專利名稱：一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)有機(jī) 磷農(nóng)藥毒死蜱的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。
背景技術(shù)：
毒死蜱(chlorpyrifos)，0，0_ 二乙基-0-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯。 1965年由Dow Chemical Company推廣使用的一種高效殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)應(yīng)用于糧食、 蔬菜、水果及經(jīng)濟(jì)作物的害蟲防治，是目前替代高毒有機(jī)磷殺蟲劑的主要品種之一，也是安 全農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留監(jiān)控的重要品種，在糧食等作物上引起的殘留問(wèn)題已有所報(bào)道。而且，環(huán) 境樣品中發(fā)現(xiàn)毒死蜱殘留的情況也日趨嚴(yán)重，對(duì)人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。毒死蜱在 我國(guó)蔬菜殘留量的限量標(biāo)準(zhǔn)是lmg/kg，而日本制定毒死蜱的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將從我國(guó)進(jìn) 口量較大的菠菜中的毒死蜱殘留量定為0. Olmg/kg,歐洲的標(biāo)準(zhǔn)也達(dá)到0. 05mg/kg。這些都 對(duì)我國(guó)出口食品、農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生了不利的影響。隨著人們對(duì)毒死蜱殘留的毒性與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的 日益關(guān)注，急需更科學(xué)、快捷和高效的檢測(cè)手段。因此開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速，適于農(nóng)藥殘留現(xiàn) 場(chǎng)監(jiān)控的痕量分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)農(nóng)藥殘留的常規(guī)檢測(cè)方法主要是理化分析方法，即通常講的利用儀 器如氣相色譜儀、液相色譜儀、氣-質(zhì)聯(lián)用儀、液-質(zhì)聯(lián)用儀等進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的分析檢測(cè) 方法。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是可以定性、定量的檢測(cè)農(nóng)藥殘留量，也是國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方 法。但這些方法需要對(duì)樣品進(jìn)行萃取分離等復(fù)雜預(yù)處理過(guò)程，需要大量的人力物力，檢測(cè)時(shí) 間長(zhǎng)且儀器價(jià)格昂貴，需要專業(yè)技術(shù)人員維護(hù)，檢測(cè)成本高，不適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，不能滿足種 類繁多的農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)需求。因此，迫切需要開發(fā)和應(yīng)用高效率快速分析新技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CLIA)是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用 于生物工程，醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)中，但應(yīng)用于農(nóng)獸藥的研究國(guó)內(nèi)外比較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥毒 死蜱的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明合成了毒死蜱的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)，而且對(duì)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，毒 死蜱標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和待測(cè)抗原濃度成正比，可以得出化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和待測(cè)毒死蜱 濃度之間的線性關(guān)系。一個(gè)大分子可以標(biāo)記多個(gè)小分子標(biāo)記物，這樣可以放大響應(yīng)信號(hào)。首先將毒死蜱 的分子結(jié)構(gòu)做了微小的改變，在毒死蜱結(jié)構(gòu)中引入活性基團(tuán)羧基(-C00H)，然后以牛血清白 蛋白(BSA)為載體，將化學(xué)發(fā)光劑魯米諾通過(guò)重氮鹽法標(biāo)記到牛血清白蛋白(BSA)上，合成 魯米諾-牛血清白蛋白復(fù)合物，再將活化后的毒死蜱偶聯(lián)到魯米諾-牛血清白蛋白復(fù)合物 上，從而合成毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，將標(biāo)記后的毒死蜱和未標(biāo)記的毒死蜱與定量的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對(duì)未知抗原進(jìn)行定量測(cè)定。具體而言，本發(fā)明包括下列步驟①將有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱活化，引入活性基團(tuán)羧基(-C00H)，得到活化后的毒死蜱 (AR)；
②將化學(xué)發(fā)光劑魯米諾(Lu)標(biāo)記到牛血清白蛋白(BSA)，得到魯米諾-牛血清白 蛋白(Lu-BSA)，偶聯(lián)比要求達(dá)到1 20 1 40;③將活化后的毒死蜱(AR)標(biāo)記到魯米諾-牛血清白蛋白(Lu-BSA)上，得到毒死 蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)；④繪制毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、以相對(duì)發(fā)光強(qiáng) 度為縱坐標(biāo)作圖；⑤建立均相免疫直接競(jìng)爭(zhēng)法，確定發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品抗原濃度之間的線性關(guān) 系。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、操作簡(jiǎn)單、快速，成本低；2、首次提出了以牛血清白蛋白為載體，一個(gè)大分子可以標(biāo)記多個(gè)小分子標(biāo)記物， 這樣可以放大響應(yīng)信號(hào)，增加了體系的靈敏度；3、適用于對(duì)毒死蜱化學(xué)發(fā)光免疫現(xiàn)場(chǎng)快速定性和定量的分析檢測(cè)。


圖1是毒死蜱的活化路線圖；圖2是活化后的毒死蜱紅外掃描光譜 圖3是魯米諾-牛血清白蛋白(Lu-BSA)合成路線圖；圖4是毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)合成路線圖；圖5是毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)紫外掃描光譜圖；圖6是毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)熒光發(fā)射光譜圖；圖7是毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線圖；圖8是毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)發(fā)光特征圖；圖9是檢測(cè)樣品毒死蜱的工作曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明一、有關(guān)步驟1、關(guān)于步驟①投料比毒死蜱3-巰基丙酸NaOH =1:1:2;反應(yīng)溫度65°C ；磁力攪拌反應(yīng)時(shí)間2h。2、關(guān)于步驟②反應(yīng)溫度0 4°C。3、關(guān)于步驟③
選擇最佳偶聯(lián)方法為碳二亞胺法。4、關(guān)于步驟⑤固定毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物稀釋比1/50，抗毒死蜱抗體稀釋倍數(shù)為1500倍，反應(yīng) 溫度在37°C下免疫lh，反應(yīng)后的混合溶液中加入100 μ 1 0. 5mol/L的H202。二、實(shí)驗(yàn)例
1、實(shí)驗(yàn)例1毒死蜱的活化如圖1，以毒死蜱原藥和3-巰基丙酸為起始原料，通過(guò)親核取代反應(yīng)，合成了 0， 0-二乙基-0-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯(AR)，從而引入活 性基團(tuán)羧基(-C00H)。將3-巰基丙酸溶于無(wú)水乙醇后加入三口平底燒瓶，然后加入NaOH，再加入溶于 無(wú)水乙醇的的毒死蜱原藥，60°C下回流反應(yīng)池，過(guò)濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮蒸干。然后用 NaHCO3溶液將殘留物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，正已烷萃取2次，棄去有機(jī)相。然后用鹽酸調(diào)水相 PH至3左右，二氯甲烷萃取3次，有機(jī)相過(guò)無(wú)水MgSO4,減壓濃縮近干，得淡黃色油狀物，柱 層析過(guò)硅膠柱，收集洗脫液(正己烷/乙酸乙醑，1 2)的流動(dòng)相，減壓濃縮蒸干。加入少 量無(wú)水乙醇溶解產(chǎn)物，重結(jié)晶后得到淺黃色晶體。檢驗(yàn)結(jié)果該晶體用熔點(diǎn)儀測(cè)得m. p.為121 123 °C，經(jīng)計(jì)算該反應(yīng)產(chǎn)率為 49.8%，由其紅外掃描光譜可知成功的引入了羧基(-C00H)基團(tuán)，如圖2。2、實(shí)驗(yàn)例2魯米諾-牛血清白蛋白(Lu-BSA)合成如圖3，將50mg魯米諾，加入5. 0mL3. Omo 1/L的HCl中，在0 4°C于磁力攪拌器上 攪拌，直至溶解。在0 4°C酸性魯米諾溶液中，加入50mg的NaNO2固體，避光反應(yīng)15min，反 應(yīng)完畢時(shí)使混合液對(duì)剛果紅試紙呈藍(lán)色，對(duì)碘化鉀淀粉試紙顯藍(lán)色，然后用0. 50ml/L pH為 8. 5的硼砂緩沖液調(diào)節(jié)混合液，使其pH為8. 5左右。然后加入一定量的含BSA的0. IOmoI/ L PBS緩沖液，在0 4°C條件下避光反應(yīng)Mh。于避光處，用硼砂緩沖溶液通過(guò)靜態(tài)梯度透 析法對(duì)反應(yīng)混合液進(jìn)行透析，透析膜的截割分子量為(8000 12000)。每隔Ia1取透析液， 通過(guò)熒光光譜掃描，微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x檢測(cè)透析液的魯米諾(Lu)的含量，透析至透析液中檢 測(cè)不出魯米諾，可得到魯米諾標(biāo)記牛血清白蛋白(Lu-BSA)的復(fù)合物溶液。檢驗(yàn)結(jié)果魯米諾標(biāo)記的牛血清白蛋白具有良好的發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，從紫外光譜 圖可知標(biāo)記成功，計(jì)算其偶聯(lián)比為1 25。3、實(shí)驗(yàn)例3毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)合成如圖4，稱取活化后的毒死蜱(AR)溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羥 基琥珀酰亞胺，于磁力攪拌器上攪拌lh，然后加入1-乙基-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽 酸鹽，繼續(xù)攪拌反應(yīng)池。取一定量的已合成的Lu-BSA溶液加入上述混合液，于避光處常溫 下磁力攪拌反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物，用磷酸鹽緩沖液透析，每隔1 取透析液，用 紫外分光光度法檢測(cè)透析液中活化后的毒死蜱(AR)的含量，透析止透析液中檢測(cè)不出AR， 可得到魯米諾-BSA-毒死蜱復(fù)合物(Lu-BSA-AR)溶液。將毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物用磷酸酸 鹽緩沖液配成一定濃度的溶液，進(jìn)行紫外光譜和熒光光譜掃描。4、實(shí)驗(yàn)例4毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)紫外掃描如圖5，采用紫外分光光度計(jì)在200-400nm下分別對(duì)毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物 (Lu-BSA-AR)、活化后的毒死蜱(AR)、牛血清白蛋白(BSA)，魯米諾(Lu)進(jìn)行掃描測(cè)定。結(jié)果表明，毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別在^4nm、282nm、3Mnm處出現(xiàn)最大吸收峰，與改造后 的毒死蜱、BSA、魯米諾分別在^0nm、280nm和348nm處出現(xiàn)最大吸收峰相比，發(fā)生了明顯的 變化，表明成功地合成了毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)。5、實(shí)驗(yàn)例5毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)熒光掃描光譜如圖6，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)魯米諾(Lu)、魯米諾標(biāo)記牛血清白蛋白 (Lu-BSA)、毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)進(jìn)行熒光光譜發(fā)射掃描測(cè)定，結(jié)果表明，魯 米諾(Lu)、魯米諾標(biāo)記牛血清白蛋白(Lu-BSA)、毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)熒光 發(fā)射光譜的峰值分別出現(xiàn)在430nm、435nm、436nm處。Lu-BSA、Lu-BSA-AR與Lu相比熒光發(fā) 射光譜的峰值發(fā)生了明顯的變化，而Lu-BSA和Lu-BSA-AR相比，熒光發(fā)射光譜的峰值變化 不大，而且其發(fā)光強(qiáng)度沒有受到影響，表明合成的毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)具 有良好的熒光特征。6、實(shí)驗(yàn)例6毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)發(fā)光特征如圖8，分別取一定量的Lu、Lu-BSA、Lu-BSA-AR和空白溶液于紫外分析下，觀察其 特征發(fā)光現(xiàn)象，結(jié)果表明具有良好的發(fā)光特征。7、實(shí)施例7毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(Lu-BSA-AR)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線的繪制如圖7，分別取一定量的Lu、Lu-BSA, Lu-BSA-AR溶液，用pH 9. 6的碳酸鹽緩沖溶 液定容到10ml，然后分別取100 μ L溶液加入到測(cè)量杯中，原位注入0. 2mol/L的H2A溶液， 于BPCL微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x上檢測(cè)，記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，作出得Lu、Lu-BSA, Lu-BSA-AR發(fā)光動(dòng) 力學(xué)曲線。結(jié)果表明Lu-BSA-AR和Lu-BSA與Lu相比發(fā)光強(qiáng)度有所下降，而Lu-BSA-AR和 Lu-BSA得發(fā)光強(qiáng)度相近，雖然Lu-BSA-AR的發(fā)光強(qiáng)度較Lu有所降低，但Lu-BSA-AR仍然表 現(xiàn)出了良好的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)特性。8、實(shí)驗(yàn)例8工作曲線的制備如圖9，固定毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和抗毒死蜱抗體的量，加入待測(cè)的毒死蜱半抗 原。毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和待測(cè)的毒死蜱與一定量的抗毒死蜱抗體發(fā)生免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)， 在37°C下免疫反應(yīng)lh，對(duì)免疫反應(yīng)后的混合溶液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定。當(dāng)固定毒死蜱化學(xué)發(fā) 光標(biāo)記物稀釋比為1/50，抗毒死蜱抗體稀釋倍數(shù)為1500倍時(shí)，加入一定量待測(cè)的毒死蜱溶 液，在37°C下免疫反應(yīng)lh。反應(yīng)后的混合溶液中加入100 μ 1 0. 5mol/L的H2O2，進(jìn)行化學(xué) 發(fā)光鍘定。根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的增加值對(duì)毒死蜱進(jìn)行定量測(cè)定。毒死蜱的濃度與化學(xué)發(fā)光 信號(hào)在18. 9ng/mL 108ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。方法檢測(cè)限為1. 27ng/mL。對(duì) 30ng/mLmL的毒死蜱進(jìn)行7次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5. 1%。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于包括下列步驟①將有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱活化，引入活性基團(tuán)羧基，得到活化后的毒死蜱；②將化學(xué)發(fā)光劑魯米諾標(biāo)記到牛血清白蛋白，得到魯米諾-牛血清白蛋白，偶聯(lián)比要 求達(dá)到1 15 1 40 ；③將活化后的毒死蜱標(biāo)記到魯米諾_牛血清白蛋白上，得到毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物；④繪制毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為縱 坐標(biāo)作圖；⑤建立均相化學(xué)發(fā)光免疫直接競(jìng)爭(zhēng)法，確定發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品抗原濃度之間的線性 關(guān)系。
2.按權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征其特征在于步驟① 投料比毒死蜱3-巰基丙酸NaOH =1:1:2;反應(yīng)溫度65°C ； 反應(yīng)時(shí)間磁力攪拌反應(yīng)2h。
3.按權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征其特征在于步驟② 反應(yīng)溫度0 4°C。
4.按權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征其特征在于步驟③ 選擇最佳偶聯(lián)方法為碳二亞胺法。
5.按權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征其特征在于步驟⑤固定毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物稀釋比1/50，抗毒死蜱抗體稀釋倍數(shù)為1500倍，反應(yīng)溫度 在37°C下免疫lh，反應(yīng)后的混合溶液中加入100 μ 1 0. 5mol/L的H202。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，屬于農(nóng)藥殘留分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是①將有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱活化，引入活性基團(tuán)羧基，得到活化后的毒死蜱；②將化學(xué)發(fā)光劑魯米諾標(biāo)記到牛血清白蛋白，得到魯米諾-牛血清白蛋白，偶聯(lián)比要求達(dá)到1∶20～1∶40；③將活化后的毒死蜱標(biāo)記到魯米諾-牛血清白蛋白上，得到毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物；④繪制毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，分別以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖；⑤建立均相化學(xué)發(fā)光免疫直接競(jìng)爭(zhēng)法，確定發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品抗原濃度之間的線性關(guān)系。本發(fā)明適用于對(duì)毒死蜱現(xiàn)場(chǎng)快速定性和定量的分析檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/566GK102053155SQ20101022136
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者劉曉宇, 劉榮飛, 姚鑫, 孟思, 王國(guó)磊, 石旺榮, 趙冬冬 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)