專利名稱：軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物檢測技術領域的檢測試劑盒及其檢測方法，具體是一種 貝類樣品中軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
軟骨藻酸(Domoic Acid, DA)是赤潮毒素的一種，由于其中毒后的特征癥狀為喪 失記憶，所以又稱失去記憶性貝毒。DA最早是從一種大型紅藻——樹枝軟骨藻分離所得。 分子式為C15H21NO6，分子量為311. 34，純品為白色固體粉末，熔點為223 224°C，可溶于水 (8mg/mL)，微溶于甲醇(0. 6mg/mL)，在紫外光譜區(qū)的最大吸收波長為242nm。DA主要由海洋 硅藻產生，通過食物鏈被海洋生物所富集，不僅具有相當?shù)纳鷳B(tài)風險，更是威脅到了人類健 康。有研究表明海獅食用被DA污染的魚類會出現(xiàn)早產、流產等生殖障礙。也有研究表明在 低劑量DA的暴露下，仔鼠的學習及記憶能力產生了永久性損傷。1987年在加拿大愛德華王 子島發(fā)生食用被DA污染的紫貽貝的集體中毒事件引起了人們的普遍關注，中毒者產生嘔 吐、腹瀉，部分人員出現(xiàn)了記憶混亂、記憶喪失、方向辨別障礙，甚至死亡。因此各國相繼制 定了 20μ g/g貝肉的水產品標準。我國目前并未有相關的檢測標準。目前為止對于DA的分析已經建立了多種方法，用于常規(guī)檢測的主要是小白鼠生 物檢測法、高效液相色譜(HPLC)檢測法及免疫檢測法。小白鼠生物法由于檢測限達不到要 求，正在被逐步淘汰，但由于其操作方法簡單，設備要求低仍被一些國家所使用，而高效液 相色譜法以其低檢測限，高靈敏度受到各國的青睞，已成為不少國家的標準方法。但是高效 液相色譜法對儀器及技術人員的要求高，并且不適用于大量樣品的檢測。而免疫學方法，正 好結合了上述兩種方法的優(yōu)點，儀器操作簡單、檢測限較低，適用于基層部門的常規(guī)檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及 其檢測方法，使得本發(fā)明滿足對樣品的前處理要求低，還可以減少試劑盒的操作步驟；對儀 器設備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無污染等優(yōu)點。本發(fā)明涉及一種軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包含軟骨藻酸特異性抗體、包 被了軟骨藻酸抗原的酶標板、酶標二抗、軟骨藻酸標準溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌液、 抗體稀釋液、顯色劑與終止液；所述的酶標板采用96或40孔酶標板，包被有能與抗軟骨藻酸抗體特異結合的軟 骨藻酸抗原，并封閉微孔表面未吸附軟骨藻酸抗原的位點。所述軟骨藻酸特異性抗體為兔抗軟骨藻酸多克隆抗體。所述軟骨藻酸抗原是采用碳二亞胺法、活潑酯法或混合酸酐法將軟骨藻酸小分子 半抗原與載體蛋白進行偶聯(lián)得到。所述酶標記二抗是辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體。所述包被緩沖液為0. 05-0. lmol/L, pH9. 6的碳酸鹽緩沖液。
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所述封閉液為1-3%的聚乙烯醇溶液。所述洗滌液為含0. 05-5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述抗體稀釋液為含4-10%的聚乙二醇溶液。所述顯色液為由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫，顯色劑B為四甲
基聯(lián)苯胺。所述終止液為l-5mol/L的硫酸溶液。本發(fā)明涉及上述試劑盒用于貝類樣品中軟骨藻酸的檢測方法，包括以下步驟①樣品前處理②用上述試劑盒對樣品進行檢測，向包被有軟骨藻酸抗原的酶標板孔中加入標準 品或樣品溶液和抗體稀釋液；③溫育后洗滌拍干，再加入酶標二抗；④進一步溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；⑤分析檢測結果。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為將軟骨藻酸包被抗原吸附于固相載體上，加入系列標 準品或樣品溶液和軟骨藻酸特異性多克隆抗體稀釋液，待測樣品中的軟骨藻酸和預包被的 抗原競爭結合特異性抗體，加入酶標二抗進行酶活性放大作用，顯色后終止。樣品吸光度值 與其殘留物軟骨藻酸的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣品中軟骨藻酸的濃度范 圍。本發(fā)明的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或 定量檢測貝類樣品中軟骨藻酸的含量；對樣品的前處理要求低。采用高特異性的軟骨藻酸 多克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時 間并降低因操作步驟冗繁而造成的誤差，本發(fā)明具有特異性高、靈敏度高、精確度高和準確 度高等特點，對儀器設備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無污染等優(yōu)點，適用于大 批量樣品篩選的定性、定量檢測，可在貝類食品的快速檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1軟骨藻酸標準曲線。
具體實施例方式以下實例將結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。本實施例在以本發(fā)明技術方案為前 提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的 條件。實施例1試劑盒組分的制備1. 1軟骨藻酸人工抗原的合成取Img軟骨藻酸(DA)溶于少量溶劑(二甲基亞砜水=1 9)中，加入0. 8mg N-羥基琥珀酰亞胺(20mg/mL，臨用現(xiàn)配)、1.2mg水溶性碳二亞胺(10mg/mL，臨用現(xiàn)配)及 少量0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)，混合均勻后置于25°C培養(yǎng)箱內反應2h。隨后轉移
4至4°C冰箱內，放置過夜。第二天加入2mg鑰孔血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，補 加少量0. lmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻后置于25°C培養(yǎng)箱內反應3h。將混合液置入超 濾管內管，4500rpm離心15min后，適量稀釋，分裝后保存于_20°C。1. 2軟骨藻酸特異性多克隆抗體的制備將上述軟骨藻酸-KLH偶聯(lián)物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液備用。選用4只體重1.8_2kg健康雌性新西蘭大白兔。將偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑 通過注射器混合成油包水的乳濁液，按lmg/kg體重的量首次免疫，采取頸背部皮下多點注 射。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免 疫。從第三次免疫開始，每次免疫后7天，耳緣靜脈取血1ml，進行抗體效價檢測，當抗體效 價不再升高時，不加佐劑進行最后一次(第9次)免疫，7天后心臟放血，室溫靜置30min 后，37°C溫育lh，使血液凝固，后4°C過夜，4000r/min離心15分鐘，除去血塊，血清部分辛 酸-硫酸銨法進行純化透析，即得多克隆抗體，分裝后，冰凍保存。1. 3酶標板的準備用包被緩沖液(0. 05-0. lmol/L, pH9. 6的碳酸鹽緩沖液)將軟骨藻酸和牛血清白 蛋白(BSA)的偶聯(lián)物DA-BSA稀釋成lug/ml，96孔板每孔包被100μ 1，4°C過夜。倒出孔內液 體，用洗滌液振蕩洗滌3次，每次3min，拍干。每孔加200μ1封閉液(1%聚乙烯醇溶液)， 37°C封閉2h。倒出孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實施例2檢測軟骨藻酸酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下列組分(1)包被了軟骨藻酸與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物的酶標板；(2)濃度為8. 4ug/L的軟骨藻酸特異性多克隆抗體工作液；(3)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體； (4)軟骨藻酸標準品溶液，濃度分別為Ong/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL、500ng/mL、1 μ g/mL、10 μ g/mL ；(5)包被緩沖液為0. 05mol/L, pH9. 6的碳酸鹽緩沖液；(6)封閉液為的聚乙烯醇溶液；(7)洗滌液為含0. 05 %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；(8)抗體稀釋液為含4%的聚乙二醇溶液；(9)底物顯色液由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫，顯色劑B為四
甲基聯(lián)苯胺；(10)反應終止液為lmol/L的硫酸溶液。實施例3貝類樣品中軟骨藻酸的檢測3. 1樣品前處理取生鮮帶殼或冷凍后在室溫下半解凍的樣品，用刀切開閉殼肌取出貝肉，將可食 部分與中腸腺分離，放在網孔細小的金屬網上浙水5min。取5g樣品，加入IOmL勻漿液 (50%甲醇水溶液)，勻漿后，漩渦振蕩lmin，超聲提取5min ；4000rpm離心20min。移出上 清液至25mL容量瓶，剩余殘渣再加入勻漿液5mL，重復提取兩次，上清液均移至25mL容量瓶 內，蒸餾水定容。0. 22 μ m濾膜過濾。
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3. 2用試劑盒進行檢測向軟骨藻酸半抗原與卵血清蛋白(BSA)偶聯(lián)物包被的酶標板微孔中加入50 μ 1用 4%聚乙二醇的抗體稀釋液稀釋的多克隆抗體，同時，每孔再加入待測樣品50 μ 1，每塊板同 時做標線，37°C溫育lh。洗滌3次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗 工作液100μ 1，37°C溫育lh，洗滌5次，拍干。每孔加新鮮配制的底物顯色液100 μ 1，顯色 IOmin后每孔加終止液50 μ 1。輕輕震蕩混勻，用酶標儀測定每孔的吸光度值。3. 3結果分析計算百分吸光度值，繪制標準曲線；所獲得的每個濃度標準溶液或樣品吸光度值的平均值(A)除以第一個標準(0標 準)的吸光度值(A0)再乘以100%，即抑制率。抑制率(%) = (Α/Α0Χ 100% )公式中A為標準溶液或者樣本溶液的平均吸光度值，A0為Ong/mL標準溶液的平 均吸光度值。以軟骨藻酸標準系列濃度的對數(shù)作為橫坐標、以抑制率為縱坐標，繪制標準曲 線，校正曲線在0. 01 10 μ g/mL有良好的線性，相對應每一個樣品中軟骨藻酸的濃度可以 從標準曲線上讀出。實施例4試劑盒靈敏度測定利用軟骨藻酸標準品溶液進行反應，根據(jù)實驗結果繪制標準曲線(圖1)，由圖1可 得直線方程為Y = 109. 40-15. 45X，抑制率(Α/Α0)與軟骨藻酸的對數(shù)值在濃度為0. 01 10 μ g/mL范圍內呈顯著的線性關系，相關系數(shù)為R2 = 0. 9682，以抑制率為90%時的濃度作 為最低檢測限，可得最低檢測限約為18ng/mL。實施例5回收率實驗取3個濃度的軟骨藻酸標樣，添加到樣品中，每個濃度設6個重復，進行測定。試劑盒回收率的結果如下，紅心貝為95. 2 101. 3%，扇貝為49. 6 84. 7%，文 蛤為47. 2 65%實施例5試劑盒保存期實驗試劑盒保存條件為2_8°C，經過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零添加)、 50%抑制濃度、軟骨藻酸添加實際測定值均在正常范圍之內?？紤]在運輸和使用過程中，會 有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存條件下放置兩周，進行加速老化實驗，結果表 明該試劑盒各項指標完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20°C冰 箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在 2-8°C保存12個月以上。
權利要求
一種檢測貝類樣品中軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，包括包含軟骨藻酸特異性抗體、包被了軟骨藻酸抗原的酶標板、酶標二抗、軟骨藻酸標準溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌液、抗體稀釋液、顯色劑與終止液；所述酶標板采用96或40孔酶標板，包被有能與抗軟骨藻酸抗體特異結合的軟骨藻酸抗原，并封閉微孔表面未吸附軟骨藻酸抗原的位點。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述軟骨藻酸 特異性抗體為兔抗軟骨藻酸多克隆抗體。
3.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述軟骨藻酸 抗原是采用碳二亞胺法、活潑酯法或混合酸酐法將軟骨藻酸小分子半抗原與載體蛋白進行 偶聯(lián)得到。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述酶標記二 抗是辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體。
5.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述包被緩沖 液為0. 05-0. lmol/L, ρΗ9· 6的碳酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述封閉液為 1-3%的聚乙烯醇溶液。
7.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述洗滌液為 含0. 05-5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述抗體稀釋 液為含4-10%的聚乙二醇溶液。
9.根據(jù)權利要求1所述的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述顯色液為 由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫，顯色劑B為四甲基聯(lián)苯胺。
10.一種根據(jù)權利要求1所述的試劑盒檢測貝類樣品中軟骨藻酸的方法，其特征在于， 包括以下步驟①樣品前處理；②用上述試劑盒對樣品進行檢測，向包被有軟骨藻酸抗原的酶標板孔中加入標準品或 樣品溶液和抗體稀釋液；③溫育后洗滌拍干，再加入酶標二抗；④進一步溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；⑤分析檢測結果。
全文摘要
一種生物檢測技術領域的檢測軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒。試劑盒包括包含軟骨藻酸特異性抗體、包被了軟骨藻酸抗原的酶標板、酶標二抗、軟骨藻酸標準溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌液、抗體稀釋液、顯色劑與終止液；檢測方法為用試劑盒對經過前處理的樣品進行檢測；向包被有軟骨藻酸抗原的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液和抗體稀釋液；溫育后洗滌拍干，再加入酶標二抗；進一步溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；分析檢測結果。本發(fā)明具有特異性高、靈敏度高、精確度高和準確度高等特點，對儀器設備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無污染等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/543GK101949923SQ20101028345
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權日2010年9月16日
發(fā)明者劉元嫄, 程金平, 高利利 申請人:上海交通大學