專利名稱：一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的霍亂檢測分型試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的試紙，特別涉及一種可對霍亂弧菌01群與0139群進(jìn)行同步檢測與分型的基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的試紙。
背景技術(shù)：
霍亂(Cholera)是由01血清群和0139血清群霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性腸道傳染病，是以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征的國際檢疫傳染病之一，也是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病之一，《國內(nèi)交通衛(wèi)生檢疫條例》也將其列為檢疫傳染病。它可以引起散發(fā)、流行、暴發(fā)、甚至世界性大流行，不僅危害人民健康，而且影響人民正常生活、生產(chǎn)、旅游、經(jīng)貿(mào)、交通運(yùn)輸、甚至社會(huì)安定。根據(jù)菌體(0)抗原的不同，目前已將霍亂弧菌分出200個(gè)以上的0血清群 (Oserogroups)，但僅發(fā)現(xiàn)01和0139群霍亂弧菌能引發(fā)霍亂。1992年以前，僅01群霍亂弧菌(V. cholerae 01)的兩個(gè)生物型，即古典生物型(Classical biotype)和埃爾托生物型 (El Tor biotype)引發(fā)了七次霍亂世界大流行。而對01群以外的其他血清群，統(tǒng)稱為非01 群霍亂弧菌(V. cholerae non-01)。非01群霍亂弧菌廣泛分布于自然界水體中，一般不致病或僅引起散發(fā)性腹瀉病例和腸道外感染。但1992年10月，印度首次發(fā)生了由非01群霍亂弧菌引起的霍亂大暴發(fā)，其病原被鑒定為0139血清群霍亂弧菌(V. cholerae 0139)。這個(gè)新確認(rèn)的0139群與其他非01群霍亂弧菌最大的不同點(diǎn)在于，它能產(chǎn)生與01群霍亂弧菌相同的霍亂毒素(Cholera toxin, CT)，所引起的霍亂在臨床和流行病學(xué)上也與01群霍亂弧菌所致霍亂基本相同主要通過水引起暴發(fā)流行，人感染后，該菌在腸內(nèi)大量繁殖，造成腹瀉、嘔吐、嚴(yán)重脫水，如不醫(yī)治會(huì)造成死亡。此外，0139群霍亂由于抗原發(fā)生了變異，人群對其缺乏免疫力。發(fā)病以青壯年為主，男性病例明顯多于女性，無明顯季節(jié)性，冬春季也可引起暴發(fā)流行。由此可見，霍亂弧菌的快速檢測，并在檢測中對血清型(01群還是0139群) 進(jìn)行同步的判斷，將對霍亂的預(yù)防以及霍亂發(fā)生后及時(shí)有效的控制處理具有重要的意義。目前所使用的常規(guī)的霍亂弧菌檢測分型技術(shù)包括診斷血清玻片凝集試驗(yàn)、PCR、 膠體金試紙等，這些方法有的只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，無法在野外現(xiàn)場使用；有的操作流程較為復(fù)雜歷時(shí)較長；有的敏感性低、特異性差；有的一次操作只能對一種目標(biāo)被檢物進(jìn)行檢測， 無法檢測與分型同步進(jìn)行。因而急需操作簡便、快速、敏感性高、特異性好、檢測分型同步的現(xiàn)場技術(shù)。免疫層析技術(shù)是經(jīng)典的現(xiàn)場快速檢測技術(shù)，操作簡便、快速；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料 (Up-Converting Phosphor,UCP)是新型的稀土金屬晶體光學(xué)材料，其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)以及化學(xué)組成使其具有絕無僅有的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象，即UCP顆?？捎杉t外光激發(fā)、發(fā)射可見光； 上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)(Up-converting Phosphor Technology，UPT)促成了免疫層析技術(shù)與上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的結(jié)合，即通過一系列表面修飾與活化后將UCP顆粒作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析，在紅外光照射下以獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象揭示生物活性分子之間高靈敏度特異性的識(shí)別，進(jìn)而光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)被檢物的準(zhǔn)確定量。若能建立多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)(UPT-based later-flow assay,UPT-LFassay)則可在保證簡便、快速、敏感性、 特異性、定量能力的同時(shí)實(shí)現(xiàn)01群與0139群霍亂弧菌的檢測與分型。發(fā)明技術(shù)本發(fā)明目的在于公開一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)(基于多重UPT-LF) 的霍亂檢測分型試紙。本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]、吸水墊[4]和粘性底襯[5](如附圖1所示)。其中，樣品墊[1]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)吸水紙、纖維素膜、 玻璃纖維、無紡布或?yàn)V血膜。其中，結(jié)合墊[2]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)玻璃纖維、聚酯膜或無紡布；結(jié)合墊[2]中固定有UCP結(jié)合物混合物[6]，UCP結(jié)合物混合物W]中包括兩種檢測結(jié)合物，即UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]與UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]，一種質(zhì)控結(jié)合物，即UCP-羊IgG結(jié)合物[9]；其中，UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]由UCP顆粒和01群霍亂弧菌單抗A結(jié)合而成；UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物 [8]由UCP顆粒和0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合而成；UCP-羊IgG結(jié)合物[9]由UCP顆粒和羊IgG結(jié)合而成；UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]和UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]可分別高特異性地與01群霍亂弧菌[10]、0139群霍亂弧菌[11]結(jié)合；UCP-羊IgG 結(jié)合物[9]可質(zhì)控層析過程正常與否。其中，分析膜[3]是微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)硝酸纖維素膜或尼龍膜；其中，分析膜 [3]上設(shè)置有檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]和質(zhì)控帶C[14]；檢測帶Tl[12]為01群霍亂弧菌單抗B，檢測帶Τ2 [13]為0139群霍亂弧菌單抗B，質(zhì)控帶C[14]為兔抗羊IgG ；檢測帶 Tl [12]即01群霍亂弧菌單抗B與UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]構(gòu)成雙抗體夾心模式可特異性的檢測01群霍亂弧菌，檢測帶T2[13]即0139群霍亂弧菌單抗B與UCP-0139 群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]構(gòu)成雙抗體夾心模式可特異性的檢測0139群霍亂弧菌，而質(zhì)控帶C[14]即兔抗羊IgG可與UCP-羊IgG結(jié)合物[9]直接結(jié)合用于質(zhì)控整個(gè)層析流程是否正常。其中，吸水墊[4]是具有較大床體積的物質(zhì)吸水紙或纖維素膜。其中，粘性底襯[5]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板。其中，01群霍亂弧菌單抗A與01群霍亂弧菌單抗B，可為同一種特異性單抗，也可為兩種特異性單抗；其中，0139群霍亂弧菌單抗A與0139群霍亂弧菌單抗B，可為同一種特異性單抗， 也可為兩種特異性單抗；其中，UCP顆粒，可通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象對樣品中01群霍亂弧菌[10]與0139群霍亂弧菌[11]的存在與否以及濃度予以指示。本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙的制備方法為A.結(jié)合墊[2]的制備將UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7] ,UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]和UCP-羊IgG結(jié)合物[9]混合，得UCP結(jié)合物混合物[6]，用pH = 7. 2的0. 03M PB含1-10% BSA、0.海藻糖和0.蔗糖的混合液作為結(jié)合物稀釋液將UCP結(jié)合物混合物[6]稀釋至終濃度為0. 5-;3mg/ml，將UCP結(jié)合物混合物[6]加于玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于37-50°C下烘干30min-;3h，得結(jié)合墊[2]，備用；B.分析膜[3]的制備將l-2mg/ml 01群霍亂弧菌單抗B、l_2mg/ml 0139群霍亂弧菌單抗B和l-2mg/ml兔抗羊IgG噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶 Tl[12]、檢測帶T2[13]和質(zhì)控帶C[14]，于35-40°C下烘干30min-lh，得分析膜[3]，備用；C.將樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘帖于粘性底襯[5] 上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖2所示)；將試紙剪切為2-4mm寬單獨(dú)可用的成品， 得本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙；成型的試紙可直接使用或置入塑料外殼中使用。本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙的制備方法優(yōu)選為A.結(jié)合墊[2]的制備將UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]、UCP_0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]和UCP-羊IgG結(jié)合物[9]混合，得UCP結(jié)合物混合物[6]，用pH = 7. 2的0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖的混合液作為結(jié)合物稀釋液將UCP結(jié)合物混合物[6]稀釋至終濃度為ang/ml，將UCP結(jié)合物混合物[6]加于玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于40°C下烘干1. ，得結(jié)合墊[2]，備用；B.分析膜[3]的制備將1. 5mg/ml 01群霍亂弧菌單抗B、l. 5mg/ml 0139群霍亂弧菌單抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶 Tl[12]、檢測帶T2[13]和質(zhì)控帶C[14]，于37°C下烘干40分鐘，得分析膜[3]，備用；C.將樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘帖于粘性底襯[5] 上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖2所示)；將試紙剪切為3mm寬單獨(dú)可用的成品，得本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙；成型的試紙可直接使用或置入塑料外殼中使用。一種用本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙檢測分型霍亂弧菌的方法A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便等樣品可直接檢測或用堿性蛋白胨水增菌4h_5h 后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將0. 5-2倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液 (0. 1-0. 3MpH = 7. 2PB 含 0. I-IM NaCl,0. 1-1% SDS)混合；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至上述本發(fā)明多重UPT-LF試紙的樣品墊 [1]上；D.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對試紙進(jìn)行掃描；定性檢測只有質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陰性；檢測帶Tl [12]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群霍亂弧菌陽性；檢測帶 T2[13]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶Tl[12]、檢測帶Τ2[13]、質(zhì)控帶C[14]均有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶 Tl [12]、檢測帶T2 [13]、質(zhì)控帶C[14]均無信號(hào)產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；定量檢測將檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]的信號(hào)強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于Tl、T2、C，T1/C為01群霍亂弧菌的檢測值，T2/C為0139群霍亂弧菌的檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中01群與0139群霍亂弧菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。一種用本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙檢測分型霍亂弧菌的方法優(yōu)選為A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便等樣品可直接檢測或用堿性蛋白胨水增菌4. 5h 后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至上述本發(fā)明多重UPT-LF試紙的樣品墊上；D.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對試紙進(jìn)行掃描；定性檢測只有質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陰性；檢測帶Tl [12]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群霍亂弧菌陽性；檢測帶 T2[13]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶Tl [12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]均有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶 Tl [12]、檢測帶T2 [13]、質(zhì)控帶C[14]均無信號(hào)產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；定量檢測將檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]的信號(hào)強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于Tl、T2、C，T1/C為01群霍亂弧菌的檢測值，T2/C為0139群霍亂弧菌的檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中 01群與0139群霍亂弧菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙的檢測原理為檢測中將液體樣品添加至樣品墊[1]上后，液體樣品自樣品墊[1]滲透入結(jié)合墊；在液體樣品基質(zhì)的作用下，結(jié)合墊[2]中固定的UCP結(jié)合物混合物[6]將重新溶解游離，并同樣品一同離開結(jié)合墊[2]進(jìn)入分析膜[3]，在毛細(xì)作用下，通過檢測帶Tl [12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]向吸水墊[4]的方向涌動(dòng)；在這一過程中，檢測帶Tl[12]/檢測帶 Τ2[13]/質(zhì)控帶C[14]、UCP結(jié)合物混合物[6]、樣品中的01群/0139群霍亂弧菌之間將發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)，如附圖3所示1、01群與0139群霍亂弧菌陰性樣品(圖3A)樣品中既不含有01群霍亂弧菌[10]，也不含有0139群霍亂弧菌[11]，因而檢測帶Tl [12]即01群霍亂弧菌單抗B與 UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]之間、檢測帶T2[13]即0139群霍亂弧菌單抗B與 UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]之間，無法發(fā)生結(jié)合，UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]與UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]只能依次流過檢測帶Tl [12]、檢測帶 Τ2[13]、質(zhì)控帶C[14]；而質(zhì)控結(jié)合物即UCP-羊IgG結(jié)合物[9]則在通過質(zhì)控帶C[14]即兔抗羊IgG時(shí)，通過免疫反應(yīng)將UCP顆粒固定于質(zhì)控帶C[14]，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；最終，對于01群與0139群霍亂弧菌陰性樣品而言，只有質(zhì)控帶C[14]上有信號(hào)產(chǎn)生；2、01群霍亂弧菌陽性樣品(圖;3B)樣品中含有01群霍亂弧菌[10]，但不含有 0139群霍亂弧菌[11]，因而檢測帶Tl [12]即01群霍亂弧菌單抗B/01群霍亂弧菌[10]/ UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]之間可通過雙抗體夾心模式的免疫反應(yīng)將UCP顆粒固定于檢測帶Tl [12]，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；而UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]只能依次流過檢測帶Tl [12]、檢測帶T2 [13]、質(zhì)控帶C[14]，而無法結(jié)合于檢測帶T2 [13]；質(zhì)控結(jié)合物即UCP-羊IgG結(jié)合物[9]則在通過質(zhì)控帶C[14]即兔抗羊IgG時(shí)，通過免疫反應(yīng)將UCP顆粒固定于質(zhì)控帶C[14]，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；最終，對于01群霍亂弧菌陽性樣品而言，檢測帶Tl[12]與質(zhì)控帶C[14]上均有信號(hào)產(chǎn)生；3、0139群霍亂弧菌陽性樣品(圖3C)樣品中不含有01群霍亂弧菌[10]，但含有0139群霍亂弧菌[11]，因而檢測帶T2[13]即0139群霍亂弧菌單抗Β/0139群霍亂弧菌[11]/UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]之間可通過雙抗體夾心模式的免疫反應(yīng)將UCP顆粒固定于檢測帶T2 [13]，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；而UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]只能依次流過檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]，而無法結(jié)合于檢測帶 Tl[12]；質(zhì)控結(jié)合物即UCP-羊IgG結(jié)合物[9]則在通過質(zhì)控帶C[14]即兔抗羊IgG時(shí)，通過免疫反應(yīng)將UCP顆粒固定于質(zhì)控帶C[14]，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；最終，對于0139群霍亂弧菌陽性樣品而言，檢測帶T2[13]與質(zhì)控帶C[14]上均有信號(hào)產(chǎn)生；4、01群與0139群霍亂弧菌陽性樣品(圖3D)樣品中既含有01群霍亂弧菌[10]， 又含有0139群霍亂弧菌[11]，因而檢測帶Tl [12]即01群霍亂弧菌單抗B/01群霍亂弧菌 [10]/UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]之間、檢測帶T2[13]即0139群霍亂弧菌單抗 Β/0139群霍亂弧菌[11]/UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]之間，均可通過雙抗體夾心模式的免疫反應(yīng)將UCP顆粒分別固定于檢測帶Tl [12]與檢測帶T2 [13]，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；質(zhì)控結(jié)合物即UCP-羊IgG結(jié)合物[9]也在通過質(zhì)控帶C[14]即兔抗羊IgG時(shí)， 通過免疫反應(yīng)將UCP顆粒固定于質(zhì)控帶C[14]，從而產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；最終，對于01群與 0139群霍亂弧菌陽性樣品而言，檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]與質(zhì)控帶C[14]上均有信號(hào)產(chǎn)生。本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙通過將UCP顆粒作為標(biāo)記物與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，并將傳統(tǒng)的單靶標(biāo)檢測免疫層析試紙拓展為多重檢測，最終所建立的基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙，具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性好的特點(diǎn)，可在野外現(xiàn)場實(shí)現(xiàn)樣品中01群與0139群霍亂弧菌的定量檢測與分型。


圖1 本發(fā)明基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)(UPT-LF)的霍亂檢測分型試紙結(jié)構(gòu)圖；圖2 本發(fā)明基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)(UPT-LF)的霍亂檢測分型試紙粘帖示意圖；圖3 本發(fā)明基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)(UPT-LF)的霍亂檢測分型試紙檢測原理圖；圖4 01群霍亂弧菌濃度響應(yīng)曲線與定量檢測曲線；圖5 0139群霍亂弧菌濃度響應(yīng)曲線與定量檢測曲線；圖6 01群與0139群霍亂弧菌混合樣品檢測；圖7 01群霍亂弧菌特異檢測性能評(píng)價(jià)；圖8 0139群霍亂弧菌特異檢測性能評(píng)價(jià)。
下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙的靈敏度與定量能力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)1、標(biāo)準(zhǔn)菌液樣品制備(1)用堿性蛋白胨水分別培養(yǎng)01群與0139群霍亂弧菌至對數(shù)中期；(2) 8000rpm, 5min 離心濃縮；(3)平板計(jì)數(shù)，確定準(zhǔn)確的菌液濃度；(4)用堿性蛋白胨水將菌濃度分別調(diào)至Ocfu/ml (即堿性蛋白胨水)、104cfu/ml、 105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml，以此作為靈敏度以及定量能力評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品。2、使用本發(fā)明實(shí)施例1方法制備得到的基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙對系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，操作流程如下(1)樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；(2)添加樣品將處理后的液體樣品滴加140 μ 1至本發(fā)明多重UPT-LF試紙的樣品墊上，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次；(3)層析反應(yīng)靜置15min待層析反應(yīng)完成；(4)結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對試紙進(jìn)行掃描，檢測結(jié)果以T1/C值(01 群)和T2/C值(0139群)表示；3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖4和附圖5所示(1)判定值的確定以空白樣品(堿性蛋白胨水)三次檢測值T/C的均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差(5+3SD )作為判定值，01群與0139群檢測的判定值均為0. 3，T1/C大于0. 3則為01 群陽性，T2/C大于0. 3則為0139群陽性；(2)靈敏度評(píng)價(jià)104CfU/ml 01群霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)品的檢測值(T1/C)與104cfu/ml 0139群霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)品的檢測值(T2/C)均大于0. 3，因而基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙其對01群與0139群霍亂弧菌的檢測敏感性均可達(dá)到IO4CfuAil ；(3)定量能力評(píng)價(jià)以LOG (T/C值)作為X，以L0G(cfu/ml)作為y，繪制標(biāo)準(zhǔn)定量曲線并經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬合，即可獲得01群與0139群的定量擬合公式01 群定量擬合公式:y = 2. 7148x+4. 9796，R2 = 0. 9972χ 為 LOG (T1/C 值)，y 為 LOG (cfu/ml)；0139 群定量擬合公式y(tǒng) = 3. 2923x+5. 5629, R2 = 0. 9917χ 為 LOG (T1/C 值)，y 為 LOG (cfu/ml)；其中01群與0139群霍亂弧菌定量擬合公式的決定系數(shù)(R2)分別達(dá)到了 0. 9972 與0. 9917，由此說明本發(fā)明多重UPT-LF具有很好的定量能力，經(jīng)推導(dǎo)定量公式的最終形式
為
權(quán)利要求
1.一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的霍亂檢測分型試紙，其特征在于該檢測分型試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]、吸水墊[4]和粘性底襯[5]。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的樣品墊[1]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)吸水紙、纖維素膜、玻璃纖維、無紡布或?yàn)V血膜。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的結(jié)合墊[2]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)玻璃纖維、聚酯膜或無紡布；結(jié)合墊[2]中固定有UCP結(jié)合物混合物[6]，UCP結(jié)合物混合物W]中包括兩種檢測結(jié)合物，即UCP-Ol群霍亂弧菌單抗 A結(jié)合物[7]與UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]，一種質(zhì)控結(jié)合物，即UCP-羊IgG 結(jié)合物[9]；其中，UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]由UCP顆粒和01群霍亂弧菌單抗 A結(jié)合而成；UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]由UCP顆粒和0139群霍亂弧菌單抗A 結(jié)合而成；UCP-羊IgG結(jié)合物[9]由UCP顆粒和羊IgG結(jié)合而成；UCP-Ol群霍亂弧菌單抗 A結(jié)合物[7]和UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]可分別高特異性地與01群霍亂弧菌[10]、0139群霍亂弧菌[11]結(jié)合；UCP-羊IgG結(jié)合物[9]可質(zhì)控層析過程正常與否。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的分析膜[3]是微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)硝酸纖維素膜或尼龍膜；其中，分析膜[3]上設(shè)置有檢測帶Tl [12]、檢測帶 T2[13]和質(zhì)控帶C[14]；檢測帶Tl[12]為01群霍亂弧菌單抗B，檢測帶Τ2 [13]為0139群霍亂弧菌單抗B，質(zhì)控帶C[14]為兔抗羊IgG ；檢測帶Tl [12]即01群霍亂弧菌單抗B與 UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]構(gòu)成雙抗體夾心模式可特異性的檢測01群霍亂弧菌， 檢測帶T2[13]即0139群霍亂弧菌單抗B與UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]構(gòu)成雙抗體夾心模式可特異性的檢測0139群霍亂弧菌，而質(zhì)控帶C[14]即兔抗羊IgG可與UCP-羊 IgG結(jié)合物[9]直接結(jié)合用于質(zhì)控整個(gè)層析流程是否正常。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的吸水墊[4]是具有較大床體積的物質(zhì)吸水紙或纖維素膜。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的粘性底襯[5]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板。
7.如權(quán)利要求3或4所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的01群霍亂弧菌單抗 A與01群霍亂弧菌單抗B，可為同一種特異性單抗，也可為兩種特異性單抗；
8.如權(quán)利要求3或4所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的0139群霍亂弧菌單抗A與0139群霍亂弧菌單抗B，可為同一種特異性單抗，也可為兩種特異性單抗；
9.如權(quán)利要求3或4所述的檢測分型試紙，其特征在于其中所述的UCP顆粒，可通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象對樣品中01群霍亂弧菌[10]與0139群霍亂弧菌[11]的存在與否以及濃度予以指示。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的檢測分型試紙的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟A.結(jié)合墊[2]的制備將UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]、UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]和UCP-羊IgG結(jié)合物[9]混合，得UCP結(jié)合物混合物[6]，用pH = 7. 2 的0. 03M PB含1-10%BSA、0. 海藻糖和0. 蔗糖的混合液作為結(jié)合物稀釋液將 UCP結(jié)合物混合物[6]稀釋至終濃度為0. 5-;3mg/ml JfUCP結(jié)合物混合物[6]加于玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于37-50°C下烘干30min-;3h，得結(jié)合墊[2]，備用；B.分析膜[3]的制備將l-2mg/ml01群霍亂弧菌單抗B、l_2mg/ml 0139群霍亂弧菌單抗B和l-2mg/ml兔抗羊IgG噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶Tl [12]、檢測帶T2[13]和質(zhì)控帶C[14]，于35-40°C下烘干30min-lh，得分析膜[3]，備用；C.將樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘帖于粘性底襯[5]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖2所示)；將試紙剪切為2-4mm寬單獨(dú)可用的成品，得本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙；成型的試紙可直接使用或置入塑料外殼中使用。
11.如權(quán)利要求10所述的檢測分型試紙的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟A.結(jié)合墊[2]的制備將UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]、UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]和UCP-羊IgG結(jié)合物[9]混合，得UCP結(jié)合物混合物[6]，用pH = 7. 2 的0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖的混合液作為結(jié)合物稀釋液將UCP結(jié)合物混合物[6]稀釋至終濃度為ang/ml，將UCP結(jié)合物混合物[6]加于玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于40°C下烘干1. ，得結(jié)合墊[2]，備用；B.分析膜[3]的制備將1.5mg/ml 01群霍亂弧菌單抗B、1. 5mg/ml 0139群霍亂弧菌單抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶Tl [12]、檢測帶T2[13]和質(zhì)控帶C[14]，于37°C下烘干40分鐘，得分析膜[3]，備用；C.將樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘帖于粘性底襯[5]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖2所示)；將試紙剪切為3mm寬單獨(dú)可用的成品，得本發(fā)明基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙；成型的試紙可直接使用或置入塑料外殼中使用。
12.—種霍亂弧菌的檢測分型方法，其特征在于在檢測過程中采用權(quán)利要求1-9任一所述的基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的霍亂檢測分型試紙，檢測流程為A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便等樣品可直接檢測或用堿性蛋白胨水增菌4h4h后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將0.5-2倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0. 1-0. 3MpH =7. 2PB 含 0. I-IM NaCl,0. 1-1% SDS)混合；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至權(quán)利要求1-8所述的多重UPT-LF試紙的樣品墊[1]上；D.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對試紙進(jìn)行掃描；定性檢測只有質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陰性；檢測帶Tl[12]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群霍亂弧菌陽性；檢測帶T2[13]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶Tl [12]、檢測帶T2 [13]、 質(zhì)控帶C[14]均有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶Tl [12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]均無信號(hào)產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；定量檢測將檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]的信號(hào)強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于T1、T2、C，T1/C為01群霍亂弧菌的檢測值，T2/C為0139群霍亂弧菌的檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中01群與 0139群霍亂弧菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
13.如權(quán)利要求12所述的霍亂弧菌的檢測分型方法，其特征在于檢測流程為A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便等樣品可直接檢測或用堿性蛋白胨水增菌4.5h后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0.15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至上述本發(fā)明多重UPT-LF試紙的樣品墊[1]上；D.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對試紙進(jìn)行掃描；定性檢測只有質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陰性；檢測帶Tl [12]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群霍亂弧菌陽性；檢測帶T2[13]與質(zhì)控帶C[14]有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]、 質(zhì)控帶C[14]均有信號(hào)產(chǎn)生，則樣品為01群與0139群霍亂弧菌陽性；檢測帶Tl [12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]均無信號(hào)產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；定量檢測將檢測帶Tl[12]、檢測帶T2[13]、質(zhì)控帶C[14]的信號(hào)強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于T1、T2、C，T1/C為01群霍亂弧菌的檢測值，T2/C為0139群霍亂弧菌的檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中01群與 0139群霍亂弧菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)(UPT-LF)的霍亂檢測分型試紙通過將UCP顆粒作為標(biāo)記物與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，并將傳統(tǒng)的單靶標(biāo)檢測免疫層析試紙拓展為多重檢測，最終所建立的基于多重UPT-LF的霍亂檢測分型試紙，具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性好的特點(diǎn)，可在野外現(xiàn)場實(shí)現(xiàn)樣品中O1群與O139群霍亂弧菌的定量檢測與分型。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102375059SQ20101025768
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者周蕾, 楊瑞馥, 邱海燕, 郝民, 郭兆彪, 闞飆 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所