專利名稱：檢測試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫檢測領(lǐng)域的一種快速檢測試劑盒及其應(yīng)用方法，尤其涉及一種通 過顯色來判斷檢測結(jié)果的檢測試劑盒及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
快速檢測試劑盒主要應(yīng)用免疫層析技術(shù)，免疫層析技術(shù)是二十世紀(jì)九十年代出現(xiàn) 的一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷技術(shù)。其原理是將特異的蛋白(抗原或者抗體)先 固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)域，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作 用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至該區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異 性結(jié)合。若用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診 斷。部分檢測項(xiàng)目(比如促黃體生成激素、鐵蛋白等)應(yīng)用目前的檢測試劑盒進(jìn)行檢 測時(shí)，需要將檢測線的顯色強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)顯色強(qiáng)度對比，或者對比檢測線和質(zhì)控線的顯色強(qiáng) 度。由于人為地比較顯色強(qiáng)度(尤其是在顯色強(qiáng)度比較接近時(shí))存在誤差，因此使得試驗(yàn) 結(jié)果的可靠性也較小。目前需要一種通過是否顯色來比較樣品中的待測物的濃度與檢測限度的試劑盒， 從而減少結(jié)果判斷的主觀依賴性。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種通過顯色來判斷檢測結(jié)果的檢測 試劑盒及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的所采用的具體技術(shù)方案如下。本發(fā)明的檢測試劑盒包括樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙、反應(yīng)支持 物，所述樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙依次連接并均設(shè)置在所述反應(yīng)支持物 上，所述結(jié)合物墊含有示蹤物標(biāo)記的生物活性原料A，所述硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測條帶和 質(zhì)控條帶，所述檢測條帶設(shè)置于靠近所述結(jié)合物墊的一側(cè)并含有生物活性原料B，所述質(zhì)控 條帶設(shè)置于遠(yuǎn)離結(jié)合物墊的一側(cè)并含有生物活性原料C，所述檢測試劑盒還包括設(shè)置在所 述樣品墊上并與所述樣品墊連通的樣品處理單元，所述樣品處理單元包括能夠過濾樣品的 樣品處理墊和吸附有生物活性原料D的滲透濾膜，所述生物活性原料D能夠吸附所述樣品 中的待測物。優(yōu)選地，所述生物活性原料A、B、C、D是抗原或抗體，其中，所述生物活性原料A、B、 D相似或不同，所述生物活性原料C不同于所述生物活性原料A、B、D。優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括固定卡，所述樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸 水濾紙、反應(yīng)支持物、樣品處理單元通過所述固定卡固定連接在一起。優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括固定在所述固定卡中的稀釋液孔，所述稀釋液孔 與所述樣品墊連通、設(shè)置在所述樣品處理單元的遠(yuǎn)離所述結(jié)合物墊的一側(cè)并且與所述樣品處理單元連接。優(yōu)選地，所述樣品處理墊由纖維素制成，所述滲透濾膜由硝酸纖維素或醋酸纖維 素制成。本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述權(quán)利要求的檢測試劑盒的生物制品檢測方法，其特征 在于，包括以下 步驟(1)樣品通過所述樣品處理單元，樣品中的部分待測物與所述生物活性原料D反 應(yīng)并停留在所述滲透濾膜上；(2)樣品經(jīng)過所述樣品墊后移動(dòng)至所述結(jié)合物墊，未與生物活性原料D反應(yīng)的待 測物與所述示蹤物標(biāo)記的生物活性原料A結(jié)合，形成復(fù)合物；(3)所述復(fù)合物在經(jīng)過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對于所述復(fù)合物不足 量的生物活性原料B和生物活性原料C特異性結(jié)合；(4)如果所述檢測條帶出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明所述待測物含量在檢測限度以 上，為陽性，如果所述檢測條帶未出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明所述待測物含量在檢測限度以 下，為陰性；(5)如果所述質(zhì)控條帶出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明步驟(4)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，如果 所述質(zhì)控條帶未出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明所述示蹤物失效或者實(shí)驗(yàn)操作有誤，步驟(4) 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。優(yōu)選地，在所述步驟(1)中，如果所述待測物在所述樣品中的濃度或閾值偏高，則 在樣品進(jìn)入所述樣品處理單元后，通過所述稀釋液孔加入稀釋液。優(yōu)選地，根據(jù)所述樣品中待測物的性質(zhì)相應(yīng)地選擇滲透濾膜的厚度、層數(shù)以及處 理所述滲透濾膜的參數(shù)，所述參數(shù)包括生物活性原料的種類及濃度、封閉方法。優(yōu)選地，所述選擇的方法為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。本發(fā)明的有益效果如下。樣品的待測物濃度通過樣品處理單元的處理后可以降低一個(gè)水平，通過控制該水 平的具體值，可以達(dá)到更敏感地待測物濃度是否在某個(gè)水平之上。通過本發(fā)明的方法以及試劑盒，能夠改進(jìn)目前很多檢測，尤其是促卵泡生成激素、 鐵蛋白等需要比色確定其濃度的檢測項(xiàng)目以及目標(biāo)濃度和正常濃度相差不大的檢測項(xiàng)目。 本發(fā)明使這些檢測項(xiàng)目改進(jìn)成為只需要判斷是否出現(xiàn)有色檢測條帶即可判斷。通過本發(fā)明的方法以及試劑盒，避免了比色本身引起的結(jié)果判斷和穩(wěn)定性的不一 致性；同時(shí)可以通過調(diào)整樣品處理單元的處理程度，對一個(gè)目標(biāo)檢測物進(jìn)行梯度檢測；這 種方法的實(shí)現(xiàn)使得臨床更多的檢測項(xiàng)目采用膠體金快速檢測法，從而大幅度改善這些檢測 項(xiàng)目的效率和操作。


圖1是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案的試劑盒的剖面圖；圖2是本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案的試劑盒的剖面圖；圖3是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案的試劑盒的正視圖；圖4是樣品處理單元的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案的陽性結(jié)果示意圖6是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案的陰性結(jié)果示意圖；圖7是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案檢測結(jié)果無效示意圖；圖8是本發(fā)明的一個(gè)具體制作方案檢測結(jié)果無效示意圖。其中1.吸水濾紙；2.反應(yīng)支持物；3.硝酸纖維素膜；4.結(jié)合物墊；5.樣品墊； 6.樣品處理單元；7.稀釋液孔；8.固定卡；9.樣品處理墊；10.滲透濾膜；C.質(zhì)控條帶； T.檢測條帶。
具體實(shí)施方式

本發(fā)明的基本思路是，在試劑盒中增加一個(gè)樣品處理單元，通過該樣品處理單元 對于樣品進(jìn)行預(yù)處理，使得樣品中的待測物的濃度降低，將處理后的樣品再通過試劑盒的 其他部分進(jìn)行檢測。樣品處理單元包括樣品處理墊和滲透濾膜。樣品處理墊的主要作用為支撐所述滲 透濾膜以及將樣品中大顆粒過濾。滲透濾膜的主要作用為結(jié)合樣品中待測物和層析處理。一般情況下，滲透濾膜選用滲透型硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，樣品處理墊選 用玻璃纖維膜。樣品處理墊一般有纖維素制成，其一般不需要處理。在比較特殊的樣品情況下，可 以為了平衡樣品中的離子或者PH值等，用一定的緩沖體系(比如PBS、TRIS-HC1等)處理。滲透濾膜的處理方式主要為生物活性原料吸附處理以及封閉處理。首先采用檢測條帶所含有的生物活性原料對滲透濾膜進(jìn)行處理，使得滲透濾膜吸 附，使得滲透濾膜能夠?qū)悠分械拇郎y物具有吸附作用。再將滲透濾膜進(jìn)行封閉處理，以避 免發(fā)生非特異性吸附；封閉處理滲透濾膜使用的處理液一般的主要成分為緩沖體系結(jié)合牛 血清白蛋白、酪蛋白或者動(dòng)物血清等。處理樣品處理墊或者滲透濾膜的緩沖體系選擇0. 02M、pH8. 0的TRIS-HCl緩沖液 與0. 02% TX-100的混合物。封閉滲透濾膜的處理液選擇0. 02M、pH8. 0的TRIS-HCl與0. 5%牛血清白蛋白的
混合物。以下是采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對滲透濾膜的處理方法和使用層數(shù)進(jìn)行選擇，結(jié)果如表 1所示(以LH檢測數(shù)據(jù)為例，目標(biāo)閾值為40到50mIU/ml，其他條件的選擇過程與此類似)表 1
一滲透濾膜的處理方式檢測巧果綜合評定
序號單抗?jié)舛?緩沖體系 表面活性劑~H^iI本底I流動(dòng)
____層數(shù)(mlU/ml)___ __
~1 160""" 0. 02MTRIS無丨2丨90. O —般 3 閾值過高 在閾值合適的四個(gè)條件中，7號成本偏高，12號流速偏慢，不滿足總體要求，2號和 3號條件對比，2號條件在組裝過程中相對簡單，故選擇2號的條件作為滲透濾膜的處理?xiàng)l 件。樣品處理墊的處理方式如下。首先由用水浸泡玻璃纖維膜30分鐘，晾干至少4小 時(shí)，再用處理液浸泡30分鐘，取出纖維膜淋干水分，室溫干燥條件下晾干至少8小時(shí)。滲透濾膜的處理方式如下。將滲透型硝酸纖維素膜用與待測物相關(guān)的處理液按照 固定的濃度比例加到硝酸纖維素膜上，并于干燥間內(nèi)晾干至少8小時(shí)，再將封閉液按照固 定的比例加入到與處理完成的硝酸纖維素膜上，并在室溫干燥條件下晾干至少8小時(shí)，干 燥條件下保存?zhèn)溆谩B透濾膜的處理液或封閉液與硝酸纖維素膜的比例一般為1. OmL處理液或封閉 液對應(yīng)15cm2硝酸纖維素膜。樣品處理單元所使用纖維膜和滲透濾膜的大小為1. OcmX 1. Ocm，樣品處理墊和滲 透濾膜的疊加復(fù)合體的上下緣需要固定卡支撐固定，使得樣品經(jīng)過該處理單元的處理后能 夠流到樣品墊上。將經(jīng)過處理的樣品處理墊和滲透濾膜組裝成樣品處理單元。根據(jù)待檢物的種類、濃度或者其需要被吸附的程度，選擇處理滲透濾膜的生物活 性原料的種類、處理程度，或者選擇樣品處理單元中的樣品處理墊和滲透濾膜的層數(shù)。一般 條件下樣品處理單元內(nèi)的最上層和最下層都需要使用樣品處理墊作為支撐，如果中間需要 加入多層滲透濾膜，則需要在每兩層滲透膜之間加入一層樣品處理墊作為支撐物。以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的一個(gè)檢測促卵泡生成激素(LH)的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的 說明。參見圖1、2和3，檢測試劑盒由吸水濾紙1、反應(yīng)支持物2、硝酸纖維素膜3、結(jié)合物 墊4、樣品墊5、樣品處理單元6、稀釋液孔7和固定卡8組成。包被有檢測條帶T和質(zhì)控條帶C的硝酸纖維素膜3粘貼在反應(yīng)支持物2上，在檢 測線T的方向上硝酸纖維素膜3的邊緣距離反應(yīng)支持物2邊緣23. 0mm，在質(zhì)控線C的方向 上硝酸纖維素膜3的邊緣距離反應(yīng)支持物2的邊緣17. 0mm。在質(zhì)控條帶C的方向上反應(yīng)支持物2上粘貼有吸水濾紙1，長度為18. Omm，壓住硝酸纖維素膜3的邊緣1. 0mm。在檢測線 區(qū)T的方向上反應(yīng)支持物5上首先粘貼6. Omm長的結(jié)合物墊4，壓住硝酸纖維素膜檢測條帶 T方向的邊緣1. Omm ；在此方向上繼續(xù)粘貼樣品墊5，長度為19. 0mm，壓住結(jié)合物墊4的邊緣 1. Omm0吸水濾紙可以防止樣品在硝酸纖維素膜3的一端堆積，從而導(dǎo)致后續(xù)的樣本無法 繼續(xù)前行，進(jìn)而能夠使反應(yīng)充分。檢測線T含有抗LH單克隆抗體，質(zhì)控線C含有羊抗鼠IgG多克隆抗體。所述結(jié)合 物墊4含有膠體金標(biāo)記的抗LH單克隆抗體。參見圖4，樣品處理單元固定在固定卡上，結(jié)構(gòu)依次為玻璃纖維素制成的樣品處理 墊、用LH單抗處理過的一層滲透濾膜(硝酸纖維素制成)、另一層樣品處理墊。
樣品處理墊9用0. 02M pH8. 0的TRIS-HC1與0. 02% TX-100處理，滲透濾膜10用 含LH多抗為0. 5mg/ml的0. 02M pH7. 6磷酸鹽緩沖液按照每ml液體處理15cm2滲透濾膜 的比例處理并晾干8小時(shí)，并用0. 02M、pH8. 0的TRIS-HCl中與0. 5%的牛血清白蛋白封閉 液封閉處理，再晾干。將處理后的樣品處理墊和滲透濾膜裝配成樣品處理單元。在檢測過程中，需要在樣品處理單元內(nèi)用滴管緩慢加入大約三滴(80微升)尿液， 保證樣品能夠緩慢地滲透進(jìn)樣品處理單元中，待硝酸纖維素膜區(qū)出現(xiàn)紅色液流，并且流動(dòng) 至質(zhì)控線區(qū)的時(shí)候開始計(jì)時(shí)，5分鐘內(nèi)查看結(jié)果。如果待檢樣本為排卵高峰期樣本，則在本檢測中檢測條帶T顯色，為陽性，參見圖 5 (如果采用常規(guī)檢測方法，則需要判斷檢測條帶T顯色強(qiáng)度是否超過質(zhì)控條帶C的強(qiáng)度)。如果待檢樣本不是排卵高峰期樣本，則在本檢測中檢測條帶T不顯色，為陰性，參 見圖6 (而采用常規(guī)檢測方法，則判斷檢測條帶T線顯色強(qiáng)度是否弱于質(zhì)控條帶C或者不顯 色的兩種情況)。依照免疫層析法檢測的原理，本產(chǎn)品依然設(shè)置質(zhì)控條帶C作為判斷檢測結(jié)果有效 性的依據(jù)。無論檢測結(jié)果為陽性還是陰性，質(zhì)控條帶C都應(yīng)該顯色，如果質(zhì)控條帶不顯色， 則無論檢測條帶是否顯色，均應(yīng)判為使用結(jié)果無效。這表明可能是試劑盒本身失效或者操 作有誤，需要重新檢測，參見圖7或圖8。以上所述之具體實(shí)施例，意在具體說明本發(fā)明的思路，并不限于以上具體實(shí)施例 所公開的方式。凡基于本發(fā)明之設(shè)計(jì)思路，進(jìn)行簡單推演與替換，都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種檢測試劑盒，包括樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙、反應(yīng)支持物，所述樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙依次連接并均設(shè)置在所述反應(yīng)支持物上，所述結(jié)合物墊含有示蹤物標(biāo)記的生物活性原料A，所述硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測條帶和質(zhì)控條帶，所述檢測條帶設(shè)置于靠近所述結(jié)合物墊的一側(cè)并含有生物活性原料B，所述質(zhì)控條帶設(shè)置于遠(yuǎn)離結(jié)合物墊的一側(cè)并含有生物活性原料C，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括設(shè)置在所述樣品墊上并與所述樣品墊連通的樣品處理單元，所述樣品處理單元包括能夠過濾樣品的樣品處理墊和吸附有生物活性原料D的滲透濾膜，所述生物活性原料D能夠吸附所述樣品中的待測物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物活性原料A、B、C、D是抗 原或抗體，其中，所述生物活性原料A、B、D相似或不同，所述生物活性原料C不同于所述生 物活性原料A、B、D。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括固定卡，所 述樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙、反應(yīng)支持物、樣品處理單元通過所述固定卡 固定連接在一起。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括固定在所 述固定卡中的稀釋液孔，所述稀釋液孔與所述樣品墊連通、設(shè)置在所述樣品處理單元的遠(yuǎn) 離所述結(jié)合物墊的一側(cè)并且與所述樣品處理單元連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述樣品處理墊由纖維素制成，所 述滲透濾膜由硝酸纖維素或醋酸纖維素制成。
6.一種應(yīng)用權(quán)利要求1-5所述檢測試劑盒的生物制品檢測方法，其特征在于，包括以 下步驟(1)樣品通過所述樣品處理單元，樣品中的部分待測物與所述生物活性原料D反應(yīng)并 停留在所述滲透濾膜上；(2)樣品經(jīng)過所述樣品墊后移動(dòng)至所述結(jié)合物墊，未與生物活性原料D反應(yīng)的待測物 與所述示蹤物標(biāo)記的生物活性原料A結(jié)合，形成復(fù)合物；(3)所述復(fù)合物在經(jīng)過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對于所述復(fù)合物不足量的 生物活性原料B和生物活性原料C特異性結(jié)合；(4)如果所述檢測條帶出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明所述待測物含量在檢測限度以上，為 陽性，如果所述檢測條帶未出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明所述待測物含量在檢測限度以下，為 陰性；(5)如果所述質(zhì)控條帶出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明步驟(4)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，如果所述 質(zhì)控條帶未出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表明所述示蹤物失效或者實(shí)驗(yàn)操作有誤，步驟(4)的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果無效。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，在所述步驟(1)中，如果所述待測物 在所述樣品中的濃度或閾值偏高，則在樣品進(jìn)入所述樣品處理單元后，通過所述稀釋液孔 加入稀釋液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，根據(jù)所述樣品中待測物的性質(zhì)相應(yīng) 地選擇滲透濾膜的厚度、層數(shù)以及處理所述滲透濾膜的參數(shù)，所述參數(shù)包括生物活性原料 的種類及濃度、封閉方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述選擇的方法為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測試劑盒，包括樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙、反應(yīng)支持物，所述樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙依次連接并均設(shè)置在所述反應(yīng)支持物上，所述結(jié)合物墊含有示蹤物標(biāo)記的生物活性原料A，所述硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測條帶和質(zhì)控條帶，所述檢測條帶設(shè)置于靠近所述結(jié)合物墊的一側(cè)并含有生物活性原料B，所述質(zhì)控條帶設(shè)置于遠(yuǎn)離結(jié)合物墊的一側(cè)并含有生物活性原料C，所述檢測試劑盒還包括設(shè)置在所述樣品墊上并與所述樣品墊連通的樣品處理單元，所述樣品處理單元包括能夠過濾樣品的樣品處理墊和吸附有生物活性原料D的滲透濾膜，所述生物活性原料D能夠吸附所述樣品中的待測物。本發(fā)明使得樣品的待測物濃度通過樣品處理單元的處理后降低一個(gè)水平，通過控制該水平的具體值，可以通過判斷是否顯色達(dá)到更敏感地待測物濃度是否在某個(gè)水平之上。
文檔編號G01N33/544GK101871939SQ201010222339
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者江兵澤, 顧子易 申請人:北京易斯威特生物醫(yī)學(xué)科技有限公司;顧子易;江兵澤