專利名稱：金磁微粒標記免疫層析快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種免疫層析分析法，具體涉及采用金磁微粒標記免疫層析的快速檢 測方法，主要應用于激素、蛋白質、病毒、毒品、細菌、藥物分子、毒素、重金屬等檢測領域。
背景技術：
現(xiàn)有的膠體金和乳膠顆粒標記的免疫層析分析法已經在臨床醫(yī)學檢驗中得到了 廣泛的應用，其基本原理是以微孔膜為固相載體，包被目標物(即被測物)的抗原或抗體， 加入待檢樣本后，經微孔膜的滲濾作用或毛細作用是標本中的目標物語膜上的包被的抗原 或抗體結合，通過膠體金與之反應形成膠體金本身的顏色(紅色)或者乳膠顆粒的(藍 色)，可通過肉眼觀察檢測結果。但是對于某些抗原或抗體含量極低的樣本，標記物的顏色 很淡幾乎用肉眼難以判斷結果，同時由于每個檢測人視覺上的差異，也很難得到統(tǒng)一的判 斷效果，同時對一些待檢測樣本的定量檢測也有很大困難，雖然目前市場上有針對膠體金 等標記的免疫層析試紙條判讀的儀器來減少人為原因的差異，但是這種儀器僅能對在固相 載體表面的標記物顏色檢測，而對固相載體內部的標記物很難檢測到，因此檢測的靈敏度 受到很大限制。同時檢測的生物樣本中可能含有顏色物質會嚴重影響檢測的結果和靈敏 度。

發(fā)明內容
本發(fā)明提出應用金磁微粒標記免疫層析檢測條的快速檢測方法，旨在解決傳統(tǒng)免 疫層析分析法的檢測方法在臨床實踐中易造成主觀差異化、檢測精度和靈敏度低、操作繁 復、適用領域窄的問題。本發(fā)明的基本指導思想是金磁微粒偶聯(lián)抗體或配體或抗原以后在與之匹配的工 作液和免疫層析裝置中能夠快速，定量的高靈敏度地檢測被分析物。本發(fā)明提出的金磁微粒標記免疫層析快速檢測方法，包括以下步驟1)金磁微粒標記待檢目標物的抗體或者配體或者抗原，并溶解在層析工作液中；1. 1)取金磁微粒，用偶聯(lián)緩沖液平衡3次，然后將待檢目標物的抗體或配體或抗 原按照與金磁微粒質量比10 500 μ g Img加入經平衡處理后的金磁微粒中，置于0 500C >50 220rpm的空氣恒溫振蕩器中充分反應IOmin 12h ；所述偶聯(lián)緩沖液為pH = 4-9,0. 005-0. 5M的磷酸鹽緩沖液、pH = 3-6,0. 1-3M的 三羥甲基氨基甲烷_鹽酸溶液或PH = 6-9,0. 01-3M的醋酸鹽緩沖液中的一種，所述金磁微 粒為核殼結構、組裝結構、磁性氧化鐵組裝在核殼結構外層的金磁微?；蛘呋谝陨先N 結構進行表面功能化修飾的金磁微粒；1. 2)于空氣恒溫振蕩器中反應完畢，在磁性分離器上分離2 3min，棄上清，用 清洗緩沖液清洗，去除非特異性結合的分子，得到表面已固定抗體或配體或抗原的金磁微 粒；所述清洗緩沖液為下列任一溶液pH = 4-9,0. 005-0. 5M，且含有0. 5-5% Tween20或者 0. 5-5% Triton X-100 的磷酸鹽緩沖液；pH = 6-9,0. 1-3M 且含有 0. 5-5% Tween20 或者0. 5-5% Triton X-100的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液；pH = 3-6,0. 01-3M且含有 0. 5-5% Tween20 或者 0. 5-5% Triton X-100 的醋酸鹽緩沖液；pH = 6-9,0. 1-10M 且含有 0. 5-5% Tween20 或者 0. 05-2% Triton X-100 的硼酸鹽緩沖液；pH = 2-5,0. 01-1M 且含有 0. 5-5% Tween20或者0. 5-5% TritonX-IOO的甘氨酸-鹽酸緩沖液；1. 3)封閉加入500ul 2ml的封閉劑到表面已固定抗體或配體或抗原的金磁微 粒中，置于20 80°C、50 220rpm的恒溫振蕩器中充分混勻5min 12h進行封閉；所述封閉劑是采用上述偶聯(lián)緩沖液溶解了以下物質的一種或多種牛血清白蛋 白(BSA)、賴氨酸(Lys)、脫脂奶粉、乙醇胺、小牛血清、山羊血清；上述組分的終濃度均為 0. 05% -10% ；1. 4)將偶聯(lián)抗體且封閉完畢的金磁微粒在磁性分離器上分離2 3min，棄上清， 用清洗緩沖液清洗，去除未結合的生物分子，最后將此偶聯(lián)有抗體且封閉完成的金磁微粒 溶解在層析工作液中；所述層析工作液是緩沖液基液加上效應物，其中緩沖液基液為下列任一溶液pH =4-9,0. 005-0. 5M的磷酸鹽緩沖液；pH = 6-9,0. 1-3M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液；pH =3-6,0. 01-3M醋酸鹽緩沖液；pH = 6-9,0. 1-10M的硼酸鹽緩沖液；pH = 2-5,0. 01-1M甘 氨酸-鹽酸緩沖液；效應物是以下的一種或者幾種(1)檸檬酸，終濃度為0.1%-5%，(2) 三羥甲基氨基甲烷，終濃度為0.1%-5%，(3)脫脂奶粉，終濃度為0.01%-20%，(4)疊氮 化鈉，終濃度為0.01%-5%，(5)分子量4000-20000的聚乙二醇，終濃度為0.01%-5%， (6)Tween20，終濃度為 0. 5-5% ；2)制作免疫層析檢測條；該免疫層析檢測條包括樣品墊，結合墊，免疫層析膜，吸 水紙和支撐板；2. 1)免疫層析檢測條的各部件的準備和處理所述樣品墊的材質為疏水性或親水的玻璃纖維或聚酯纖維；樣品墊處 理程序為將樣品墊浸泡于樣品墊處理液中0.5分鐘到2分鐘后取出，或者按照 0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例將樣品墊處理液均勻噴涂于樣品墊上，然后15°C 60°C烘 干或冷凍干燥，待用；所述樣品墊處理液為緩沖液基液加上效應物；所述緩沖液基液為下 列溶液中任一溶液pH = 4-9，0. 005-0. 2M的磷酸鹽緩沖液；pH = 6_9，0. 01-3M三羥甲基氨 基甲烷-鹽酸溶液；PH = 3-6,0. 01-3M醋酸鹽緩沖液；pH = 6-9，0. 1-10M的硼酸鹽緩沖液； pH = 2-5，0. 01-1M甘氨酸-鹽酸緩沖液；所述效應物是以下的一種或者幾種(1)分子量 4000-20000的聚乙二醇，終濃度為0. 01% -5%，(2)蔗糖或者海藻糖，終濃度為5% -80%， (3) Triton X-100，終濃度為0. 5-5% ；所述結合墊的材質為疏水性或親水的玻璃纖維或聚酯纖維；結合墊處理程序為 首先將玻璃纖維或聚酯纖維裁剪成型；然后將其浸泡于步驟1)所述的最初的層析工作液 中0. 5分鐘到2分鐘，或者采用非浸泡方式，而是按照0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例將樣 品墊處理液均勻噴涂于裁剪成型的玻璃纖維或聚酯纖維裁上；然后15°C到60°C烘干或冷 凍干燥；然后取經過步驟1. 4)所得的含有偶聯(lián)抗體或配體或抗原且封閉金磁微粒的層析 工作液按照0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例噴涂于的結合墊上；最后15°C 60°C烘干或冷 凍干燥，待用；
所述免疫層析膜的材質為硝酸纖維素膜、尼龍膜、醋酸纖維素膜、聚酯膜，或硝酸 纖維素與醋酸纖維素的混合膜之一；針對偶聯(lián)抗體或配體或抗原選擇的不同，免疫層析膜 的處理程序分別為若檢測抗原，則金磁微粒偶聯(lián)與檢測抗原特異結合的抗體，首先取與待檢目標物 特異結合的另一抗體，按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成 檢測帶，取多克隆抗體按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成 與所述檢測帶平行的質檢帶，然后15°C 60°C烘干或冷凍干燥；之后將包被有抗體的免疫 層析膜置于所述封閉劑中浸泡0. 5秒到30分鐘，然后15°C 60°C烘干或冷凍干燥，待用；若檢查抗體，則金磁微粒偶聯(lián)檢測抗體特異結合的抗原，則首先取與待檢目標物 特異結合的另一抗原，按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成 檢測帶，取多克隆抗體按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成 與所述檢測帶平行的質檢帶，然后15°C 60°C烘干或冷凍干燥；之后將包被有抗體的免疫 層析膜置于所述封閉劑中浸泡0. 5秒到30分鐘，然后15°C 60°C烘干或冷凍干燥，待用；若檢測小分子受體，則金磁微粒偶聯(lián)與待檢目標物特異結合的配體，則首先取與 待檢目標物特異結合的另一配體，按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層 析膜上形成檢測帶，然后15°C 60°C烘干或冷凍干燥；之后將包被有抗體的免疫層析膜置 于所述封閉劑中浸泡0. 5秒到30分鐘，然后15°C 60°C烘干或冷凍干燥，待用；2. 2)免疫層析檢測條各部件組裝成型，即在帶有不干膠的支撐板上依次貼上免疫層析膜、樣品墊、結合墊和吸水墊，免疫層 析膜設于底襯上的中部，樣品墊和吸水墊分別設于支撐板上的兩邊，結合墊設于加樣墊與 層析膜之間，層析膜的另一端接吸水墊，然后用不干膠徹底固定，最后裁切成免疫層析檢測 條；3)利用雙抗夾心法或競爭法，對被測樣品進行目視化判讀或磁信號定量檢測。上述樣品墊，結合墊和免疫層析膜在制作時，經過15°C到60°C烘干或冷凍干燥 后，最好置于4°C待用。上述步驟3)在臨床實踐過程中，一般對被測樣品定性地可目視化判讀的同時，也 進行高靈敏度的定量檢測。上述步驟3)采用雙抗夾心法或競爭法檢測方法，對樣品進行目視化判讀或磁信 號定量檢測，其檢測原理為待測目標物在點樣帶與金磁微粒標記抗體形成免疫復合物，該復合物在膜上移動 與固定在膜另一端的特異抗體或者配體發(fā)生特異結合，形成固定化的免疫復合物，由于該 免疫復合物攜帶由標記的金磁微粒，因此形成了檢測帶的金磁標記信號。與此同時，部分游 離的金磁微粒標記的抗體可以越過固定化抗體或配體或抗原帶，結合到遠端的包被抗抗體 (二抗)質檢帶，形成新的金磁微粒結合帶，質檢帶的金磁信號。將樣品滴加在樣品墊上或者將試紙條的樣品墊段浸泡于測試液0. 5分鐘到1分鐘 后取出(樣品液切勿沒過結合墊帶域)，檢測包括可目視化和磁信號的檢測。在雙抗夾心法 檢測中在檢測帶和控制帶有可見的紅色或淡紅色線表示陽性，如果在控制帶有可見的紅色 線表示陰性，如果出現(xiàn)控制帶無顏色顯現(xiàn)則表示測試無效。利用磁信號檢測需要使用磁性 免疫閱讀儀，在在檢測帶和控制帶有明顯的磁信號出現(xiàn)表示陽性，如果在控制帶有明顯的磁信號表示陰性，如果出現(xiàn)控制帶沒有明顯磁信號顯現(xiàn)則表示測試無效。利用競爭法的檢測中在檢測帶和控制帶有可見的紅色或淡紅色線表示陰性，如果 在控制帶有可見的紅色線表示陽性，如果出現(xiàn)控制帶無顏色顯現(xiàn)則表示測試無效。利用磁 信號檢測需要使用磁性免疫閱讀儀，在在檢測帶和控制帶有明顯的磁信號出現(xiàn)表示陰性， 如果在控制帶有明顯的磁信號表示陽性，如果出現(xiàn)控制帶沒有明顯磁信號顯現(xiàn)則表示測試 無效。另外，在臨床實踐總結出，對于一些特殊抗原和物質檢測需要應用在偏酸或偏堿 值，比如在消化道疾病方面的，需要在偏酸性的環(huán)境中，而在一些藥物濫用者的直腸分泌物 的檢查可能需要偏堿性的環(huán)境，因此需要針對不同的檢測對象(樣本)，選擇適宜值的各種 緩沖液。同理，由于檢測樣本形式多樣，如血清、尿樣、唾液。這些多種樣本組分復雜，可能 會影響層析的效果。所以，在緩沖液的濃度，以及相應效應物的濃度的選擇上，也需要充分 考慮樣本形式對免疫層析的干擾。例如，在病人代謝失調的尿液中，一些鹽離子濃度會很高 使金磁微粒表面電荷發(fā)生變化，影響層析的效果，所以相應要使用較高的表面活性劑的用 量，Tween20的用量可能達到3%以上。再如，環(huán)境檢測中一些特殊的水溶液樣本，可能含有 多種金屬成分，這些金屬成分或影響配體活性，就需要低緩沖液濃度，比如0. 005的磷酸鹽 緩沖液。本發(fā)明對金磁微粒的使用，主要是考慮到其如下優(yōu)點1、金磁微粒作為一種超順磁性納米微粒，只有在磁場中才具有磁響應性。這就使 得磁性微粒在溶液中可以自由混合而不會因相互作用而發(fā)生聚合。所以在標記或偶聯(lián)抗 體，封閉過程中省去的離心的復雜過程。2、金磁微粒物理性質非常穩(wěn)定，在持續(xù)一定時間之后仍然可以重復實驗測量結 果。是存檔備案的理想選材。3、磁場的信號強弱與磁性微粒的磁性強度呈線性關系。這一磁性檢測固有的線性 特點保證了分析的高靈敏度和準確性，以及寬廣的檢測區(qū)間。4、生物材料及生物體內極少有磁性物質存在.這一特性克服了常規(guī)檢測中樣品 顏色的干擾。基于上述理論，本發(fā)明將免疫反應的高特異性與金磁微粒良好的光學和磁學性質 有機的結合，利用金磁微粒的具有膠體金特殊顏色和聚磁性微粒的超順磁性，建立快速、特 異、簡便、靈敏的免疫層析檢測方法，既可以通過金磁微粒的特征顏色進行可目視化的判讀 也可通過金磁微粒磁信號的強弱對被測物進行定量檢測，方法簡單，成本低，適用于血樣、 尿樣、唾液等樣本，應用于激素、蛋白質、病毒、毒品、細菌、環(huán)境污染等檢測，可在醫(yī)院、海 關、機場、家庭等場所使用，實現(xiàn)人體與動植物的疾病檢測，環(huán)境的檢測，食品安全檢測、以 及毒品和藥物濫用檢測等。


圖1是利用磁免疫色譜分析系統(tǒng)對試紙條上金磁微粒的磁信號的強弱檢測陰性 的結果；圖2是在免疫試紙條上金磁微粒的可見的顏色檢測陽性與陰性的結果；
圖3為金磁微粒標記快速免疫層析試紙條結構示意圖。從圖1，可以看出檢測帶的磁信號與周圍背景相似，而質控帶的磁信號明顯高于周 圍背景顯示出陰性結果。附圖標號說明1-金磁標結合墊，2-檢測線T，3-質控線C，4-吸水材料，5-PVC膠板，6_層析膜 (NC硝酸纖維素膜)，7-樣品墊。
具體實施例方式本發(fā)明利用金磁微粒的磁學性質和特征顏色和易于偶聯(lián)生物分子的特性，將金磁 微粒標記抗體或配體或抗原，用然后將此標記物涂覆于一定材質的結合墊上，目標物的另 一抗體(單抗或多抗)包被在免疫層析膜上形成檢測帶，在此包被膜上同時平行包被抗抗 體(二抗)形成質控帶。再將處理過的樣品墊，結合墊，免疫層析膜，和吸水墊依次粘貼在支 撐板板上，利用雙抗體夾心法和競爭法檢測樣品中是否含有目標物和定量檢測目標物。當 待測樣品中含有目標物時，目標物先與金磁微粒標記抗體結合，由于層析作用反應結合物 沿包被層析膜向前移動，當遇到包被抗體時形成抗體一抗原(目標物)一金磁微?？贵w復 合物而富集在檢測帶上，多余的金磁微粒標記物繼續(xù)移動到控制帶位置，由于二抗與金磁 微粒標記的抗體發(fā)生免疫反應，又富集在控制帶上，0. 5-20分鐘后，取出試紙條，用肉眼在 檢測帶和質控帶上觀察結果也可以通過磁性免疫色譜閱讀進行結果的定量判讀。如果質控 帶處都沒有顏色或者沒有明顯的磁信號，說明試紙條有質量問題，測試無效。各種金磁微粒組裝型磁性復合微粒和核/殼型超順磁性復合微粒，以及對金磁 微粒進行的各種表面功能化修飾。以下結合本發(fā)明的技術方案提供實施例。實施例一基于夾心法應用金磁微粒標記快速免疫層析試紙條對早孕檢測(健康檢測領域)1、金磁微粒標記人絨毛膜促性腺激素HCG的β _抗體，并溶解在層析工作液中1. 1)取金磁微粒，用ρΗ = 7，0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡3次，將人絨毛膜促性腺 激素HCG的β -抗體按200 μ g/mg金磁微粒的比例加入經ρΗ = 7，0. OlM的磷酸鹽緩沖液 的平衡處理的金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒溫振蕩器中充分反應30min ；1. 2)反應完畢，在磁性分離器上分離3min，棄上清，用ρΗ = 7，0. OlM的磷酸鹽緩 沖液含有0.5% Tween20清洗，去除未結合在金磁微粒表面的蛋白分子；重復以上步驟三 次。1. 3)封閉加入Iml的封閉劑到表面已固定HCG抗體的金磁微粒中，置于35°C、 ISOrpm的空氣恒溫振蕩器中充分混勻2h進行封閉。封閉劑為含有5%的牛血清白蛋白 (BSA)、脫脂奶粉的ρΗ = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液。1. 4)反應完畢，在磁性分離器上分3min，棄上清，用ρΗ = 7，0. OlM的磷酸鹽緩沖 液含有0. 5% Tween 20清洗，去除未結合在金磁微粒表面的蛋白分子；重復以上步驟三次； 最后溶解在層析工作液中。這里的層析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液其中含有 以下效應物(l)BSA，最終濃度為1%。(2)脫脂奶粉，最終濃度為2%。(3)蔗糖，最終濃度 為5%。(4)Tween20，最終濃度為5%。
2、免疫層析裝置的各個組件的處理。2. 1)樣品墊為聚酯纖維。樣品墊處理程序為將聚酯纖維裁剪成5cmX5cm然后 浸泡于樣品墊處理液中0. 5分鐘，然后30°C烘干，置于4°C待用，樣品墊處理液是pH = 7， 0. OlM的磷酸鹽緩沖液含有蔗糖，最終濃度5%2.2)結合墊的材質為，親水的玻璃纖維。結合墊處理程序為將結合墊裁剪成 5cmX 5cm然后浸泡于層析工作液中0. 5分鐘，然后30°C烘干，然后將0. 5ml步驟1中溶解 在層析工作液中金磁微粒標記人絨毛膜促性腺激素HCG的β -抗體噴涂在5cmX 5cm的結 合墊上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)免疫層析膜的材質為，硝酸纖維素膜。免疫層析膜的處理首先將20ul濃度為 2. 5mg/ml的人絨毛膜促性腺激素HCG的α -抗體噴涂成線在長度為30厘米的免疫層析膜 上形成檢測帶，和將20ul濃度為2. 5mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體噴涂成線在在長度為30 厘米的免疫層析膜上形成質檢帶，檢測帶與質檢帶相隔4毫米。然后35°C到60°C烘干或冷 凍干燥。封閉將包被有抗體的免疫層析膜置于封閉劑中，30°C烘干，置于4°C待用。封閉 劑為含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%的脫脂奶粉的pH= 7，0. OlM的磷酸鹽緩沖液。2.4)將樣品墊，結合墊，和吸水墊裁剪成一定大小5cmX 3cm，在帶有不干膠的支 撐板上依次貼上層析膜、樣品墊、結合墊和吸水墊，免疫層析膜設于底襯上的中部，樣品墊 和吸水墊分別設于支撐板上的兩邊，結合墊設于加樣墊與層析膜之間，層析膜的另一端接 吸水墊，然后用不干膠徹底固定。最后，將其裁剪寬度為4毫米的試紙條。2.5)樣品測試和結果判讀。將待檢測的婦女尿樣滴加在樣品墊上3分鐘后判讀結果，檢測包括可目視化和磁 信號的檢測。檢測中在檢測帶和控制帶有可見的紅色或淡紅色線表示陽性，如果在控制帶 有可見的紅色線表示陰性，如果出現(xiàn)控制帶無顏色顯現(xiàn)則表示測試無效。檢測結果如圖1 和圖2。利用磁信號檢測需要使用磁性免疫閱讀儀，在檢測帶和控制帶有明顯的磁信號出現(xiàn) 表示陽性，如果在控制帶有明顯的磁信號表示陰性，如果出現(xiàn)控制帶明顯磁信號顯現(xiàn)則表 示測試無效實施例二 基于夾心法應用金磁微粒標記快速免疫層析試紙條檢測心肌鈣蛋白(疾病檢測 領域)1、金磁微粒標記心肌鈣蛋白單克隆抗體，并溶解在層析工作液中1. 1)取金磁微粒lmg，用pH = 7，0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡3次，將lmg/ml的心 肌鈣蛋白單克隆抗體mAb2-19C7，200 μ g加入金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒溫振蕩器 中充分反應30min ；1. 2)反應完畢，在磁性分離器上分離3min，吸去上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸鹽 緩沖液含有0. 5% Tween20清洗，去除未標記的心肌鈣蛋白抗體I分子；重復以上步驟三 次。1. 3)封閉加入Iml的封閉劑到表面已固定心肌鈣蛋白抗體I的金磁微粒中，置 于35°C、ISOrpm的空氣恒溫振蕩器中充分混勻2h進行封閉。封閉劑為含有5%的牛血清白 蛋白(BSA)、5%脫脂奶粉、5%小牛血的pH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液。
1. 4)反應完畢，在磁性分離器上分離3min，棄上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸鹽緩 沖液含有0.5% Tween20清洗，去除未結合在金磁微粒表面的抗體分子；重復以上步驟三 次；最后溶解在層析工作液中。這里的層析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液其中含 有以下效應物濃度為2 %的檸檬酸，濃度為1 %的BSA，濃度2 %的脫脂奶粉，濃度為0. 5 %的 疊氮化鈉，濃度為2%的聚乙烯吡咯烷酮，濃度為2%的分子量6000的聚乙二醇，濃度5%的 蔗糖，濃度5%的Tween20。2、心肌鈣蛋白免疫層析裝置的各個組件的處理。2. 1)樣品墊為玻璃纖維膜。樣品墊處理程序為將玻璃纖維膜裁剪成5cmX5cm， 然后浸泡于樣品墊處理液中0. 5分鐘取出，然后30°C烘干，置于4°C待用。樣品墊處理液是 PH = 7，0. OlM的硼酸鹽緩沖液，緩沖液還含有(1)5%的聚乙烯吡咯烷酮，。(2)濃度為5% 的聚乙二醇6000。(3)濃度為5%蔗糖。(4)濃度為5%的Tween20。2. 2)結合墊的材質選用聚酯纖維膜。結合墊處理程序為首先將聚酯纖維膜裁剪 成5cmX5cm浸泡于層析工作液中0. 5分鐘取出，然后30°C烘干，然后將0. 5ml金磁微粒標 記心肌鈣蛋白抗體噴涂在5cmX5cm的結合墊上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)層析膜的制備心肌鈣蛋白檢測中層析膜選用硝酸纖維素膜。免疫層析膜的 處理首先將濃度為2. 5mg/ml,20ul將心肌鈣蛋白單克隆抗體mAbl_16All噴涂成線在長度 30cm免疫層析膜上形成檢測帶，和羊抗鼠IgG多克隆抗體噴涂成線在長度30cm免疫層析膜 上形成質檢帶，檢測帶與質檢帶相隔5毫米。然后35°C到60°C烘干或冷凍干燥。封閉將包被有抗體的免疫層析膜置于封閉劑中，30°C烘干，置于4°C待用。封閉 劑為含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%脫脂奶粉、5%小牛血的pH= 7，0.01M的磷酸鹽緩 沖液。2. 4)在支撐板上依次貼上層析膜、樣品墊、結合墊和吸水墊，免疫層析膜設于底襯 上的中部，樣品墊和吸水墊分別設于支撐板上的兩邊，結合墊設于加樣墊與層析膜之間，層 析膜的另一端接吸水墊，最后用不干膠固定。然后裁剪成寬4毫米寬的試紙條。2.5)樣品測試和結果判讀。將待檢病人的血清樣品滴加在樣品墊上3分鐘后判讀結果，檢測包括可目視化和 磁信號的檢測。檢測中在檢測帶和控制帶有可見的紅色或淡紅色線表示陽性，如果在控制 帶有可見的紅色線表示陰性，如果出現(xiàn)控制帶無顏色顯現(xiàn)則表示測試無效。利用磁信號檢 測需要使用磁性免疫閱讀儀，在檢測帶和控制帶有明顯的磁信號出現(xiàn)表示陽性，如果在控 制帶有明顯的磁信號表示陰性，如果出現(xiàn)控制帶明顯磁信號顯現(xiàn)則表示測試無效。實施例三基于競爭法利用金磁微粒檢測食品中的黃曲霉素(食品安全檢測領域)1、金磁微粒標記抗黃曲霉素單克隆抗體clone 3A7，并溶解在層析工作液中1. 1)取金磁微粒lmg，用pH = 7，0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡3次，將lmg/ml的抗 黃曲霉素單克隆抗體clone 3A7，200 μ g加入金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒溫振蕩器 中充分反應30min ；1. 2)反應完畢，在磁性分離器上分離3min，吸去上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸鹽 緩沖液含有0. 5% Tween20清洗，去除未標記的抗黃曲霉素單克隆抗體clone 3A7 ；重復以 上步驟三次；
1. 3)封閉加入Iml的封閉劑到表面已固定心肌鈣蛋白抗體I的金磁微粒中，置 于35°C、ISOrpm的空氣恒溫振蕩器中充分混勻2h進行封閉。封閉劑為含有5%的牛血清白 蛋白(BSA)、5%脫脂奶粉、5%小牛血的pH= 7，0. OlM的磷酸鹽緩沖液；1. 4)反應完畢，在磁性分離器上分離3min，棄上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸鹽緩 沖液含有0.5% Tween20清洗，去除未結合在金磁微粒表面的抗體分子；重復以上步驟三 次；最后溶解在層析工作液中。這里的層析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液其中含 有以下效應物濃度為2 %的檸檬酸，濃度為1 %的BSA，濃度2 %的脫脂奶粉，濃度為0. 5 %的 疊氮化鈉，濃度為2%的聚乙烯吡咯烷酮，濃度為2%的分子量6000的聚乙二醇，濃度5%的 蔗糖，濃度5%的Tween20。2、黃曲霉素檢測免疫層析裝置的各個組件的處理。2. 1)樣品墊為玻璃纖維膜。樣品墊處理程序為將玻璃纖維膜裁剪成5cmX5cm， 然后浸泡于樣品墊處理液中0. 5分鐘取出，然后30°C烘干，置于4°C待用。樣品墊處理液是 PH = 7，0. OlM的硼酸鹽緩沖液，緩沖液還含有(1)5%的聚乙烯吡咯烷酮，。(2)濃度為5% 的聚乙二醇6000。(3)濃度為5%蔗糖。(4)濃度為5%的Tween20。2. 2)結合墊的材質選用聚酯纖維膜。結合墊處理程序為首先將聚酯纖維膜裁剪 成5cmX5cm浸泡于層析工作液中0. 5分鐘取出，然后30°C烘干，然后將0. 5ml金磁微粒標 記抗黃曲霉素單抗體噴涂在5cmX5cm的結合墊上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)層析膜的制備黃曲霉素檢測中層析膜選用硝酸纖維素膜。免疫層析膜的處 理首先將濃度為2. 5mg/ml，20ul將黃曲霉素與牛血清白蛋白的共價偶聯(lián)物噴涂成線在長 度30cm免疫層析膜上形成檢測帶，和羊抗鼠IgG多克隆抗體噴涂成線在長度30cm免疫層 析膜上形成質檢帶，檢測帶與質檢帶相隔5毫米。然后35°C到60°C烘干或冷凍干燥。封閉將包被有抗體的免疫層析膜置于封閉劑中，30°C烘干，置于4°C待用。封閉 劑為含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%脫脂奶粉、5%小牛血的pH = 7，0. OlM的磷酸鹽緩 沖液。2. 4)在支撐板上依次貼上層析膜、樣品墊、結合墊和吸水墊，免疫層析膜設于底襯 上的中部，樣品墊和吸水墊分別設于支撐板上的兩邊，結合墊設于加樣墊與層析膜之間，層 析膜的另一端接吸水墊，最后用不干膠固定。然后裁剪成寬4毫米寬的試紙條。2.5)樣品測試和結果判讀。將待檢樣品滴加在樣品墊上3分鐘后判讀結果，檢測包括可目視化和磁信號的檢 測。檢測中在檢測帶和控制帶有可見的紅色或淡紅色線表示陰性，如果在控制帶有可見的 紅色線表示陽性，如果出現(xiàn)控制帶無顏色顯現(xiàn)則表示測試無效。利用磁信號檢測需要使用 磁性免疫閱讀儀，在檢測帶和控制帶有明顯的磁信號出現(xiàn)表示陰性，如果在控制帶有明顯 的磁信號表示陽性，如果出現(xiàn)控制帶明顯磁信號顯現(xiàn)則表示測試無效。實施例四基于競爭法利用金磁微粒檢測嗎啡(毒品和藥物濫用檢測領域)1、金磁微粒標記抗嗎啡的單克隆抗體，并溶解在層析工作液中1. 1)取金磁微粒lmg，用pH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡3次，將lmg/ml的 抗嗎啡的單克隆抗體200ug加入金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒溫振蕩器中充分反應 30min ；
1. 2)反應完畢，在磁性分離器上分離3min，吸去上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸鹽 緩沖液含有0. 5% Tween20清洗，去除未標記的抗嗎啡的單克隆抗體；重復以上步驟三次。1. 3)封閉加入Iml的封閉劑到表面已固定心肌鈣蛋白抗體I的金磁微粒中，置 于35°C、ISOrpm的空氣恒溫振蕩器中充分混勻2h進行封閉。封閉劑為含有5%的牛血清白 蛋白(BSA)、5%脫脂奶粉、5%小牛血的pH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液。1. 4)反應完畢，在磁性分離器上分離3min，棄上清，用pH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩 沖液含有0.5% Tween20清洗，去除未結合在金磁微粒表面的抗體分子；重復以上步驟三 次；最后溶解在層析工作液中。這里的層析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸鹽緩沖液其中含 有以下效應物濃度為2 %的檸檬酸，濃度為1 %的BSA，濃度2 %的脫脂奶粉，濃度為0. 5 %的 疊氮化鈉，濃度為2%的聚乙烯吡咯烷酮，濃度為2%的分子量6000的聚乙二醇，濃度5%的 蔗糖，濃度5%的Tween20。2、嗎啡檢測層析裝置的各個組件的處理。2. 1)樣品墊為玻璃纖維膜。樣品墊處理程序為將玻璃纖維膜裁剪成5cmX5cm， 然后浸泡于樣品墊處理液中0. 5分鐘取出，然后30°C烘干，置于4°C待用。樣品墊處理液是 PH = 7，0. OlM的硼酸鹽緩沖液，緩沖液還含有(1)5%的聚乙烯吡咯烷酮，。(2)濃度為5% 的聚乙二醇6000。(3)濃度為5%蔗糖。(4)濃度為5%的Tween20。2. 2)結合墊的材質選用聚酯纖維膜。結合墊處理程序為首先將聚酯纖維膜裁剪 成5cmX5cm浸泡于層析工作液中0. 5分鐘取出，然后30°C烘干，然后將0. 5ml金磁微粒標 記抗嗎啡單克隆抗體噴涂在5cmX5cm的結合墊上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)層析膜的制備嗎啡檢測中層析膜選用硝酸纖維素膜。免疫層析膜的處理首 先將濃度為2. 5mg/ml,20ul將嗎啡與牛血清白蛋白的共價偶聯(lián)物噴涂成線在長度30cm免 疫層析膜上形成檢測帶，和羊抗鼠IgG多克隆抗體噴涂成線在長度30cm免疫層析膜上形成 質檢帶，檢測帶與質檢帶相隔5毫米。然后35°C到60°C烘干或冷凍干燥。封閉將包被有抗體的免疫層析膜置于封閉劑中，30°C烘干，置于4°C待用。封閉 劑為含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%脫脂奶粉、5%小牛血的pH = 7，0. OlM的磷酸鹽緩 沖液。2. 4)在支撐板上依次貼上層析膜、樣品墊、結合墊和吸水墊，免疫層析膜設于底襯 上的中部，樣品墊和吸水墊分別設于支撐板上的兩邊，結合墊設于加樣墊與層析膜之間，層 析膜的另一端接吸水墊，最后用不干膠固定。然后裁剪成寬4毫米寬的試紙條。2.5)樣品測試和結果判讀。將待檢樣品滴加在樣品墊上3分鐘后判讀結果，檢測包括可目視化和磁信號的檢 測。檢測中在檢測帶和控制帶有可見的紅色或淡紅色線表示陰性，如果在控制帶有可見的 紅色線表示陽性，如果出現(xiàn)控制帶無顏色顯現(xiàn)則表示測試無效。利用磁信號檢測需要使用 磁性免疫閱讀儀，在檢測帶和控制帶有明顯的磁信號出現(xiàn)表示陰性，如果在控制帶有明顯 的磁信號表示陽性，如果出現(xiàn)控制帶明顯磁信號顯現(xiàn)則表示測試無效。
權利要求
一種金磁微粒標記免疫層析快速檢測方法，包括以下步驟1)金磁微粒標記待檢目標物的抗體或者配體或者抗原，并溶解在層析工作液中；1.1)取金磁微粒，用偶聯(lián)緩沖液平衡3次，然后將待檢目標物的抗體或配體或抗原按照與金磁微粒質量比10～500μg∶1mg加入經平衡處理后的金磁微粒中，置于0～50℃、50～220rpm的空氣恒溫振蕩器中充分反應10min～12h；所述偶聯(lián)緩沖液為pH＝4 9，0.005 0.5M的磷酸鹽緩沖液、pH＝3 6，0.1 3M的三羥甲基氨基甲烷 鹽酸溶液或pH＝6 9，0.01 3M的醋酸鹽緩沖液中的一種，所述金磁微粒為核殼結構、組裝結構、磁性氧化鐵組裝在核殼結構外層的金磁微?；蛘呋谝陨先N結構進行表面功能化修飾的金磁微粒；1.2)于空氣恒溫振蕩器中反應完畢，在磁性分離器上分離2～3min，棄上清，用清洗緩沖液清洗，去除非特異性結合的分子，得到表面已固定抗體或配體或抗原的金磁微粒；所述清洗緩沖液為下列任一溶液pH＝4 9，0.005 0.5M，且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％Triton X 100的磷酸鹽緩沖液；pH＝6 9，0.1 3M且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％Triton X 100的三羥甲基氨基甲烷 鹽酸溶液；pH＝3 6，0.01 3M且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％Triton X 100的醋酸鹽緩沖液；pH＝6 9，0.1 10M且含有0.5 5％Tween20或者0.05 2％Triton X 100的硼酸鹽緩沖液；pH＝2 5，0.01 1M且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％TritonX 100的甘氨酸 鹽酸緩沖液；1.3)封閉加入500ul～2ml的封閉劑到表面已固定抗體或配體或抗原的金磁微粒中，置于20～80℃、50～220rpm的恒溫振蕩器中充分混勻5min～12h進行封閉；所述封閉劑是采用上述偶聯(lián)緩沖液溶解了以下物質的一種或多種牛血清白蛋白(BSA)、賴氨酸(Lys)、脫脂奶粉、乙醇胺、小牛血清、山羊血清；上述組分的終濃度均為0.05％ 10％；1.4)將偶聯(lián)抗體且封閉完畢的金磁微粒在磁性分離器上分離2～3min，棄上清，用清洗緩沖液清洗，去除未結合的生物分子，最后將此偶聯(lián)有抗體且封閉完成的金磁微粒溶解在層析工作液中；所述層析工作液是緩沖液基液加上效應物，其中緩沖液基液為下列任一溶液pH＝4 9，0.005 0.5M的磷酸鹽緩沖液；pH＝6 9，0.1 3M三羥甲基氨基甲烷 鹽酸溶液；pH＝3 6，0.01 3M醋酸鹽緩沖液；pH＝6 9，0.1 10M的硼酸鹽緩沖液；pH＝2 5，0.01 1M甘氨酸 鹽酸緩沖液；效應物是以下的一種或者幾種(1)檸檬酸，終濃度為0.1％ 5％，(2)三羥甲基氨基甲烷，終濃度為0.1％ 5％，(3)脫脂奶粉，終濃度為0.01％ 20％，(4)疊氮化鈉，終濃度為0.01％ 5％，(5)分子量4000 20000的聚乙二醇，終濃度為0.01％ 5％，(6)Tween20，終濃度為0.5 5％；2)制作免疫層析檢測條；該免疫層析檢測條包括樣品墊，結合墊，免疫層析膜，吸水紙和支撐板；2.1)免疫層析檢測條的各部件的準備和處理所述樣品墊的材質為疏水性或親水的玻璃纖維或聚酯纖維；樣品墊處理程序為將樣品墊浸泡于樣品墊處理液中0.5分鐘到2分鐘后取出，或者按照0.5ul/20cm2 20ul/20cm2的比例將樣品墊處理液均勻噴涂于樣品墊上，然后15℃～60℃烘干或冷凍干燥，待用；所述樣品墊處理液為緩沖液基液加上效應物；所述緩沖液基液為下列溶液中任一溶液pH＝4 9，0.005 0.2M的磷酸鹽緩沖液；pH＝6 9，0.01 3M三羥甲基氨基甲烷 鹽酸溶液；pH＝3 6，0.01 3M醋酸鹽緩沖液；pH＝6 9，0.1 10M的硼酸鹽緩沖液；pH＝2 5，0.01 1M甘氨酸 鹽酸緩沖液；所述效應物是以下的一種或者幾種(1)分子量4000 20000的聚乙二醇，終濃度為0.01％ 5％，(2)蔗糖或者海藻糖，終濃度為5％ 80％，(3)Triton X 100，終濃度為0.5 5％；所述結合墊的材質為疏水性或親水的玻璃纖維或聚酯纖維；結合墊處理程序為首先將玻璃纖維或聚酯纖維裁剪成型；然后將其浸泡于步驟1)所述的最初的層析工作液中0.5分鐘到2分鐘，或者采用非浸泡方式，而是按照0.5ul/20cm2 20ul/20cm2的比例將樣品墊處理液均勻噴涂于裁剪成型的玻璃纖維或聚酯纖維裁上；然后15℃到60℃烘干或冷凍干燥；然后取經過步驟1.4)所得的含有偶聯(lián)抗體或配體或抗原且封閉金磁微粒的層析工作液按照0.5ul/20cm2 20ul/20cm2的比例噴涂于的結合墊上；最后15℃～60℃烘干或冷凍干燥，待用；所述免疫層析膜的材質為硝酸纖維素膜、尼龍膜、醋酸纖維素膜、聚酯膜，或硝酸纖維素與醋酸纖維素的混合膜之一；針對偶聯(lián)抗體或配體或抗原選擇的不同，免疫層析膜的處理程序分別為若檢測抗原，則金磁微粒偶聯(lián)與檢測抗原特異結合的抗體，首先取與待檢目標物特異結合的另一抗體，按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成檢測帶，取多克隆抗體按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成與所述檢測帶平行的質檢帶，然后15℃～60℃烘干或冷凍干燥；之后將包被有抗體的免疫層析膜置于所述封閉劑中浸泡0.5秒到30分鐘，然后15℃～60℃烘干或冷凍干燥，待用；若檢查抗體，則金磁微粒偶聯(lián)檢測抗體特異結合的抗原，則首先取與待檢目標物特異結合的另一抗原，按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成檢測帶，取多克隆抗體按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成與所述檢測帶平行的質檢帶，然后15℃～60℃烘干或冷凍干燥；之后將包被有抗體的免疫層析膜置于所述封閉劑中浸泡0.5秒到30分鐘，然后15℃～60℃烘干或冷凍干燥，待用；若檢測小分子受體，則金磁微粒偶聯(lián)與待檢目標物特異結合的配體，則首先取與待檢目標物特異結合的另一配體，按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例噴涂成線在免疫層析膜上形成檢測帶，然后15℃～60℃烘干或冷凍干燥；之后將包被有抗體的免疫層析膜置于所述封閉劑中浸泡0.5秒到30分鐘，然后15℃～60℃烘干或冷凍干燥，待用；2.2)免疫層析檢測條各部件組裝成型，即在帶有不干膠的支撐板上依次貼上免疫層析膜、樣品墊、結合墊和吸水墊，免疫層析膜設于底襯上的中部，樣品墊和吸水墊分別設于支撐板上的兩邊，結合墊設于加樣墊與層析膜之間，層析膜的另一端接吸水墊，然后用不干膠徹底固定，最后裁切成免疫層析檢測條；3)利用雙抗夾心法或競爭法，對被測樣品進行目視化判讀或磁信號定量檢測。
2.根據權利要求1所述的金磁微粒標記免疫層析快速檢測方法，其特征在于所述樣 品墊，結合墊和免疫層析膜在制作時，經過15°C到60°C烘干或冷凍干燥后，置于4°C待用。
3.根據權利要求2所述的金磁微粒標記免疫層析快速檢測方法，其特征在于步驟3) 在對被測樣品定性地可目視化判讀的同時，進行高靈敏度的定量檢測。
4.根據權利要求1至3任一所述的金磁微粒標記免疫層析檢測條，用于人體與動植物的疾病檢測，環(huán)境的檢測，食品安全檢測、以及毒品和藥物濫用檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種金磁微粒標記免疫層析快速檢測方法，旨在解決傳統(tǒng)免疫層析分析法的檢測方法在臨床實踐中易造成主觀差異化、檢測精度和靈敏度低、操作繁復、適用領域窄的問題。該檢測方法的基本思想是金磁微粒偶聯(lián)抗體或配體或抗原以后在與之匹配的工作液和免疫層析裝置中能夠快速，定量的高靈敏度地檢測被分析物。本發(fā)明既可以通過金磁微粒的特征顏色進行可目視化的判讀也可通過金磁微粒磁信號的強弱對被測物進行定量檢測，方法簡單，成本低，能夠實現(xiàn)人體與動植物的疾病檢測，環(huán)境的檢測，食品安全檢測、以及毒品和藥物濫用檢測等。
文檔編號G01N33/76GK101893627SQ20101022244
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權日2010年7月8日
發(fā)明者崔亞麗, 惠文利, 石峰 申請人:崔亞麗