專利名稱：一種多重檢測免疫層析芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多重檢測免疫層析芯片，將免疫層析技術(shù)與芯片技術(shù)有機(jī)融合，可以實現(xiàn)一份樣品中多種目標(biāo)被檢物的同時檢測。
背景技術(shù)：
免疫層析技術(shù)是一種成熟的現(xiàn)場快速檢測技術(shù)，其物理結(jié)構(gòu)包括以下幾個部分 粘性底襯、樣品墊、結(jié)合墊、分析膜以及吸水墊，其中結(jié)合墊中固定有示蹤物-生物活性分子的結(jié)合物，而分析膜上則固定有不同種類的生物分子作為檢測帶和質(zhì)控帶。樣品墊、結(jié)合墊、分析膜以及吸水墊按照一定的重疊關(guān)系固定于粘性底襯，從而保證了液體在層析試紙內(nèi)部流動的連續(xù)性。檢測的過程中操作者只需將液體樣品滴加于樣品墊上，樣品滲透入結(jié)合墊使其中固定的結(jié)合物重新溶解游離，并在吸水墊以及毛細(xì)作用的帶動下，通過檢測帶與質(zhì)控帶向吸水墊的方向移動，在這一過程中將根據(jù)樣品中目標(biāo)被檢物的有無，在檢測帶與質(zhì)控帶上發(fā)生特異的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生可檢測的信號。由于所有檢測所需的生物試劑已經(jīng)全部固定于成品試紙，操作者只需完成滴加液體樣品的過程，且整個檢測流程只需 10-15分鐘，因而免疫層析是最為簡便、快捷的現(xiàn)場檢測手段，但其通常只能對一種靶標(biāo)進(jìn)行分析，高通量檢測未能實現(xiàn)。芯片技術(shù)的產(chǎn)生便是順應(yīng)了生物分析對于靶標(biāo)(核酸或蛋白)高通量檢測的需求，其通過點樣儀將作為檢測探針的核酸或蛋白固定于玻璃片基的不同區(qū)域構(gòu)成相對分離的檢測矩陣，矩陣中的每個區(qū)域?qū)?yīng)于一種靶標(biāo)的檢測。將樣品直接滴加于芯片的檢測矩陣區(qū)域，經(jīng)過孵育(使核酸雜交或免疫反應(yīng)得以發(fā)生)、清洗、示蹤等步驟，在芯片上將根據(jù)靶標(biāo)的有無從而在特定區(qū)域產(chǎn)生可檢測的信號。與免疫層析的均相反應(yīng)(homogeneous)只需的一步加樣有所不同，芯片技術(shù)尤其是蛋白芯片技術(shù)屬于異相反應(yīng)(heterogeneous)，其操作過程不可避免的需要反復(fù)的孵育、清洗等過程，且對操作的標(biāo)準(zhǔn)化以及操作的環(huán)境有極為嚴(yán)格的要求，無法實現(xiàn)現(xiàn)場甚至是一線實驗室的檢測需求。免疫層析技術(shù)和芯片技術(shù)的區(qū)別特征詳見附圖1所示若能將免疫層析的快速便捷與芯片技術(shù)的高通量有機(jī)融合，研制可在現(xiàn)場以簡便的操作實現(xiàn)高通量檢測目的的新型技術(shù)，則可更好的滿足疾控系統(tǒng)等現(xiàn)場檢監(jiān)測部門對于高通量快速篩查的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于公開一種多重檢測免疫層析芯片，其可克服在先技術(shù)中，免疫層析技術(shù)無法高通量檢測以及芯片技術(shù)操作復(fù)雜無法現(xiàn)場使用的缺點，通過將免疫層析反應(yīng)模式與芯片檢測矩陣設(shè)置有機(jī)融合，最終實現(xiàn)了以現(xiàn)場簡便操作為前提的高通量檢測，即一次加樣實現(xiàn)多種目標(biāo)被檢物的同步檢測。本發(fā)明的目的是通過如下方案實現(xiàn)的。本發(fā)明免疫層析芯片的結(jié)構(gòu)組成為
粘性底襯[1]、樣品墊[2]、結(jié)合墊[3]、分析膜[4]和吸水墊[5]。(如附圖2所示)其中，粘性底襯[1]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板。其中，樣品墊[2]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)吸水紙、纖維素膜、 玻璃纖維、無紡布或濾血膜。其中，結(jié)合墊[3]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)玻璃纖維、聚酯膜或無紡布；結(jié)合墊[3]中固定有若干種檢測結(jié)合物W]與一種質(zhì)控結(jié)合物[7]；檢測結(jié)合物 [6]由示蹤物[8]和液相檢測探針[9]連接而成，并與被檢靶標(biāo)[10]特異性的一一對應(yīng)； 質(zhì)控結(jié)合物[7]由示蹤物[8]和液相質(zhì)控探針[11]連接而成，可質(zhì)控層析過程正常與否。其中，分析膜[4]是微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)硝酸纖維素膜或尼龍膜；分析膜[4]上設(shè)置有一個檢測矩陣單元[12]；每個檢測矩陣單元[12]包括一個檢測區(qū)[13]與一個質(zhì)控區(qū)[14]；檢測區(qū)[13]由多種固相檢測探針[15]構(gòu)成，質(zhì)控區(qū)[14]由一種固相質(zhì)控探針 [16]構(gòu)成；檢測區(qū)[13]中的每種固相檢測探針[15]位置明確固定對應(yīng)于一種被檢靶標(biāo) [10]的特異性檢測，而質(zhì)控區(qū)[14]中的固相質(zhì)控探針[16]位置明確固定用于質(zhì)控整個層析流程是否正常。其中，吸水墊[5]是具有較大床體積的物質(zhì)吸水紙或纖維素膜。其中，每種被檢靶標(biāo)[10]對應(yīng)兩個檢測探針，一個作為固相檢測探針[15]固定于分析膜[4]上，一個作為液相檢測探針[9]與示蹤物[8]結(jié)合成為固定于結(jié)合墊[3]內(nèi)的檢測結(jié)合物[6]。其中，固相檢測探針[15]在分析膜[4]上檢測區(qū)[13]內(nèi)的位置明確固定，對應(yīng)于每種被檢靶標(biāo)[10]的特異性檢測，與被檢靶標(biāo)[10]以及檢測結(jié)合物[6]中的液相檢測探針[9]之間可發(fā)生特異的免疫反應(yīng)，通過免疫反應(yīng)改變固相檢測探針[15]所在明確固定位置處結(jié)合的示蹤物[8]量，通過示蹤物[8]量的改變揭示被檢靶標(biāo)[10]的有無以及濃度。其中，固相質(zhì)控探針[16]在分析膜[4]上質(zhì)控區(qū)[14]內(nèi)的位置明確固定，可與質(zhì)控結(jié)合物[7]內(nèi)的液相質(zhì)控探針[11]直接結(jié)合，從而質(zhì)控層析過程正常與否。其中，本發(fā)明免疫層析芯片包括夾心模式免疫層析芯片、間接模式免疫層析芯片和競爭模式免疫層析芯片；其中夾心模式免疫層析芯片包括雙抗體夾心模式檢測抗原和雙抗原夾心模式檢測抗體兩種；間接模式是對血清樣品中的特定抗體進(jìn)行檢測，結(jié)合物為示蹤物與被檢抗體的二抗連接而成；競爭模式用于對只有一個抗原決定簇的半抗原等小分子物質(zhì)進(jìn)行檢測。本發(fā)明免疫層析芯片的制備方法為A.結(jié)合墊[3]制備將質(zhì)控結(jié)合物[7]和檢測結(jié)合物[6]混合得結(jié)合物混合液， 將結(jié)合物混合液加于作為結(jié)合墊[3]的玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，烘干備用；B.分析膜[4]制備將作為固相檢測探針[15]與固相質(zhì)控探針[16]的抗原、抗體以圓形斑點形式點在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，每種探針位置明確固定可以準(zhǔn)確尋址， 分別形成檢測區(qū)[13]與質(zhì)控區(qū)[14]，從而構(gòu)成一個檢測矩陣單元[12]；每個檢測矩陣單元[12]中，固相檢測探針[15]及其明確固定位置與被檢靶標(biāo)[10] —一對應(yīng)，固相質(zhì)控探針[16]只需一種且也具有明確固定位置；在分析膜[4]上連續(xù)噴點若干個檢測矩陣單元 [12]，烘干備用；(見附圖3)
C.本發(fā)明免疫層析芯片粘帖剪切成型將樣品墊[2]、結(jié)合墊[3]、分析膜[4]和吸水墊[5]依次粘帖于作為粘性底襯[1]的PVC板上，確保相互之間的重疊關(guān)系；自檢測矩陣單元[12]之間的分割點[17]將本發(fā)明免疫層析芯片剪切為單獨可用的成品，得本發(fā)明免疫層析芯片；成型的免疫層析芯片可直接使用或置入塑料外殼中使用。(見附圖4)一種用本發(fā)明免疫層析芯片進(jìn)行生物靶標(biāo)檢測的方法A.添加樣品將液體樣品或經(jīng)過預(yù)處理的液體樣品滴加至本發(fā)明免疫層析芯片的樣品墊[2]上；B.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；層析的過程中，檢測結(jié)合物W]、被檢靶標(biāo)[10]和固相檢測探針[15]之間發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，在分析膜W]的明確固定位置發(fā)生示蹤物[8]結(jié)合量的變化，示蹤物[8]的結(jié)合量直接反應(yīng)了被檢靶標(biāo)[10]的有無或多少；C.結(jié)果判讀對于帶有顏色的示蹤物[8]可直接肉眼觀察判定結(jié)果，對于產(chǎn)生光、 電或磁信號的示蹤物[8]需儀器進(jìn)行結(jié)果判讀；由于針對特定被檢靶標(biāo)[10]的固相檢測探針[15]在分析膜[4]上的位置明確固定，因而對明確固定位置上示蹤物[8]的信號，包括顏色、光、電或磁，進(jìn)行判讀即可實現(xiàn)某種被檢靶標(biāo)[10]的定性定量檢測。本發(fā)明免疫層析芯片的檢測原理為如附圖5所示，檢測中將液體樣品添加至樣品墊[2]上后，液體樣品自樣品墊[2]滲透入結(jié)合墊[3]；在液體樣品基質(zhì)的作用下，結(jié)合墊[3]中固定的檢測結(jié)合物W]與質(zhì)控結(jié)合物[7]將重新溶解游離，并同樣品中的被檢靶標(biāo)[10] —同離開結(jié)合墊[3]進(jìn)入分析膜W]，在毛細(xì)作用下，通過檢測區(qū)[13]與質(zhì)控區(qū) [14]向吸水墊[5]的方向涌動；在這一過程中，檢測結(jié)合物[6]與被檢靶標(biāo)[10]將按照免疫反應(yīng)模式的不同與檢測區(qū)[13]中位置明確固定的固相檢測探針[15]發(fā)生特異的免疫反應(yīng)，而質(zhì)控結(jié)合物[7]將直接與質(zhì)控區(qū)[14]的固相質(zhì)控探針[16]結(jié)合；由此通過分析膜 [4]上檢測區(qū)[13]內(nèi)位置明確固定的固相檢測探針[15]、被檢靶標(biāo)[10]、檢測結(jié)合物[6] 上連接的液相檢測探針[9]之間的特異性免疫反應(yīng)，改變了分析膜[4]上檢測區(qū)[13]內(nèi)明確固定位置處結(jié)合示蹤物[8]的量，最終明確固定位置處上示蹤物[8]信號的有無以及強(qiáng)弱變化則代表了某種特定被檢靶標(biāo)[10]的有無以及濃度高低；而分析膜[4]上質(zhì)控區(qū) [14]內(nèi)位置明確固定的固相質(zhì)控探針[16]與質(zhì)控結(jié)合物[7]上連接的液相質(zhì)控探針[11] 之間的直接結(jié)合，使得分析膜[4]上質(zhì)控區(qū)[14]內(nèi)明確固定位置處有示蹤物[8]結(jié)合，示蹤物[8]的存在則指示了層析過程的正常進(jìn)行。在傳統(tǒng)技術(shù)中，免疫層析技術(shù)無法高通量檢測，而芯片技術(shù)操作復(fù)雜無法現(xiàn)場使用。針對這些問題，在本發(fā)明中通過將免疫層析反應(yīng)模式與芯片檢測矩陣設(shè)置有機(jī)融合，設(shè)計了一種免疫層析芯片，最終實現(xiàn)了以現(xiàn)場簡便操作為前提的高通量檢測，即一次加樣實現(xiàn)多種目標(biāo)被檢物的同步檢測。


圖1 免疫層析技術(shù)與芯片技術(shù)比較；圖2 免疫層析芯片結(jié)構(gòu)組成圖；圖3:分析膜制備示意圖；圖4 免疫層析芯片粘帖剪切成型示意圖5 免疫層析芯片檢測原理圖；圖6 雙抗原夾心模式免疫層析芯片結(jié)構(gòu)組成圖；圖7 雙抗原夾心模式免疫層析芯片檢測原理圖；圖8 間接模式免疫層析芯片結(jié)構(gòu)組成圖；圖9 間接模式免疫層析芯片檢測原理圖；圖10 競爭模式免疫層析芯片結(jié)構(gòu)組成圖；圖11 競爭模式免疫層析芯片檢測原理圖。下述實施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。
具體實施例方式實施例1 雙抗原夾心模式免疫層析芯片雙抗原夾心模式免疫層析芯片用于對血清樣品中的特定抗體進(jìn)行檢測，檢測結(jié)合物為示蹤物與被檢抗體的特異性抗原連接而成。雙抗原夾心模式免疫層析芯片的結(jié)構(gòu)組成(附圖6)為雙抗原夾心模式免疫層析芯片由粘性底襯[Al]、樣品墊[A2]、結(jié)合墊[A3]、分析膜[A4]以及吸水墊[A5]構(gòu)成；粘性底襯[Al]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板，其可使樣品墊[A2]、結(jié)合墊[A3]、分析膜[A4]以及吸水墊[A5]按照適當(dāng)?shù)闹丿B關(guān)系粘帖固定，從而保證液體在雙抗原夾心模式層析芯片內(nèi)部流動的連續(xù)性；樣品墊[A2]是吸水紙，其為雙抗原夾心模式免疫層析芯片使用過程中添加液體樣品的位置；結(jié)合墊[A3]是玻璃纖維；結(jié)合墊[A3]中固定有若干種檢測結(jié)合物[A6]與一種質(zhì)控結(jié)合物[A7]；檢測結(jié)合物[A6]由示蹤物[A8]以及液相檢測抗原[A9]連接而成，并與被檢抗體[A10]特異性的一一對應(yīng)；質(zhì)控結(jié)合物[A7]由示蹤物[A8]以及液相質(zhì)控抗原[All] 連接而成，可質(zhì)控層析過程正常與否；分析膜[A4]是硝酸纖維素膜；其中，分析膜[A4]上設(shè)置有一個檢測矩陣單元 [A12]；每個檢測矩陣單元[A12]包括一個檢測區(qū)[A13]與一個質(zhì)控區(qū)[A14]；檢測區(qū)[A13] 由多種固相檢測抗原[A15]構(gòu)成，質(zhì)控區(qū)[A14]由一種固相質(zhì)控抗體[A16]構(gòu)成；檢測區(qū) [A13]中的每種固相檢測抗原[A15]位置明確固定對應(yīng)于一種被檢抗體[A10]的特異性檢測，而質(zhì)控區(qū)[A14]中的固相質(zhì)控抗體[A16]位置明確固定用于質(zhì)控整個層析流程是否正常；吸水墊[A5]是吸水紙。雙抗原夾心模式免疫層析芯片的制備方法為A.結(jié)合墊[A3]制備將質(zhì)控結(jié)合物[A7]和檢測結(jié)合物[A6]混合得結(jié)合物混合液，將結(jié)合物混合液加于作為結(jié)合墊[A3]的玻璃纖維上，烘干備用；B.分析膜[A4]制備將固相檢測抗原[A15]以及固相質(zhì)控抗體[A16]以圓形斑點形式點在硝酸纖維素膜上，每種抗原和抗體的位置明確固定可以準(zhǔn)確尋址，分別形成檢測區(qū)[A13]與質(zhì)控區(qū)[A14]，從而構(gòu)成一個檢測矩陣單元[A12]；每個檢測矩陣單元[A12]中， 固相檢測抗原[A15]及其明確固定位置與被檢抗體[A10] —一對應(yīng)，固相質(zhì)控抗體[A16]只需一種且也具有明確固定位置；在分析膜[A4]上連續(xù)噴點若干個檢測矩陣單元[A12]， 烘干備用；C.本發(fā)明免疫層析芯片粘帖剪切成型將樣品墊[A2]、結(jié)合墊[A3]、分析膜[A4] 和吸水墊[A5]依次粘帖于作為粘性底襯[Al]的PVC板上，確保相互之間的重疊關(guān)系；自檢測矩陣單元[A12]之間的分割點[17]將本發(fā)明免疫層析芯片剪切為單獨可用的成品，得本發(fā)明免疫層析芯片；成型的免疫層析芯片可直接使用或置入塑料外殼中使用。用上述本發(fā)明雙抗原夾心模式免疫層析芯片進(jìn)行生物靶標(biāo)檢測的方法A.添加樣品將液體樣品或經(jīng)過預(yù)處理的液體樣品滴加至本發(fā)明免疫層析芯片的樣品墊[A2]上；B.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；層析的過程中，檢測結(jié)合物[A6]、被檢抗體[A10]和固相檢測抗原[A15]之間發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，在分析膜[A4]的明確固定位置發(fā)生示蹤物[A8]結(jié)合量的變化，示蹤物[A8]的結(jié)合量直接反應(yīng)了被檢抗體[A10]的有無或多少；C.結(jié)果判讀對于帶有顏色的示蹤物[A8]可直接肉眼觀察判定結(jié)果，對于產(chǎn)生光、電或磁信號的示蹤物[A8]需儀器進(jìn)行結(jié)果判讀；由于針對特定被檢抗體[A10]的固相檢測抗原[A15]在分析膜[A4]上的位置明確固定，因而對明確固定位置上示蹤物[A8]的信號，包括顏色、光、電或磁，進(jìn)行判讀即可實現(xiàn)某種被檢抗體[A10]的定性定量檢測。本發(fā)明雙抗原夾心模式免疫層析芯片的檢測原理(附圖7)為檢測中將液體樣品添加至樣品墊[A2]上后，液體樣品自樣品墊[A2]滲透入結(jié)合墊[A3]；在液體樣品基質(zhì)的作用下，結(jié)合墊[A3]中固定的檢測結(jié)合物[A6]與質(zhì)控結(jié)合物[A7]將重新溶解游離，并同樣品中的被檢抗體[A10] —同離開結(jié)合墊[A3]進(jìn)入分析膜 [A4]，在毛細(xì)作用下，通過檢測區(qū)[A13]與質(zhì)控區(qū)[A14]向吸水墊[A5]的方向涌動；在這一過程中，檢測結(jié)合物[A6]與被檢抗體[A10]的一個位點特異性的結(jié)合，同時被檢抗體[A10] 的另一個位點則與檢測區(qū)[A13]中位置明確固定的固相檢測抗原[A15]特異性的結(jié)合，而質(zhì)控結(jié)合物[A7]將直接與質(zhì)控區(qū)[A14]的固相質(zhì)控抗體[A16]結(jié)合；由此通過分析膜[A4] 上檢測區(qū)[A13]內(nèi)位置明確固定的固相檢測抗原[A15]、被檢抗體[A10]、檢測結(jié)合物[A6] 上連接的液相檢測抗原[A9]之間的特異性的雙抗原夾心模式免疫反應(yīng)，使得分析膜[A4] 上檢測區(qū)[A13]內(nèi)明確固定位置處發(fā)生了示蹤物[A8]的結(jié)合，最終明確固定位置處示蹤物 [A8]信號的有無以及強(qiáng)弱變化則代表了某種特定被檢抗體[A10]的有無以及濃度高低，其中示蹤物[A8]信號強(qiáng)度與被檢抗體[A10]濃度呈正；而分析膜[A4]上質(zhì)控區(qū)[A14]內(nèi)位置明確固定的固相質(zhì)控抗體[A16]與質(zhì)控結(jié)合物[A7]上連接的液相質(zhì)控抗原[All]之間的直接結(jié)合，使得分析膜[A4]上質(zhì)控區(qū)[A14]內(nèi)明確固定位置處有示蹤物[A8]結(jié)合，示蹤物[A8]的存在則指示了層析過程的正常進(jìn)行。實施例2 間接模式免疫層析芯片間接模式免疫層析芯片用于對血清樣品中的特定抗體進(jìn)行檢測，檢測結(jié)合物為示蹤物與被檢抗體的二抗連接而成。在此以對人血清樣品進(jìn)行檢測為例，進(jìn)行說明。間接模式免疫層析芯片的結(jié)構(gòu)組成(附圖8)為間接模式免疫層析芯片由粘性底襯[Bi]、樣品墊[B2]、結(jié)合墊[B3]、分析膜[B4] 以及吸水墊[B5]構(gòu)成；
粘性底襯[Bi]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板，其可使樣品墊[B2]、結(jié)合墊[B3]、分析膜[B4]以及吸水墊[B5]按照適當(dāng)?shù)闹丿B關(guān)系粘帖固定，從而保證液體在間接模式層析芯片內(nèi)部流動的連續(xù)性；樣品墊[B2]是纖維素膜，其為間接模式免疫層析芯片使用過程中添加液體樣品的位置；結(jié)合墊[B3]是聚酯膜；結(jié)合墊[B3]中固定有一種檢測結(jié)合物[B6]與一種質(zhì)控結(jié)合物[B7]；檢測結(jié)合物[B6]由示蹤物[B8]以及羊抗人IgG[B9]連接而成，可與被檢人抗體[B10]特異性反應(yīng)；質(zhì)控結(jié)合物[B7]由示蹤物[B8]以及羊抗兔IgG[Bll]連接而成，可質(zhì)控層析過程正常與否；分析膜[B4]是尼龍膜；其中，分析膜[B4]上設(shè)置有一個檢測矩陣單元[B12]；每個檢測矩陣單元[B12]包括一個檢測區(qū)[B13]與一個質(zhì)控區(qū)[B14]；檢測區(qū)[B13]由多種固相檢測抗原[B15]構(gòu)成，質(zhì)控區(qū)[B14]由一種固相質(zhì)控抗體[B16]即兔IgG構(gòu)成；檢測區(qū) [B13]中的每種固相檢測抗原[B15]位置明確固定對應(yīng)于一種被檢人抗體[B10]的特異性檢測，而質(zhì)控區(qū)[B14]中的固相質(zhì)控抗體[B16]位置明確固定用于質(zhì)控整個層析流程是否正常；吸水墊[B5]是纖維素膜。間接模式免疫層析芯片的制備方法為A.結(jié)合墊[B3]制備將質(zhì)控結(jié)合物[B7]和檢測結(jié)合物[B6]混合得結(jié)合物混合液，將結(jié)合物混合液加于作為結(jié)合墊[B3]的聚酯膜上，烘干備用；B.分析膜[B4]制備將固相檢測抗原[B15]以及固相質(zhì)控抗體[B16]以圓形斑點形式點在尼龍膜上，每種抗原和抗體的位置明確固定可以準(zhǔn)確尋址，分別形成檢測區(qū)[B13] 與質(zhì)控區(qū)[B14]，從而構(gòu)成一個檢測矩陣單元[B12]；每個檢測矩陣單元[B12]中，固相檢測抗原[B15]及其明確固定位置與被檢人抗體[B10] —一對應(yīng)，固相質(zhì)控抗體[B16]只需一種且也具有明確固定位置；在分析膜[B4]上連續(xù)噴點若干個檢測矩陣單元[B12]，烘干備用；C.本發(fā)明免疫層析芯片粘帖剪切成型將樣品墊[B2]、結(jié)合墊[B3]、分析膜[B4] 和吸水墊[B5]依次粘帖于作為粘性底襯[Bi]的PVC板上，確保相互之間的重疊關(guān)系；自檢測矩陣單元[B12]之間的分割點[17]將本發(fā)明免疫層析芯片剪切為單獨可用的成品，得本發(fā)明免疫層析芯片；成型的免疫層析芯片可直接使用或置入塑料外殼中使用。用上述本發(fā)明間接模式免疫層析芯片進(jìn)行生物靶標(biāo)檢測的方法A.添加樣品將液體樣品或經(jīng)過預(yù)處理的液體樣品滴加至本發(fā)明免疫層析芯片的樣品墊[B2]上；B.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；層析的過程中，檢測結(jié)合物[B6]、被檢人抗體[B10]和固相檢測抗原[B15]之間發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，在分析膜[B4]的明確固定位置發(fā)生示蹤物[B8]結(jié)合量的變化，示蹤物[B8]的結(jié)合量直接反應(yīng)了被檢人抗體[B10] 的有無或多少；C.結(jié)果判讀對于帶有顏色的示蹤物[B8]可直接肉眼觀察判定結(jié)果，對于產(chǎn)生光、電或磁信號的示蹤物[B8]需儀器進(jìn)行結(jié)果判讀；由于針對特定被檢人抗體[B10]的固相檢測抗原[B15]在分析膜[B4]上的位置明確固定，因而對明確固定位置上示蹤物[B8]的信號，包括顏色、光、電或磁，進(jìn)行判讀即可實現(xiàn)某種被檢人抗體[B10]的定性定量檢測。本發(fā)明間接模式免疫層析芯片的檢測原理(附圖9)為檢測中將液體樣品添加至樣品墊[B2]上后，液體樣品自樣品墊[B2]滲透入結(jié)合墊[B3]；在液體樣品基質(zhì)的作用下，結(jié)合墊[B3]中固定的檢測結(jié)合物[B6]與質(zhì)控結(jié)合物 [B7]將重新溶解游離，并同樣品中的被檢人抗體[B10] —同離開結(jié)合墊[B3]進(jìn)入分析膜 [B4]，在毛細(xì)作用下，通過檢測區(qū)[B13]與質(zhì)控區(qū)[B14]向吸水墊[B5]的方向涌動；在這一過程中，檢測結(jié)合物[B6]與被檢人抗體[B10]的一個位點特異性的結(jié)合，同時被檢人抗體 [B10]的另一個位點則與檢測區(qū)[B13]中位置明確固定的固相檢測抗原[B15]特異性的結(jié)合，而質(zhì)控結(jié)合物[B7]將直接與質(zhì)控區(qū)[B14]的固相質(zhì)控抗體[B16]即兔IgG結(jié)合；由此通過分析膜[B4]上檢測區(qū)[B13]內(nèi)位置明確固定的固相檢測抗原[B15]、被檢人抗體[B10]、 檢測結(jié)合物[B6]上連接的羊抗人IgG[B9]之間的特異性的免疫反應(yīng)，使得分析膜[B4]上檢測區(qū)[B13]內(nèi)明確固定位置處發(fā)生示蹤物[B8]的結(jié)合，最終明確固定位置處示蹤物[B8] 信號的有無以及強(qiáng)弱變化則代表了某種特定被檢人抗體[B10]的有無以及濃度高低，其中示蹤物[B8]信號強(qiáng)度與被檢人抗體[B10]濃度呈正比；而分析膜[B4]上質(zhì)控區(qū)[B14]內(nèi)位置明確固定的固相質(zhì)控抗體[B16]即兔IgG與質(zhì)控結(jié)合物[B7]上連接的羊抗兔IgG[Bll] 之間的直接結(jié)合，使得分析膜[B4]上質(zhì)控區(qū)[B14]內(nèi)明確固定位置處有示蹤物[B8]結(jié)合， 示蹤物[B8]的存在則指示了層析過程的正常進(jìn)行。實施例3 競爭模式免疫層析芯片競爭模式免疫層析芯片用于對只有一個抗原決定簇的半抗原等小分子物質(zhì)進(jìn)行檢測。競爭模式免疫層析芯片的結(jié)構(gòu)組成(圖10)為競爭模式免疫層析芯片由粘性底襯[Cl]、樣品墊[C2]、結(jié)合墊[C3]、分析膜[C4] 以及吸水墊[C5]構(gòu)成；粘性底襯[Cl]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板，其可使樣品墊[C2]、結(jié)合墊[C3]、分析膜[C4]以及吸水墊[C5]按照適當(dāng)?shù)闹丿B關(guān)系粘帖固定，從而保證液體在競爭模式層析芯片內(nèi)部流動的連續(xù)性；樣品墊[C2]是玻璃纖維，其為競爭模式免疫層析芯片使用過程中添加液體樣品的位置；結(jié)合墊[C3]是無紡布；結(jié)合墊[C3]中固定有若干種檢測結(jié)合物[C6]與一種質(zhì)控結(jié)合物[C7]；檢測結(jié)合物[C6]由示蹤物[C8]以及液相檢測抗原[C9]連接而成，并與被檢抗原[C10]特異性的一一對應(yīng)具有完全一致的抗原決定簇；質(zhì)控結(jié)合物[C7]由示蹤物 [C8]以及地高辛[C11]連接而成，可質(zhì)控層析過程正常與否；分析膜[C4]是硝酸纖維素膜；其中，分析膜[C4]上設(shè)置有一個檢測矩陣單元 [C12]；每個檢測矩陣單元[C12]包括一個檢測區(qū)[C13]與一個質(zhì)控區(qū)[C14]；檢測區(qū)[C13] 由多種固相檢測抗體[C15]構(gòu)成，質(zhì)控區(qū)[C14]由一種固相質(zhì)控抗體[C16]構(gòu)成；檢測區(qū) [C13]中的每種固相檢測抗體[C15]位置明確固定對應(yīng)于一種被檢抗原[C10]的特異性檢測，而質(zhì)控區(qū)[C14]中的固相質(zhì)控抗體[C16]即兔抗地高辛位置明確固定用于質(zhì)控整個層析流程是否正常；吸水墊[C5]是吸水紙。
競爭模式免疫層析芯片的制備方法為A.結(jié)合墊[C3]制備將質(zhì)控結(jié)合物[C7]和檢測結(jié)合物[C6]混合得結(jié)合物混合液，將結(jié)合物混合液加于作為結(jié)合墊[C3]的無紡布上，烘干備用；B.分析膜[C4]制備將固相檢測抗體[C15]以及固相質(zhì)控抗體[C16]以圓形斑點形式點在尼龍膜上，每種抗體的位置明確固定可以準(zhǔn)確尋址，分別形成檢測區(qū)[C13]與質(zhì)控區(qū)[C14]，從而構(gòu)成一個檢測矩陣單元[C12]；每個檢測矩陣單元[C12]中，固相檢測抗體[C15]及其明確固定位置與被檢抗原[C10] —一對應(yīng)，固相質(zhì)控抗體[C16]只需一種且也具有明確固定位置；在分析膜[C4]上連續(xù)噴點若干個檢測矩陣單元[C12]，烘干備用；C.本發(fā)明免疫層析芯片粘帖剪切成型將樣品墊[C2]、結(jié)合墊[C3]、分析膜[C4] 和吸水墊[C5]依次粘帖于作為粘性底襯[Cl]的PVC板上，確保相互之間的重疊關(guān)系；自檢測矩陣單元[C12]之間的分割點[17]將本發(fā)明免疫層析芯片剪切為單獨可用的成品，得本發(fā)明免疫層析芯片；成型的免疫層析芯片可直接使用或置入塑料外殼中使用。用上述本發(fā)明競爭模式免疫層析芯片進(jìn)行生物靶標(biāo)檢測的方法A.添加樣品將液體樣品或經(jīng)過預(yù)處理的液體樣品滴加至本發(fā)明免疫層析芯片的樣品墊[C2]上；B.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；層析的過程中，檢測結(jié)合物[C6]、被檢抗原[C10]和固相檢測抗體[C15]之間發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，在分析膜[C4]的明確固定位置發(fā)生示蹤物[C8]結(jié)合量的變化，示蹤物[C8]的結(jié)合量直接反應(yīng)了被檢抗原[C10]的有無或多少；C.結(jié)果判讀對于帶有顏色的示蹤物[C8]可直接肉眼觀察判定結(jié)果，對于產(chǎn)生光、電或磁信號的示蹤物[C8]需儀器進(jìn)行結(jié)果判讀；由于針對特定被檢抗原[C10]的固相檢測抗體[C15]在分析膜[C4]上的位置明確固定，因而對明確固定位置上示蹤物[C8]的信號，包括顏色、光、電或磁，進(jìn)行判讀即可實現(xiàn)某種被檢抗原[C10]的定性定量檢測。本發(fā)明競爭模式免疫層析芯片的檢測原理(圖11)為檢測中將液體樣品添加至樣品墊[C2]上后，液體樣品自樣品墊[C2]滲透入結(jié)合墊[C3]；在液體樣品基質(zhì)的作用下，結(jié)合墊[C3]中固定的檢測結(jié)合物[C6]與質(zhì)控結(jié)合物[C7]將重新溶解游離，并同樣品中的被檢抗原[C10] —同離開結(jié)合墊[C3]進(jìn)入分析膜 [C4]，在毛細(xì)作用下，通過檢測區(qū)[C13]與質(zhì)控區(qū)[C14]向吸水墊[C5]的方向涌動；在這一過程中，檢測結(jié)合物[C6]與被檢抗原[C10]以競爭方式與檢測區(qū)[C13]中位置明確固定的固相檢測抗體[C15]特異性的結(jié)合，而質(zhì)控結(jié)合物[C7]直接與質(zhì)控區(qū)[C14]的固相質(zhì)控抗體[C16]即兔抗地高辛結(jié)合；由此通過被檢抗原[C10]、檢測結(jié)合物[C6]上連接的液相檢測抗原[C9]對分析膜[C4]上檢測區(qū)[C13]內(nèi)位置明確固定的固相檢測抗體[C15]之間的特異性的競爭免疫反應(yīng)，使得分析膜[C4]上檢測區(qū)[C13]內(nèi)明確固定位置處發(fā)生了示蹤物[C8]結(jié)合量的改變，即被檢抗原[C10]不存在時檢測結(jié)合物[C6]占據(jù)了固相檢測抗體 [C15]全部的結(jié)合位點，從而產(chǎn)生最強(qiáng)的示蹤物[C8]信號，而當(dāng)被檢抗原[C10]存在時其與檢測結(jié)合物[C6]競爭固相檢測抗體[C15]上的結(jié)合位點，從而導(dǎo)致示蹤物[C8]信號的降低；最終明確固定位置處示蹤物[C8]信號的有無以及強(qiáng)弱變化代表了某種特定被檢抗原 [C10]的有無以及濃度高低，其中示蹤物[C8]信號強(qiáng)度與被檢抗原[C10]濃度呈反比；而分析膜[C4]上質(zhì)控區(qū)[C14]內(nèi)位置明確固定的固相質(zhì)控抗體[C16]即兔抗地高辛與質(zhì)控結(jié)合物[C7]上連接的地高辛[C11]之間的直接結(jié)合，使得分析膜[C4]上質(zhì)控區(qū)[C14]內(nèi)明確固定位置處有示蹤物[C8]結(jié)合，示蹤物[C8]的存在則指示了層析過程的正常進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種多重檢測免疫層析芯片，其特征在于該免疫層析芯片的結(jié)構(gòu)組成為粘性底襯[I]、樣品墊[2]、結(jié)合墊[3]、分析膜[4]和吸水墊[5]。
2.如權(quán)利要求1所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的粘性底襯[1]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板。
3.如權(quán)利要求1所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的樣品墊[2]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)吸水紙、纖維素膜、玻璃纖維、無紡布或濾血膜。
4.如權(quán)利要求1所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的結(jié)合墊[3]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)玻璃纖維、聚酯膜或無紡布；結(jié)合墊[3]中固定有若干種檢測結(jié)合物[6]與一種質(zhì)控結(jié)合物[7]；檢測結(jié)合物W]由示蹤物[8]和液相檢測探針[9]連接而成，并與被檢靶標(biāo)[10]特異性的一一對應(yīng)；質(zhì)控結(jié)合物[7]由示蹤物[8]和液相質(zhì)控探針[11]連接而成，可質(zhì)控層析過程正常與否。
5.如權(quán)利要求1所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的分析膜[4]是微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)硝酸纖維素膜或尼龍膜；分析膜[4]上設(shè)置有一個檢測矩陣單元[12]； 每個檢測矩陣單元[12]包括一個檢測區(qū)[13]與一個質(zhì)控區(qū)[14]；檢測區(qū)[13]由多種固相檢測探針[15]構(gòu)成，質(zhì)控區(qū)[14]由一種固相質(zhì)控探針[16]構(gòu)成；檢測區(qū)[13]中的每種固相檢測探針[15]位置明確固定對應(yīng)于一種被檢靶標(biāo)[10]的特異性檢測，而質(zhì)控區(qū)[14] 中的固相質(zhì)控探針[16]位置明確固定用于質(zhì)控整個層析流程是否正常。
6.如權(quán)利要求1所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的吸水墊[5]是具有較大床體積的物質(zhì)吸水紙或纖維素膜。
7.如權(quán)利要求4或5所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的每種被檢靶標(biāo)[10]對應(yīng)兩個檢測探針，一個作為固相檢測探針[15]固定于分析膜[4]上，一個作為液相檢測探針[9]與示蹤物[8]結(jié)合成為固定于結(jié)合墊[3]內(nèi)的檢測結(jié)合物W]。
8.如權(quán)利要求5所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的固相檢測探針[15] 在分析膜[4]上檢測區(qū)[13]內(nèi)的位置明確固定，對應(yīng)于每種被檢靶標(biāo)[10]的特異性檢測， 與被檢靶標(biāo)[10]以及檢測結(jié)合物[6]中的液相檢測探針[9]之間可發(fā)生特異的免疫反應(yīng)， 通過免疫反應(yīng)改變固相檢測探針[15]所在明確固定位置處結(jié)合的示蹤物[8]量，通過示蹤物[8]量的改變揭示被檢靶標(biāo)[10]的有無以及濃度。
9.如權(quán)利要求5所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于其中的固相質(zhì)控探針[16] 在分析膜[4]上質(zhì)控區(qū)[14]內(nèi)的位置明確固定，可與質(zhì)控結(jié)合物[7]內(nèi)的液相質(zhì)控探針[II]直接結(jié)合，從而質(zhì)控層析過程正常與否。
10.如權(quán)利要求1所述的多重檢測免疫層析芯片，其特征在于免疫層析芯片包括夾心模式免疫層析芯片、間接模式免疫層析芯片和競爭模式免疫層析芯片三種；其中夾心模式免疫層析芯片包括雙抗體夾心模式檢測抗原和雙抗原夾心模式檢測抗體兩種；間接模式是對血清樣品中的特定抗體進(jìn)行檢測，結(jié)合物為示蹤物與被檢抗體的二抗連接而成；競爭模式用于對只有一個抗原決定簇的半抗原等小分子物質(zhì)進(jìn)行檢測。
11.如權(quán)利要求1-10任一所述的多重檢測免疫層析芯片的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟A.結(jié)合墊[3]制備將質(zhì)控結(jié)合物[7]和檢測結(jié)合物[6]混合得結(jié)合物混合液，將結(jié)合物混合液加于作為結(jié)合墊[3]的玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，烘干備用；B.分析膜[4]制備將作為固相檢測探針[15]與固相質(zhì)控探針[16]的抗原、抗體以圓形斑點形式點在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，每種探針位置明確固定可以準(zhǔn)確尋址，分別形成檢測區(qū)[13]與質(zhì)控區(qū)[14]，從而構(gòu)成一個檢測矩陣單元[12]；每個檢測矩陣單元[12] 中，固相檢測探針[15]及其明確固定位置與被檢靶標(biāo)[10] —一對應(yīng)，固相質(zhì)控探針[16] 只需一種且也具有明確固定位置；在分析膜[4]上連續(xù)噴點若干個檢測矩陣單元[12]，烘干備用；C.本發(fā)明免疫層析芯片粘帖剪切成型將樣品墊[2]、結(jié)合墊[3]、分析膜[4]和吸水墊[5]依次粘帖于作為粘性底襯[1]的PVC板上，確保相互之間的重疊關(guān)系；自檢測矩陣單元[12]之間的分割點[17]將本發(fā)明免疫層析芯片剪切為單獨可用的成品，得本發(fā)明免疫層析芯片；成型的免疫層析芯片可直接使用或置入塑料外殼中使用。
12. —種生物靶標(biāo)檢測的方法，其特征在于檢測過程中采用權(quán)利要求1-10任一所述的多重檢測免疫層析芯片，檢測流程為A.添加樣品將液體樣品或經(jīng)過預(yù)處理的液體樣品滴加至權(quán)利要求1-10任一所述的免疫層析芯片的樣品墊[2]上；B.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；層析的過程中，檢測結(jié)合物W]、被檢靶標(biāo) [10]和固相檢測探針[15]之間發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，在分析膜[4]的明確固定位置發(fā)生示蹤物[8]結(jié)合量的變化，示蹤物[8]的結(jié)合量直接反應(yīng)了被檢靶標(biāo)[10]的有無或多少；C.結(jié)果判讀對于帶有顏色的示蹤物[8]可直接肉眼觀察判定結(jié)果，對于產(chǎn)生光、電或磁信號的示蹤物[8]需儀器進(jìn)行結(jié)果判讀；由于針對特定被檢靶標(biāo)[10]的固相檢測探針 [15]在分析膜[4]上的位置明確固定，因而對明確固定位置上示蹤物[8]的信號，包括顏色、光、電或磁，進(jìn)行判讀即可實現(xiàn)某種被檢靶標(biāo)[10]的定性定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多重檢測免疫層析芯片，其可克服在先技術(shù)中，免疫層析技術(shù)無法高通量檢測以及芯片技術(shù)操作復(fù)雜無法現(xiàn)場使用的缺點，通過將免疫層析反應(yīng)模式與芯片檢測矩陣設(shè)置有機(jī)融合，最終實現(xiàn)了以現(xiàn)場簡便操作為前提的高通量檢測，即一次加樣實現(xiàn)多種目標(biāo)被檢物的同步檢測。
文檔編號G01N33/532GK102375055SQ201010257719
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者周蕾, 楊瑞馥, 郭兆彪 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所