專利名稱：一種基于熒光dUTP的自動(dòng)檢測(cè)SSR分子標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于熒光dUTP在測(cè)序儀上自動(dòng)檢測(cè) SSR分子標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
SSR(Simple sequence r印eats，簡(jiǎn)單序列重復(fù)，也稱微衛(wèi)星)是一類由幾個(gè)堿基 串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短(每單元長(zhǎng)度在1 6bp之間)，廣泛分布于基 因組的不同位置。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了 SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記 是當(dāng)今流行的分子標(biāo)記技術(shù)之一，其原理為根據(jù)SSR兩端的保守的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對(duì) 特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)將其間的核心SSR序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳分析技術(shù)就可以獲得其 長(zhǎng)度多態(tài)性。為了滿足高通量和準(zhǔn)確性的需要，目前有條件的實(shí)驗(yàn)室都是通過(guò)測(cè)序儀進(jìn)行 自動(dòng)化的電泳檢測(cè)。通過(guò)測(cè)序儀進(jìn)行SSR分子標(biāo)記自動(dòng)檢測(cè)的一大障礙是PCR產(chǎn)物必須具 有熒光，以便激光探頭自動(dòng)識(shí)別熒光信號(hào)。利用熒光dUTP進(jìn)行SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)在教科書(shū)中尚未提及，至今只見(jiàn)報(bào)道 有 4 篇文獻(xiàn)(文獻(xiàn) 1 :Patrick K. Ε. M 等，“ Analysis of loss of heterozygosity inmicrodissected tumor cells from Cervical carcinoma using fluorescent dUTP IabelingofPCR products", BioTechniques 21:844—847;文 ^ 2 :MacAvoy E. S.等, "Geneticvariation island populations of tuatara inferred from microsatellite markers”，Conservatioin Genetics 8 :305_318 ；文獻(xiàn) 3 :Woolbright S. A.等，“A dense linkagemap of hybrid cottonwood contributes to long-term ecological research andcomparison mapping in a model forest tree”， Heredity 100 :59_70 ；文獻(xiàn) 4 : BuschJ. D.等，"Development of polymorphic tetranucleotide microsatellites for Pinyonjays”，Conservation Genetics 10 :689_691)。但上述文獻(xiàn)中熒光信號(hào)偏弱，大大影 響了譜帶判讀的準(zhǔn)確性。其中除文獻(xiàn)2中涉及的dNTP濃度為10(^1(降落？0 ，PCR反應(yīng) 體系為25 μ L)之外，文獻(xiàn)1、3和4中報(bào)道的dNTP濃度均為200 μ M( —般PCR，PCR反應(yīng)體 系為15 50 μ L)。由此可見(jiàn)，行業(yè)內(nèi)技術(shù)人員利用熒光dUTP進(jìn)行SSR分子標(biāo)記時(shí)幾乎均 釆用濃度為100 200 μ M的dNTP。此外，分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行一般PCR反應(yīng)時(shí)使用的dNTP濃度為 200 μ Μ，可參考C. W.迪芬巴赫等人著的《PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，1998，第1頁(yè))寸。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的既能提高目的片段的熒光 信號(hào)，從而提高標(biāo)記判讀的準(zhǔn)確性，又能合理節(jié)約反應(yīng)原料，降低成本、提高實(shí)驗(yàn)通量的方 法。本發(fā)明提供了一種基于熒光dUTP的自動(dòng)檢測(cè)SSR分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟(1)配制 PCR 反應(yīng)體系取 l.OyL 10Xbuffer、dNTP 25 50 μ M、MgCl22. OmM、前 向引物0.5“] 、后向引物0.5“]\^39酶1個(gè)單位、熒光(1^13 IOpmol和基因組DNA 5ng混 合，加超純水補(bǔ)至IOyL ；(2)進(jìn)行降落PCR :94°C4min ；20 個(gè)循環(huán)94°C 30s、70 60°C或者 66°C 56°C 30s 且每個(gè)循環(huán)降低 0. 5°C、72°C Imin ；再 26 個(gè)循環(huán)94°C 30s、60 或者 56°C 30s,72°C Imin ；最 后 72 °C lOmin，得 PCR 產(chǎn)物；(3)取PCR產(chǎn)物1. O μ L加入9. 34 μ L超純甲酰胺、0. 16 μ L分子量?jī)?nèi)標(biāo)，95°C 5min 后放置冰上快速冷卻，在測(cè)序儀上進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)。步驟(1)中，dNTP為三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate)的縮寫(xiě)。是dATP、dGTP、dTTP和dCTP的統(tǒng)稱，在生物DNA合成以及PCR聚 合酶鏈反應(yīng)中起原料作用。步驟(1)中使用的dNTP濃度為25 50μΜ，其濃度之低顯而易見(jiàn)，只占行業(yè)內(nèi)技 術(shù)人員通常使用量(200 μ Μ)的12. 5% 25%，大幅降低了反應(yīng)原料成本；并且可顯著提高 熒光信號(hào)的強(qiáng)度?；蚪MDNA不限。前向引物和后向引物取決于SSR標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA片段，按常規(guī) 分子學(xué)方法制備。步驟(2)中，降落PCR (touchdown PCR)是指隨著循環(huán)的增多，退火溫度每個(gè)循環(huán) 依次降低的一種PCR技術(shù)，基本原理就是在退火溫度較高的時(shí)候能夠保證引物結(jié)合反應(yīng)的 特異性，而隨著退火溫度的降低，擴(kuò)增效率可以適當(dāng)增加。其程序中退火溫度的選擇(70 60°C或者66°C 56°C，以及60或者56°C )取決于DNA序列的Tm值(DNA的解鏈溫度)。步驟(3)利用測(cè)序儀是為了進(jìn)行自動(dòng)化的電泳檢測(cè)，具體步驟參考儀器使用指 南。優(yōu)選地，步驟(1)中使用的dNTP濃度為25 μ M，做到在保障PCR產(chǎn)物量足夠，提高 熒光信號(hào)強(qiáng)度的情況下，使用最低的dNTP濃度，將原料成本降至最低。本發(fā)明顯著提高了目的片段的熒光信號(hào)強(qiáng)度，大大增強(qiáng)了在測(cè)序儀上自動(dòng)檢測(cè)的 準(zhǔn)確性，也有利于1個(gè)樣品的多個(gè)SSR標(biāo)記混合后多重檢測(cè)、降低測(cè)序儀檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)成本。 其可能的原理是PCR反應(yīng)中，熒光dUTP會(huì)與dNTP中的dTTP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到DNA鏈(PCR產(chǎn)物) 上，dNTP濃度降低、相當(dāng)于降低dTTP的量，從而減弱了 dTTP的競(jìng)爭(zhēng)力、提高了熒光dUTP結(jié) 合到PCR產(chǎn)物的能力，因此熒光信號(hào)強(qiáng)度增加。但另一方面，dNTP是DNA鏈合成的原料，不 能降得太低，否則其他三種dNTP (dATP、dCTP和dGTP)濃度太低、DNA鏈合成的原料不夠，導(dǎo) 致總的PCR產(chǎn)物偏少，進(jìn)而熒光信號(hào)也會(huì)偏弱，不利于熒光檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供了在保 障PCR產(chǎn)物量足夠的情況下使用的dNTP最低濃度，能夠保證最大的熒光信號(hào)強(qiáng)度。綜上，本發(fā)明滿足了社會(huì)需要，其廣泛的推廣將會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為不同dNTP濃度和PCR程序?qū)﹁駱?shù)(Eucalyptus) SSR標(biāo)記Embral89的PCR 產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響。
圖2為不同dNTP濃度和PCR程序?qū)﹁駱?shù)SSR標(biāo)記Embral47的PCR產(chǎn)物的熒光信 號(hào)強(qiáng)度的影響。圖3為利用本發(fā)明對(duì)藥用植物-五味子(Schisandra chinesis) SSR標(biāo)記 WWZ-AC25的檢測(cè)結(jié)果。圖4為利用本發(fā)明對(duì)經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種_錐栗(Castanea henryi)的SSR標(biāo)記GsCAT3 的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一一種基于熒光dUTP的檢測(cè)桉樹(shù)SSR標(biāo)記Embral89的方法，包括以下步驟(1)配制 PCR 反應(yīng)體系取 LOyL 10 X buffer、dNTP 25 μ Μ、MgCl22. OmM、前向引 物(5，-CGTGCTTTTGAGGCTCT-3，)0· 5 μ Μ、后向引物(5，-GATTGAGGATGAGTGGTC-3，)0· 5 μ Μ、 Taq酶1個(gè)單位(上海申能博彩公司)、熒光dUTP IOpmol (加拿大Fermentas公司)和1 株尾葉桉(E. urophylla)個(gè)體的基因組DNA 5ng混合，加超純水補(bǔ)至10 μ L ；(2)進(jìn)行降落PCR :94°C 4min ；20個(gè)循環(huán)94°C 30s,70 60°C 30s且每個(gè)循環(huán)降 低 0. 5°C、72°C Imin ；再 26 個(gè)循環(huán)94°C 30s、60°C 30s、72°C Imin ；最后 72°C lOmin，得 PCR 產(chǎn)物；(3)取PCR產(chǎn)物1. 0μ L加入9. 34 μ L超純甲酰胺、0. 16 μ L分子量?jī)?nèi)標(biāo)GeneScan 500LIZ (美國(guó)AB公司)，95°C 5min后放置冰上快速冷卻，在測(cè)序儀(美國(guó)AB 3130x1)上進(jìn) 行標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如附圖1的H所標(biāo)識(shí)。附圖1中，I峰為分子量?jī)?nèi)標(biāo)，II (a)和II (b) 峰為目的片段，峰的高低代表了熒光信號(hào)的強(qiáng)弱。桉樹(shù)為2倍體，II (a)和II (b)峰表示該 個(gè)體在該SSR標(biāo)記上的2個(gè)等位基因的長(zhǎng)度不同，分別為IlObp和118bp。實(shí)施例二一種基于熒光dUTP的檢測(cè)桉樹(shù)SSR標(biāo)記Embral47的方法。具體步驟基 本同上“實(shí)施例一”，只是前向引物(5’ -GCACGGTACTCGATCATAGA-3’)和后向引物 (5，-TGAGATAGGATTGCGCGT-3，)不同，且降落 PCR 中 70 60°C改為 66 56"C、26 個(gè)循環(huán) 中60。C改為56°C。檢測(cè)結(jié)果如附圖2的H所標(biāo)識(shí)。I峰為分子量?jī)?nèi)標(biāo)，II (a)和II (b)為 目的片段，峰的高低代表了熒光信號(hào)的強(qiáng)弱。桉樹(shù)為2倍體，II (a)和II (b)峰表示該個(gè)體 在該SSR標(biāo)記上的2個(gè)等位基因的長(zhǎng)度不同，分另為178bp和184bp。實(shí)施例三一種基于熒光dUTP的檢測(cè)藥用植物-五味子SSR標(biāo)記WWZ-AC25的方法。具體 步驟基本同上“實(shí)施例一”，只是前向引物(5 ’ -CATCGGAAAAATCAGAGAAG-3 ’)和后向引物 (5，-CCTATCAAAACTCCCCTCTT-3，)不同，降落 PCR 中 70 60°C改為 66 56"C、26 個(gè)循環(huán) 中60°C改為56°C，且尾葉桉改為五味子。檢測(cè)結(jié)果如附圖3。I (a)和I (b)峰為分子量 內(nèi)標(biāo)，II峰為目的片段。五味子為2倍體，II峰表示該個(gè)體在該SSR標(biāo)記上的2個(gè)等位基因 的長(zhǎng)度相同，為20Ibp。
實(shí)施例四一種基于熒光dUTP的檢測(cè)經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種-錐栗的SSR標(biāo)記GsCAT3的方法。具體步 驟基本同上“實(shí)施例一”，只是前向引物和后向引物不同(因引物尚未發(fā)表，暫略)，降落PCR 中70 60°C改為66 56°C、26個(gè)循環(huán)中60°C改為56°C，且尾葉桉改為錐栗。檢測(cè)結(jié)果如 附圖4。I (a)和I (b)峰為分子量?jī)?nèi)標(biāo)，II (a)和II (b)峰為目的片段。錐栗為2倍體， II (a)和II (b)峰表示該個(gè)體在該SSR標(biāo)記上的2個(gè)等位基因的長(zhǎng)度不同，分別為164bp 和 166bp。效果實(shí)施例不同dNTP濃度和PCR程序?qū)﹁駱?shù)SSR標(biāo)記(Embral89和Embral47) PCR產(chǎn)物的熒 光信號(hào)強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)材料植物材料為1株尾葉桉，采嫩葉進(jìn)行DNA提取。SSR標(biāo)記選取Embral89 和Embral47，引物序列見(jiàn)上“實(shí)施例一”和“實(shí)施例二”。實(shí)驗(yàn)過(guò)程針對(duì)各SSR標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)上“實(shí)施例一”和“實(shí)施例二”。試驗(yàn)結(jié)果及分析結(jié)果如附圖1和附圖2所示，dNTP 25 50mM和降落PCR程序 下，檢測(cè)的信號(hào)峰值明顯高于其他條件，具有良好的檢測(cè)效果，其中尤以dNTP 25mM和降落 PCR程序下，具有最佳的檢測(cè)效果。
權(quán)利要求
一種基于熒光dUTP的自動(dòng)檢測(cè)SSR分子標(biāo)記的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)配制PCR反應(yīng)體系取1.0μL 10×buffer、dNTP 25～50μM、MgCl22.0mM、前向引物0.5μM、后向引物0.5μM、Taq酶1個(gè)單位、熒光dUTP 10pmol和基因組DNA 5ng混合，加超純水補(bǔ)至10μL；(2)進(jìn)行降落PCR94℃4min；20個(gè)循環(huán)94℃30s、70～60℃或者66℃～56℃30s且每個(gè)循環(huán)降低0.5℃、72℃1min；再26個(gè)循環(huán)94℃30s、60℃或者56℃30s、72℃1min；最后72℃10min，得PCR產(chǎn)物；(3)取所述PCR產(chǎn)物1.0μL加入9.34μL超純甲酰胺、0.16μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)，95℃5min后放置冰上快速冷卻，在測(cè)序儀上進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述dNTP為25μ M。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于熒光dUTP的自動(dòng)檢測(cè)SSR分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟(1)配制PCR反應(yīng)體系取1.0μL 10×buffer、dNTP 25～50μM、MgCl22.0mM、前向引物0.5μM、后向引物0.5μM、Taq酶1個(gè)單位、熒光dUTP10pmol和基因組DNA 5ng混合，加超純水補(bǔ)至10μL；(2)進(jìn)行降落PCR94℃4min；20個(gè)循環(huán)94℃30s、70～60℃或者66～56℃30s且每個(gè)循環(huán)降低0.5℃、72℃1min；再26個(gè)循環(huán)94℃30s、60或者56℃30s、72℃1min；最后72℃10min，得PCR產(chǎn)物；(3)取PCR產(chǎn)物1.0μL加入9.34μL超純甲酰胺、0.16μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)，95℃5min后放置冰上快速冷卻，在測(cè)序儀上進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101899520SQ201010239919
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者于曉麗, 周長(zhǎng)品, 李發(fā)根, 李梅, 甘四明, 翁啟杰 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所