夾心系統(tǒng)中金標(biāo)記物的制備；C3)尿液快速采樣和樣品濃縮技術(shù)。
權(quán)利要求
1. 一種艾滋病(Η ν-1/幻尿液快速檢測(cè)試劑其特征是用于檢測(cè)尿液中艾滋病抗體，可用于臨床診斷。(1)、以HIV重組抗原構(gòu)建高靈敏度的雙抗原夾心法系統(tǒng)，用于檢測(cè)尿液中的特異性HIV抗體高度純化的HIV重組抗原HIV-lgp41、. P24和HIV_2gp36、高靈敏度的雙抗原夾心法系統(tǒng)構(gòu)建。(2)、抗HIV抗原HIV-lgp41、. P24和HIV_2gp36單克隆抗體細(xì)胞株克隆、篩選、鑒定，大規(guī)模單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)和收獲，以及單克隆抗體純化。(3)、上述兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中金標(biāo)記物的制備。G)、尿液的快速樣品濃縮技術(shù)尿液作為待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于尿液中含有的特異性抗體和抗原的含量要較血清或血漿的多，這就需要該檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度更強(qiáng)。本項(xiàng)目使用的濃縮墊可使樣品在加樣瞬間濃縮10-100倍，從而提高檢測(cè)系統(tǒng)的敏感性。
全文摘要
一種艾滋病(HIV-1/2)尿液快速檢測(cè)試劑是采用雙抗原夾心法原理a.以HIV重組抗原構(gòu)建高靈敏度的雙抗原夾心法系統(tǒng)，用于檢測(cè)尿液中的特異性HIV抗體高度純化的HIV重組抗原HIV-1p41、P42和HIV-2gp36、高靈敏度的雙抗原夾心法系統(tǒng)構(gòu)建。b.抗HIV抗原HIV-1p41、P42和HIV-2gp36單克隆抗體細(xì)胞株克隆、篩選、鑒定，大規(guī)模單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)和收獲，以及單克隆抗體純化。c.兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中金標(biāo)記物的制備高靈敏度的雙抗原夾心法系統(tǒng)和高靈敏度的雙抗體夾心法系統(tǒng)中金標(biāo)記物的制備。d.尿液的快速樣品濃縮技術(shù)本項(xiàng)目使用的濃縮墊可使樣品在加樣瞬間濃縮10～100倍，從而提高檢測(cè)系統(tǒng)的敏感性。檢測(cè)過(guò)程在5分鐘內(nèi)完成，應(yīng)用包括醫(yī)院、防疫站、出入境檢疫局，現(xiàn)場(chǎng)的疾病診斷。家庭自檢。艾滋病檢測(cè)用尿液直接檢測(cè)，避免血液的交叉感染，徹底解決了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的缺陷，檢測(cè)無(wú)創(chuàng)傷，速度快，方便安全。填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。
文檔編號(hào)G01N33/571GK102445538SQ20101029877
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月8日
發(fā)明者陳潔 申請(qǐng)人:無(wú)錫百進(jìn)生物技術(shù)有限公司