專利名稱：一種蔬菜中樂果殘留檢測預處理方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蔬菜農(nóng)藥殘留檢測領域，是一種用于蔬菜中樂果殘留分析樣品處理的 方法。
背景技術：
農(nóng)藥殘留污染是影響范圍最大的一種有機污染。尤其對生長期短的蔬菜類農(nóng)產(chǎn) 品，由于蟲害多、施藥量大，加之違規(guī)使用等，農(nóng)藥殘留超標現(xiàn)象更為突出。在廣泛應用的農(nóng) 藥中，有機磷、氨基甲酸酷類農(nóng)藥毒性強，由于有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥使用不當或誤食 造成蔬菜農(nóng)藥殘留超標而引起的中毒現(xiàn)象十分嚴重。世界范圍內(nèi)農(nóng)藥中毒事件屢有發(fā)生， 其中69. 5%是由有機磷農(nóng)藥所致。農(nóng)藥殘留污染問題也給我國對外貿(mào)易帶來影響，近年來 歐盟、美國、日本、加拿大等西方發(fā)達國家或地區(qū)，相繼對進口食品中農(nóng)藥殘留量等衛(wèi)生指 標提出了愈來愈嚴格的要求。我國出口的農(nóng)產(chǎn)品屢遭國外拒收、扣留、退貨、索賠，不僅造成 嚴重經(jīng)濟損失，也使我國外貿(mào)聲譽受到影響?，F(xiàn)有的農(nóng)藥殘留檢測主要采用化學計量法和液相、氣相色譜法或氣相色譜_質(zhì)譜 聯(lián)用法，周期長、成本高，無法滿足生產(chǎn)在線檢測需要。近年來提出的農(nóng)藥殘留快速檢測方 法有酶抑制法、紫外分光光度計法和近紅外色譜分析方法，存在不能對農(nóng)藥品種定性和定 量測試、穩(wěn)定性差和運行維護成本高等缺點，制約了該技術的生產(chǎn)應用和推廣。農(nóng)藥殘留分析過程包括樣品前處理和檢測兩部分。其中樣品前處理操作復雜，所 用時間占整個分析過程的三分之二，其間產(chǎn)生的誤差是影響農(nóng)藥殘留分析精度的重要原 因。有些農(nóng)藥的性質(zhì)在樣品制備過程中或制備后也會發(fā)生變化，影響整個分析的準確性。經(jīng) 典的農(nóng)藥殘留樣品前處理方法有勻漿、索氏提取、超聲波提取、液-液萃取、柱層析等等，這 些方法效率低、需要大量的樣品和有機溶劑，威脅操作人員的健康，造成環(huán)境污染。因此提 高農(nóng)藥殘留分析的速度與樣品的穩(wěn)定性是目前農(nóng)藥殘留分析中亟待解決的問題。技術內(nèi)容本發(fā)明提出一種蔬菜中樂果殘留檢測樣品超高壓提取前處理工藝，旨在簡化農(nóng)藥 殘留樣品前處理工藝，提高樣品穩(wěn)定性。(Ultra high isostatic hydrostatic pressure at roomtemperature)，，，簡稱為冷等靜壓(Cold Isostatic High Pressure, CIHP)，超高壓提 取是在常溫或較低溫度(通常低于100°C )的條件下，對原料液迅速施加lOOMPa-lOOOMPa 的液體靜壓力，在預定壓力保持一段時間，使原料液細胞內(nèi)外壓力達到平衡(有效成分達 到溶解平衡)后迅速卸壓，使細胞內(nèi)外滲透壓力差突然增大，細胞內(nèi)的有效成分穿過細胞 膜(細胞膜的結構在超高壓下發(fā)生變化)，轉(zhuǎn)移到細胞外的提取液中，達到提取的目的。超高壓提取技術具有提取率(收率)高、提取液穩(wěn)定性好和高效環(huán)保等特點。采 用超高壓預處理技術和現(xiàn)有蔬菜農(nóng)藥殘留分析技術結合，可以提高蔬菜農(nóng)藥殘留分析效率 和檢測精度，用于機場蔬菜進出口管理、大型超市和蔬菜批發(fā)市場等地蔬菜農(nóng)藥殘留在線 檢測，很有現(xiàn)實意義和市場價值。
本發(fā)明的上述目的可通過以下技術方案實現(xiàn)，結合


如下四分法取樣將蔬菜取可食部分，用干凈紗布輕輕擦去樣品表面附著物，用對角 線分割法沿縱向切分，取對角部分充分混勻，用食品粉碎機中粉碎。取樣粉碎后充分混勻， 保證樣品的均勻性，根據(jù)試驗要求準確稱取若干份樣品放入聚乙烯薄膜袋或其他柔性容器 中，每份樣品量為25-30g。添加提取溶劑殘留農(nóng)藥含量甚微(痕量)，提取效果的好壞直接影響到檢測結 果的精確性。蔬菜中農(nóng)藥殘留主要為強極性的有機磷農(nóng)藥，考慮溶劑極性、農(nóng)藥理化特 性、樣本性質(zhì)以及檢測方法，選用極性強的丙酮作為提取溶劑，每份樣品提取溶劑體積為 50-60mL，樣品添加溶劑后，排出袋中空氣，用塑料封口機密封，編號待用。超高壓處理密封編號的樣品裝入高壓容器，一次可以根據(jù)容量裝入多個樣品。安 裝容器蓋，啟動液壓系統(tǒng)加壓，系統(tǒng)壓力到達200-300Mpa，保壓2_3分鐘，然后卸壓至常溫， 將樣品取出濾去雜質(zhì)，取濾液待后續(xù)測試。所述的蔬菜樣品超高壓處理過程在常溫下進行，不需要加熱。在預定壓力范圍內(nèi)，所述的蔬菜樣品超高壓處理采取直接升壓或間歇式升壓到預 定壓力。在蔬菜樣品超高壓處理過程中，一次可以根據(jù)容量裝入多個樣品。上述的蔬菜中樂果殘留檢測預處理方法，采用丙酮或其它提取溶劑也可用于蔬菜 中其他有機磷農(nóng)藥殘留檢測預處理過程。超高壓提取法與常用的農(nóng)藥殘留前處理方法相比，具有以下優(yōu)勢1.提取率高。農(nóng)藥殘留量是痕量檢測，對提取效率的要求很高。超高壓提取法操 作簡單，提取效率高。傳統(tǒng)的蔬菜農(nóng)藥殘留提取方法中，溶劑提取法要使用大量的有機溶劑 才能保證提取效率，固相提取法雖然減少了溶劑的用量，但是因為操作復雜，需要專業(yè)人員 分析。2.穩(wěn)定性好。在樣品制備過程中和制備后，一些性質(zhì)不穩(wěn)定的農(nóng)藥極易發(fā)生變化， 色譜檢測中常需要對提取的樣品進行特殊處理，如衍生化等，這些過程操作復雜、大大延長 了檢測的時間。超高壓處理可以提高樣品穩(wěn)定性，簡化樣品處理工藝流程，減少分析時間， 是超高壓提取法應用于蔬菜農(nóng)藥殘留分析的一個重要優(yōu)勢。超高壓提取是常溫提取，對于 熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥可減少提取過程中的農(nóng)藥損失，提高檢測結果的準確性。3.使用溶劑少。研究表明超高壓提取的溶劑用量只有回流和熱浸的1/2。能降 低溶劑的消耗，不僅降低成本，而且減少對操作人員的危害和環(huán)境污染。4.雜質(zhì)少。由于超高壓提取可以使酶失活，對于檢測洋蔥、大蒜、韭菜等含硫蔬菜， 可以減少對檢測的干擾。5.超高壓提取同時可以對多個樣本進行提取，效率高。

圖1基于超高壓提取的蔬菜預處理技術流程圖；圖2超高壓處理后的樣品經(jīng)過濾后根據(jù)檢測方法需要進行不同處理的流程圖。用 于后續(xù)處理。
具體實施例方式實施例1超高壓處理的蔬菜農(nóng)藥殘留氣譜_質(zhì)譜檢測分析。程序如下(1)配制樂果溶液用電子天平精密稱取樂果標準品lOOOmg，置于50mL棕色容量瓶內(nèi)，用二氯甲烷定 容，得到1000mg/L的樂果標準貯備液，貯存到低于4°C冰箱中，使用時作為母液根據(jù)要求配 制成相應的工作濃度。(2)制備白菜樣品采用四分法提取白菜樣品，根據(jù)試驗要求準確稱取2份，每份25g。將樂果標準品 配制成一定使用濃度添加到每份蔬菜中，制成樂果濃度為2mg/kg的樣品，添加后放置lh。 樂果經(jīng)過一段時間可以滲透到植物內(nèi)部，樣本更接近于實際檢測狀態(tài)。(3)超高壓提取將1份白菜樣品放入軟質(zhì)塑料袋中，用封口機密封，進行超高壓處理(加壓至 300MPa、保壓3分鐘)，提取后從高壓容器內(nèi)取出，待后續(xù)處理；另1份樣品采用普通勻漿法 處理待用。(4)凈化和濃縮將上一步驟處理的兩份樣品分別用下述程序凈化和濃縮①將經(jīng)過超高壓提取的樣品經(jīng)鋪有兩層濾紙和約4gCelite545的布氏漏斗真空/ 負壓抽濾，并用IOmL丙酮清洗塑料袋及抽濾瓶，合并濾液；②將濾液置于分液漏斗內(nèi)，向濾液中加入約5g氯化鈉使溶液處于飽和狀態(tài)。猛烈 振搖2-3min，靜置lOmin，使丙酮與水相分層，水相用一定體積(采用與提取液體積為1 1 的量)二氯甲烷振搖2min，再靜置分層；③將丙酮與二氯甲烷提取液合并經(jīng)裝有20g無水硫酸鈉的玻璃漏斗脫水濾入 250mL圓底燒瓶中，再以約20mL 二氯甲烷分數(shù)洗滌容器和無水硫酸鈉。洗滌液也并入燒瓶 中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50°C溫度下濃縮近干，濃縮液定量轉(zhuǎn)移到5mL容量瓶中，加二氯甲烷定 溶至5mL ；④如果溶液過于混濁用2μπι濾膜過濾，待測。(5)檢測將經(jīng)過凈化處理過兩份樣品用GC-MC檢測，分析農(nóng)藥含量。色譜條件載氣He，1.0mL/min ；進樣口溫度200°C，無分流進樣，進樣量IyL;柱流 量lmin;爐溫初始溫度100°C，保持lmin，以15 °C/min升溫到230°C ；色譜柱型號 P190915-433, ΗΡ-5 μ s,30. OmmX 250 μ mX 0· 25 μ m。質(zhì)譜條件離子源溫度230°C ；四極桿溫度150°C。經(jīng)過超高壓處理和勻漿處理白菜樣品回收率測試結果如表1。表1經(jīng)過超高壓處理和勻漿處理白菜樣品添加回收率
5 由表1看出，經(jīng)過超高壓處理后測得的添加回收率為87%，普通勻漿法添加回收 率僅為75%，相差12%。實施例2制備樂果添加水平分別為1. 0mg/kg、0. 5mg/kg、0. lmg/kg的白菜樣品，每種樣品9 份，隨機分成3組，分別采用超高壓預處理工藝、農(nóng)業(yè)行業(yè)標準_蔬菜和水果中有機磷、有機 氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留檢測方法(NY/T7611-2004)和國家標準-食品 中有機磷農(nóng)藥殘留量測定方法(GB/T5009. 20-2003)進行前處理，采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀進行 檢測。每組測得結果取平均值記入表2。表2不同預處理方法添加樂果白菜樣品測得的添加回收率 從表2可以看出，與兩種常用的前處理方法相比，超高壓提取法的添加回收率在 1. Omg/kg,0. 5mg/kg 和 0. lmg/kg 水平上比 GB/T5009. 20-2003 方法分別高 5. 8%、8. 0%和 8. 3%，比 NY/T761. 1-2004 分別高 1. 9%Λ. 7%和 0. 9% 使用低毒有機溶劑提取是農(nóng)藥殘留分析發(fā)展的趨勢，可以減少對環(huán)境造成的二次 污染。超高壓提取法所使用的丙酮毒性遠遠小于ΝΥ/Τ761. 1-2004法的乙腈溶劑，因此，超 高壓提取法具有比較明顯的有優(yōu)勢。實施例3(1)采用四分法分割白菜。將分割后的白菜切碎，再使用粉碎機進一步粉碎，達到 糊狀為準；(2)制備蔬菜提取溶液。按照白菜25g，添加試劑體積50mL裝入塑料袋，使用封口 機封口，將袋中物質(zhì)充分搖勻，靜置1小時，讓試劑對蔬菜成分進行萃取。然后使用布氏漏 斗和中速濾紙對袋中物質(zhì)進行過濾，得到蔬菜提取溶液；(3)使用電子天平秤取樂果固體標準品，放置在IOmL的離心管中；使用蔬菜提取 溶液溶解樂果固體，配置含農(nóng)藥濃度范圍為10_3-10_6的蔬菜提取溶液若干份，在離心管中 搖勻。蔬菜提取溶液數(shù)量和濃度見表3和表4 ；表3無壓樣品的濃度水平
(4)將步驟3中配置的溶液裝入塑料袋中，排除袋中氣體，使用封口機封口，記錄 樣品樂果濃度，編號待用；(5)將步驟4中有壓樣品進行超高壓預處理(加壓至300MPa、保壓3分鐘)，無壓 樣品直接進行步驟6;(6)將樣品裝入離心管，待近紅外光譜檢測。(7)近紅外光譜掃描A)儀器預熱30分鐘左右，確保儀器性能穩(wěn)定性；選擇Imm光程反射構件，固定在 槍式探頭上；B)啟動OPUS軟件，設置近紅外光譜儀參數(shù)；
C)測試空氣本底；D)在OPUS環(huán)境中設置測試樣品名、保存路徑和樣品的重復測量次數(shù) (RepeatedMeasurements)；E)將樣品搖勻倒入5mL燒杯中，將槍式光線探頭插入樣品，使樣品沒過探頭的流 通池，晃動幾下探頭，確保液體樣品填滿流通池，排凈氣泡；F)近紅外光譜檢測期間保持光纖探頭不動，避免液體流動影響光的反射；G)檢測完畢，系統(tǒng)自動保存光譜，供建模使用；H)清洗光纖探頭和燒杯。將反射構件拆下，用丙酮涮洗探頭和反射構件3次，用脫 脂棉將包裹光纖的金屬體擦拭凈。為了不磨損探頭表面和反射構件，其余部分自然風干；燒 杯中樣品倒入廢液池，使用丙酮清洗燒杯3次，自然風干。為了加快檢測速度，準備5mL燒杯4個，輪流使用盛裝樣品，25mL燒杯3個，輪流使 用清洗光纖探頭。(8)近紅外光譜數(shù)據(jù)處理無壓樣品光譜預處理和建模方法基線校正，去除lOOOO-UOOOcnT1和 4000-4500CIH"1兩段光譜，歸一化處理，然后進行25點平滑，在6101. 9-5448. 1和 4601. 5-4499. 3cm_1內(nèi)使用FD+MSC預處理方法建立PLS模型。有壓樣品光譜預處理和建模方法基線校正，去除1 lOOO-UOOOcnT1和 4000-4100cm_1 兩段光譜，21 點平滑，在 6800-6099. 9cm_1 和 4601. 5-4248. 5cm_1 內(nèi)使用 VN 預 處理方法建立PLS模型。分別使用無壓樣品和有壓樣品的驗證集樣品，對其光譜模型進行預測。由于在建 模過程中，10_3濃度的樣品剔除，模型樣品范圍縮至10_4_10_6，預測樣品中的10_3濃度的樣 品25號不再進行預測。結果如表5所示，單位為mg/L。表5樣品驗證集預測結果 注編號為Wxx樣品為無壓樣品，編號為Yxx樣品為有壓樣品。由表5可見，在相關系數(shù)不高的情況下，W26預測樣品的真實值和預測值較為 接近，相對誤差為26. 57%, W27和W28的真實值和預測值之間差別較大，相對誤差分別 為-49. 39%和-93. 06%，預測效果不理想。Y26和Y27預測樣品的真實值和預測值較為接近，相對誤差分別為1. 55 %和8. 17%,Y28的真實值和預測值相對誤差為-86. 88%。較無壓狀態(tài)的樣品，預測效果有所提
尚ο 在整個建模過程中，有壓樣品組數(shù)據(jù)相對比較穩(wěn)定，出現(xiàn)奇異點的次數(shù)不多，各種 預處理方法得到的相關參數(shù)也比較接近。無壓樣品組數(shù)據(jù)出現(xiàn)的奇異點比較多，并且不夠 穩(wěn)定，各種處理結果之間的數(shù)據(jù)相差比較大。從預測結果分析，有壓樣品的光譜模型預測效 果優(yōu)于無壓樣品的光譜模型的預測效果，使近紅外光譜的檢測限從10_4提高到10_5。
權利要求
一種蔬菜中樂果殘留檢測預處理方法，其特征在于，該方法包含如下步驟a)采用四分法提取樣品將蔬菜取可食部分，用干凈紗布輕輕擦去樣品表面附著物，用對角線分割法沿縱向切分，取對角部分充分混勻，用食品粉碎機中粉碎；b)樣品粉碎、裝袋取樣粉碎后充分混勻，保證樣品的均勻性，根據(jù)試驗要求準確稱取一定量樣品放入聚乙烯薄膜袋或其他柔性容器中，每份樣品量為25 30g；c)添加提取溶劑與密封選用丙酮作為提取溶劑，每份樣品提取溶劑體積為50 60mL，樣品添加溶劑后，排出袋中空氣，用塑料封口機密封，編號待用；d)超高壓處理密封編號的樣品裝入高壓容器，安裝容器蓋，啟動液壓系統(tǒng)加壓，系統(tǒng)壓力到達200 300Mpa，保壓2 3分鐘，然后卸壓至常溫，將樣品取出；e)濾去樣品雜質(zhì)，取濾液待后續(xù)測試。
2.根據(jù)權利要求1所述的蔬菜中樂果殘留檢測預處理方法，其特征在于，所述的蔬菜 樣品超高壓處理過程在常溫下進行，不需要加熱。
3.根據(jù)權利要求1所述的蔬菜中樂果殘留檢測預處理方法，其特征在于，在預定壓力 范圍內(nèi)，所述的蔬菜樣品超高壓處理采取直接升壓或間歇式升壓到預定壓力。
4.根據(jù)權利要求1所述的蔬菜中樂果殘留檢測預處理方法，其特征在于，在蔬菜樣品 超高壓處理過程中，一次可以根據(jù)容量裝入多個樣品。
5.根據(jù)權利要求1所述的蔬菜中樂果殘留檢測預處理方法，采用丙酮或其它提取溶劑 也可用于蔬菜中其他有機磷農(nóng)藥殘留檢測預處理過程。全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于蔬菜中樂果殘留分析樣品處理的方法，屬于蔬菜農(nóng)藥殘留檢測領域。該方法采用四分法提取樣品，樣品粉碎后充分混勻，根據(jù)要求準確稱取一定量樣品放入聚乙烯薄膜袋中，添加丙酮溶劑后，排出袋中空氣，用塑料封口機密封；然后進行超高壓處理將密封編號的樣品裝入高壓容器，安裝容器蓋，啟動液壓系統(tǒng)加壓，系統(tǒng)壓力到達200-300MPa，保壓2-3分鐘，然后卸壓，將樣品取出；濾去樣品雜質(zhì)，取濾液待后續(xù)測試。本方法采用丙酮或其它提取溶劑也可用于蔬菜中其他有機磷農(nóng)藥殘留檢測預處理過程，可以提高蔬菜農(nóng)藥殘留分析效率和檢測精度。
文檔編號G01N30/06GK101915688SQ201010248798
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權日2010年8月9日
發(fā)明者劉麗麗, 孫裕晶, 張永智, 李行, 韓艷麗 申請人:吉林大學