專利名稱：16個(gè)基因座快速復(fù)合pcr擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人類基因組DNA中多個(gè)STR基因座的試劑盒，具體涉及一種 檢測(cè)15個(gè)STR基因座和1個(gè)性別鑒定基因座的快速復(fù)合PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒，屬于生 物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
短串聯(lián)重復(fù)序列基因座(STR)是目前普遍應(yīng)用的遺傳標(biāo)記。90年代初STR基因 座多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)，特別是由于STR基因座的片段小、容易擴(kuò)增，適宜于檢驗(yàn)微量和降解檢 材，而且各基因座的擴(kuò)增條件相似而能夠復(fù)合擴(kuò)增，因而具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、信息量大等 優(yōu)點(diǎn)。尤其是在建立DNA數(shù)據(jù)庫方面，STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)具有極大的優(yōu)越性，因此法醫(yī)學(xué) 界以及一些大的公司均投入大量的資金對(duì)其進(jìn)行了開發(fā)性的研究。90年代中后期以美國(guó) ABI公司為代表的研發(fā)商建立起了熒光復(fù)合擴(kuò)增體系。目前最具代表性的是ABI (Applied Biosystems, USA)公司的 Identifilerll^nPromega(USA)公司的 PowerPlex-16 熒光檢測(cè) 試齊U盒。法醫(yī)DNA分析就是利用DNA分型技術(shù)，確定現(xiàn)場(chǎng)法醫(yī)物證的DNA基因型，并應(yīng)用同 樣技術(shù)確定犯罪嫌疑人的DNA基因型，通過兩者的比對(duì)，從而認(rèn)定犯罪事實(shí)或排除犯罪嫌 疑。隨著法醫(yī)DNA分型技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)能對(duì)類似血痕、精斑、唾液斑、毛發(fā)、骨骼等進(jìn) 行DNA分型，達(dá)到認(rèn)定水平，成為刑事技術(shù)中科技含量最高、實(shí)用性最強(qiáng)的方法之一，檢驗(yàn) 結(jié)果得到了司法機(jī)關(guān)特別是審判機(jī)關(guān)的普遍采信，DNA分型技術(shù)成為刑事偵查和法庭審判 的最重要依據(jù)之一。目前的STR分型技術(shù)，往往包括樣本檢材的DNA提取、PCR擴(kuò)增和分型檢測(cè)三項(xiàng)主 要操作步驟，獲得一個(gè)樣本的最終分型結(jié)果往往需要8個(gè)小時(shí)以上?？s短樣本DNA檢驗(yàn)時(shí) 間，在實(shí)際檢案中將有利于快速鎖定犯罪嫌疑人，或排除無辜人員，在案件偵破過程中具有 重要意義，已經(jīng)成為科研攻關(guān)的一個(gè)新的重點(diǎn)，是法庭科學(xué)DNA分型技術(shù)發(fā)展的必然方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種能夠縮短獲得樣本 最終分型結(jié)果時(shí)間的16基因座快速復(fù)合PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目，采取的技術(shù)方案一種16個(gè)基因座快速復(fù)合PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè) 試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增后的基因分型用試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，熱啟動(dòng)快 速Taq酶，16對(duì)引物混合物以及超純水；所述擴(kuò)增后試劑包括用于基因分型的對(duì)應(yīng)于15個(gè)STR基因座和Amelogenin性 別鑒定基因座的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物的混合物和內(nèi)標(biāo)；所述的16 個(gè)基因座為Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21Sll、TP0X、TH01、CSFlP0、vWA、FGA。本發(fā)明提供了熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系的基因座組合設(shè)計(jì)方案。本發(fā)明分別選用了藍(lán)、綠、黃、紅、橙5色熒 光組合方案。這種基因座組合方式使得僅需標(biāo)記四種熒光就可實(shí)現(xiàn)這16個(gè)基因座在同一 反應(yīng)中擴(kuò)增，同時(shí)將全部基因座擴(kuò)增產(chǎn)物控制在400bp以內(nèi)而實(shí)現(xiàn)高靈敏度。確定5色熒光組合方案的基礎(chǔ)上，通過大量反復(fù)實(shí)驗(yàn)，自行設(shè)計(jì)出基因座組合 方式，以下為其中三種產(chǎn)品組合方式，第一種Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820和 D16S539 一組，采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為6-FAM ；TPOX、THOl、D2S1338、CSFlPO 為一組，采用綠色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為HEX ；vffA, D5S818、FGA、D6S1043為一組，采 用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51為一組，采用紅色 熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為ROX ；內(nèi)標(biāo)選用橙色熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為SIZ。第二種 Amelogenin、D3S1358、D13S 317、D7S820、D16S539 和 D6S1043 為一組，采用藍(lán)色熒光染料標(biāo) 記，熒光標(biāo)記物為6-FAM ；TP0X、TH01、D2S1338和CSFlPO為一組，采用綠色熒光染料標(biāo)記，熒 光標(biāo)記物為HEX ；vWA、D5S818和FGA為一組，采用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ； D8S1179、D21S11和D18S51為一組，采用紅色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為R0X。第三種 Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539 和 CSFlPO —組，采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記， 熒光標(biāo)記物為6-FAM ；TPOX、THOl、D2S1338和D6S1043為一組，采用綠色熒光染料標(biāo)記，熒 光標(biāo)記物為HEX ；vWA、D5S818和FGA為一組，采用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ； D8S1179、D21S11和D18S51為一組，采用紅色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為R0X;內(nèi)標(biāo)選用橙 色熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為SIZ。進(jìn)一步，使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)的條件PCR擴(kuò)增體系的PH值 為8. 0-9. 0，鎂離子濃度為1. 5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300 μ M，牛血清蛋白在 所述PCR擴(kuò)增體系中的終濃度為0. 1-lmg/ml,以及熱啟動(dòng)快速Taq酶的用量為0. 1-0. 4U/ μ L，16對(duì)引物混合物中的單對(duì)引物終濃度為0. 2-2. 0μΜο進(jìn)一步，使用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體 系中同時(shí)擴(kuò)增15個(gè)STR基因座和1個(gè)性別鑒定基因座。所述的16對(duì)引物為分別位于所述16個(gè)基因座兩側(cè)并用于擴(kuò)增該基因座的引物， 其中每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。所述16個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì) 管電泳進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步地，其中所檢測(cè)的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿 抽提法對(duì)來源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ；所述的來源樣本為來源于人類的濾紙片血液/ 口腔拭子樣本、FTA卡血液/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、精斑、唾液斑、 毛發(fā)或骨骼檢材。進(jìn)一步地，使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在任何型號(hào)的PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序94-98 0C 30-120s ；26-32 個(gè)循環(huán)的 94-98 °C l_15s，55-65 °C 5_30s， 72°C 5-30s ；72°C l_5min，擴(kuò)增約需時(shí) 40_50min。本發(fā)明實(shí)施例的有益效果是使用現(xiàn)常用商品化試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增常需要3h左 右的時(shí)間；而使用本發(fā)明的試劑盒，進(jìn)行40-50min的PCR擴(kuò)增，即可進(jìn)一步進(jìn)行遺傳分析儀 檢測(cè)，完成STR分型檢測(cè)，大大縮短了獲得樣本最終分型結(jié)果的時(shí)間。


圖1是本發(fā)明的試劑盒基因座排布1對(duì)血斑來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖2是本發(fā)明的試劑盒基因座排布1對(duì)精斑來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖3是本發(fā)明的試劑盒基因座排布1對(duì)唾液來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖4是本發(fā)明的試劑盒基因座排布1對(duì)脫落細(xì)胞來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖5是本發(fā)明的試劑盒基因座排布1對(duì)肌肉組織來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖6是本發(fā)明的試劑盒基因座排布1對(duì)毛發(fā)來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖7是對(duì)照-常規(guī)熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)血斑來源DNA擴(kuò)增后的分型 結(jié)果；圖8是對(duì)照-常規(guī)熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)精斑來源DNA擴(kuò)增后的分型
結(jié)果；圖9實(shí)施例3對(duì)肌肉來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖10實(shí)施例4對(duì)毛發(fā)來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖11實(shí)施例5親子鑒定分型結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1 16個(gè)基因座快速復(fù)合PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取純化的DNA樣本，基因座 排布按第一種排布。即排布方式為Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820 和 D16S539 一 組，采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為6-FAM ；TPOX、THOl、D2S1338和CSFlPO為一組， 采用綠色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為HEX ；vWA、D5S818、FGA和D6S1043為一組，采用黃色 熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51為一組，采用紅色熒光染料 標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為ROX ；內(nèi)標(biāo)選用橙色熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為SIZ。1、各種檢材樣品由X X公安局提供。2、各種檢材的基因組DNA提取各種檢材基因組DNA的提取參考《GA/T 383-2002法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》 進(jìn)行。3、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析3. 116基因座快速PCR熒光檢測(cè)試劑盒3. 1. IPCR 擴(kuò)增體系:
權(quán)利要求
一種16個(gè)基因座快速復(fù)合PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增后的基因分型用試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，熱啟動(dòng)快速Taq酶，16對(duì)引物混合物以及超純水；所述擴(kuò)增后試劑包括用于基因分型的對(duì)應(yīng)于15個(gè)STR基因座和1個(gè)性別鑒定基因座的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物的混合物和內(nèi)標(biāo)；所述的16個(gè)基因座為Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、TPOX、TH01、CSF1PO、vWA、FGA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的16個(gè)基因座分為4組，并分別用 4中不同的顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，分組方式為Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820 和D16S539 —組，采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為6-FAM ；TPOX、THOU D2S1338和 CSFlPO為一組，采用綠色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為HEX ；vWA、D5S818、FGA和D6S1043為 一組，采用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51為一組，采 用紅色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為ROX ；內(nèi)標(biāo)選用橙色熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為SIZ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的16個(gè)基因座分為4組，并分 別用4中不同的顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，分組方式為=AmeIogeniru D3S1358、D13S317、 D7S820、D16S539和D6S1043為一組，采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為6-FAM ；ΤΡ0Χ、 THOl、D2S1338和CSFlPO為一組，采用綠色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為HEX ；vWA、D5S818 和FGA為一組，采用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51為 一組，采用紅色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為ROX ；內(nèi)標(biāo)選用橙色熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為 SIZ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的16個(gè)基因座分為4組，并分 別用4中不同的顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，分組方式為=AmeIogeniru D3S1358、D13S317、 D7S820、D16S539和CSFlPO為一組，采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為6-FAM ；ΤΡ0Χ、 TH0UD2S1338和D6S1043為一組，采用綠色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為HEX ；vWA、D5S818 和FGA為一組，采用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51為 一組，采用紅色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為ROX ；內(nèi)標(biāo)選用橙色熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為 SIZ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR 復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)的條件PCR擴(kuò)增體系的pH值為8. 0-9. 0，鎂離子濃度為1. 5-3. 5mM，4種dNTP 的終濃度各為200-300 μ Μ,牛血清蛋白在所述PCR擴(kuò)增體系中的終濃度為0. 1-lmg/ml, 以及熱啟動(dòng)快速Taq酶的用量為0. 1-0. 4U/ μ L，16對(duì)引物混合物中的單對(duì)引物終濃度為 0. 2-2. 0 μ Μ。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于使用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增 階段反應(yīng)在一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增15個(gè)STR基因座和Amelogenin性別鑒定基 因座。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的16對(duì)引物為分別位于所述16個(gè) 基因座兩側(cè)并用于擴(kuò)增該基因座的引物，其中每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述16個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于其中所檢測(cè)的人基因組DNA 為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對(duì)來源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ；所述的 來源樣本為來源于人類的濾紙片血液/ 口腔拭子樣本、FTA卡血液/ 口腔拭子樣本、口腔 拭子樣本、血液/痕、組織、精斑、唾液斑、毛發(fā)或骨骼檢材。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在任何型號(hào)的PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增時(shí)間40分鐘至1小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)人類基因組DNA 16個(gè)基因座的快速復(fù)合PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增前試劑和擴(kuò)增后試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的反應(yīng)混合物，熱啟動(dòng)快速Taq酶，16對(duì)引物混合物以及超純水；所述擴(kuò)增后試劑包括用于基因分型的等位基因混合物和內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明只需對(duì)人基因組DNA樣本進(jìn)行約40-50min的核酸擴(kuò)增，即可進(jìn)行STR分型檢測(cè)，單管擴(kuò)增檢測(cè)可以同時(shí)獲得15個(gè)STR基因座和1個(gè)性別鑒定基因座的分型結(jié)果，大大縮短了獲得樣本最終分型結(jié)果的時(shí)間。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101956008SQ20101028241
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者倪崢飛, 周懷谷, 夏子芳, 杜蔚安, 楊輝, 鄭衛(wèi)國(guó), 陶莉 申請(qǐng)人:無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司;上海市公安局物證鑒定中心