專利名稱：生物聚合物快速染色法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種操作簡便、耗時較少的生物聚合物快速染色法。
背景技術(shù)：
利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。在確定的 條件下，帶電粒子在單位電場強度作用下，單位時間內(nèi)移動的距離(即遷移率)為常數(shù)。不 同帶電粒子因所帶電荷不同，或雖所帶電荷相同但荷質(zhì)比不同，在同一電場中電泳，經(jīng)一定 時間后，由于移動距離不同而相互分離。分開的距離與外加電場的電壓與電泳時間成正比。 1937年瑞典學(xué)者A. W. K.蒂塞利烏斯設(shè)計制造了移動界面電泳儀，分離了馬血清白蛋白的3 種球蛋白，創(chuàng)建了電泳技術(shù)。本世紀(jì)40年代末到50年代初相繼發(fā)展利用支持物進(jìn)行的電 泳，如濾紙電泳，醋酸纖維素膜電泳、瓊脂電泳；50年代末又出現(xiàn)淀粉凝膠電泳和聚丙烯酰 胺凝膠電泳等。目前，電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物化學(xué)、臨床化學(xué)、藥理學(xué)、免疫 學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)等科學(xué)中。生物聚合物如肽、蛋白質(zhì)、核酸、寡糖、或者其混合物通過凝膠電泳分析，通常目的 樣品被裝載在一個介質(zhì)中，如聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)分子大小、電荷、和其他物理性質(zhì)的差 異，在電場中遷移得到不同的帶，電泳后條帶是通過生物聚合物與染色試劑結(jié)合后被檢測。 大量染色方法和試劑被開發(fā)出來用于染色出如凝膠這樣的介質(zhì)中的生物聚合物，這些試劑 可以分為四種第一種染色試劑包括結(jié)合到聚合物上的有機(jī)染料，如考馬斯亮藍(lán)染色試劑， 使蛋白帶變成藍(lán)色從而可通過肉眼被觀察到；第二種染色試劑包括結(jié)合到聚合物上的熒光 染料，如EB結(jié)合DNA或RNA，當(dāng)紫外線照射時，使DNA或RNA呈紅色；第三種染色試劑包括 銀染試劑；第四種是染色背景的試劑，即被稱為負(fù)染。第二種和第三種染色試劑的靈敏度已 經(jīng)達(dá)到或者超過第一種的傳統(tǒng)染色試劑。Fazekas早在1960年發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色蛋白的方法在當(dāng)今仍然被廣泛使用 (Biochim. Biophys. Acta 71 :377，1963年)。除考馬斯亮藍(lán)，其他有機(jī)染料，如氨基黑、麗春 紅、固綠FCF、鋅試劑、鉻黑等已被用于染色蛋白質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)相對便宜，比 銀染需要更少的時間，但仍然需要幾個小時甚至過夜。通常情況下，傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)染色凝膠電泳結(jié)果包括以下步驟(一)溫柔振蕩 固定1小時；(二)將固定好的凝膠在溫和振蕩的條件下染色一小時；(三)將染色之后的 凝膠在脫色液中脫色數(shù)次，直到膠沒有背景并且條帶清晰時為止，這通常需要2至3小時， 甚至過夜。常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色，如上所述，約需四小時或以上，其中至少有3個步驟。由于 傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)染色消耗寶貴的時間，需要有一個簡單而快速的方法來解決這個問題。自從Fazekas引入可視蛋白凝膠的方法，考馬斯亮藍(lán)染色成為最常用的一般蛋白 質(zhì)檢測方法。盡管考馬斯亮藍(lán)蛋白染色的方法有改善，包括采用新的染色試劑如膠體考馬斯亮藍(lán)，基本方法大致維持不變。染色方法由傳統(tǒng)的演變?yōu)槲⒉訜?，從而減少了染色時間，這 三個基本步驟仍必須完成才能獲得令人滿意的結(jié)果。目前，尚未有利用電泳技術(shù)使未結(jié)合的染料與生物材料分離而使已結(jié)合染料的生 物材料顯色從而節(jié)省時間的方法報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡便、無需使 用脫色液脫色、耗時較少的生物材料快速染色法。本發(fā)明還提供了用于上述染色方法的試劑盒。本發(fā)明主要是利用生物聚合物與染料在施加電場的介質(zhì)中的遷移率不同，使染料 從介質(zhì)中移出而生物聚合物保留在介質(zhì)中，從而使結(jié)合染料的生物聚合物顯色。由于生物 聚合物分子較大，在電場中移動緩慢，在限定的時間內(nèi)不會從介質(zhì)中移出，有機(jī)染料分子相 對生物聚合物分子來的小得多，未與生物聚合物分子結(jié)合的染料分子可迅速從介質(zhì)中移 出，從而在短時間內(nèi)得到高分辨率、背景影響小甚至無背景的生物聚合物的分析圖像。對介 質(zhì)中已分離未染色的生物聚合物，染料在電場的作用下快速定向移動，能在較短的時間下 與生物聚合物分子結(jié)合進(jìn)行染色。染料與生物聚合物的電荷性質(zhì)可以相同或相反，在電場作用下，染料遷移方向與 生物聚合物的遷移方向可以相同或相反，只要保證染料能與生物聚合物相遇則可進(jìn)行染 色。對已染色的生物聚合物與未結(jié)合的染料的分離則無需保障二者的接觸時間。由于染料需要遷移出介質(zhì)而生物聚合物需保留在介質(zhì)中，故染料的遷移率應(yīng)大于 生物聚合物的遷移率。介質(zhì)應(yīng)保障遷移速度最快的生物聚合物沿遷移方向保留足夠的長度 不至于在適當(dāng)?shù)碾妷汉蜁r間作用下跑出介質(zhì)。本發(fā)明的目的可以通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn)一種生物聚合物染色法，包括染料與待染色的生物聚合物結(jié)合、未結(jié)合的染料與 已結(jié)合染料的生物聚合物的分離、已結(jié)合染料的生物聚合物顯像，具體地說a.染料與生物聚合物結(jié)合將染料與待染色的生物聚合物直接混合進(jìn)行染色，或 者將待染色的生物聚合物與含有染料的載體接觸，或者將染料與待染色的生物聚合物在施 加或不施加電場的介質(zhì)中保持接觸，使染料與待染色的生物聚合物結(jié)合而進(jìn)行染色；b.未結(jié)合的染料與已結(jié)合染料的生物聚合物的分離將染料與待染或已染生物 聚合物置于施加電場的介質(zhì)中，使未與生物聚合物結(jié)合的染料從介質(zhì)中完全移出或部分移 出而生物聚合物留在介質(zhì)中；c.已結(jié)合染料的生物聚合物顯像保留在介質(zhì)中的已結(jié)合染料的生物聚合物采 用可見光下顯像或采用非可見光成像技術(shù)顯像；其中，在施加電場的介質(zhì)中，結(jié)合或未結(jié)合染料的生物聚合物的遷移率小于染料 的遷移率。所述的染色法，其中染料與生物聚合物在介質(zhì)中的遷移方向相同或不相同。所述的染色法，其中步驟a與b中的介質(zhì)為同一介質(zhì)或不同介質(zhì)(如進(jìn)行轉(zhuǎn)印處 理)；當(dāng)存在多個生物聚合物時，當(dāng)存在多個生物聚合物時，步驟b中施加的電場使生物聚 合物在介質(zhì)中遷移的方向與步驟a中施加的電場使生物聚合物在介質(zhì)中遷移的方向不相
5反，以防止經(jīng)步驟a已電泳分離的生物聚合物又經(jīng)過步驟b中電場作用使其發(fā)生反向遷移， 造成混淆，影響分離效果。所述的染色法，其中步驟b使未與生物聚合物結(jié)合的染料從介質(zhì)中完全移出或部 分移出而生物聚合物留在介質(zhì)中的方法可以通過控制遷移時間、與遷移方向平行的介質(zhì)長 度、遷移率(特別是染料與生物聚合物遷移率的比例關(guān)系)、生物聚合物起始遷移位置等因 素來實現(xiàn)。為得到較短的全程時間，相應(yīng)的影響因素如何控制可以結(jié)合實際情形進(jìn)行優(yōu)選， 比如若生物聚合物與染料的電荷種類相同，二者在進(jìn)行染色后可以以介質(zhì)的同一端為起 點進(jìn)行分離，介質(zhì)沿生物聚合物移動方向上保留足夠的長度以滿足生物聚合物不跑出介質(zhì) 而染料跑出介質(zhì)；如果生物聚合物事先沒有染色，則需保證生物聚合物位于染料移動路徑 上以保證二者能夠接觸并染色；另外，PH、電離強度、電壓、介質(zhì)種類等影響遷移率的因素也 會影響時間和顯色效果。舉例說明如下遷移率未結(jié)合的生物材料的遷移率為ml，未結(jié)合的染料的遷移率為m2，結(jié)合染 料后的生物材料的遷移率為m3。(遷移率可在特定條件固定的情況下通過儀器測出，或者 根據(jù)電壓、分子量、電荷性質(zhì)與大小、介質(zhì)PH等因素推算出染料與生物材料遷移率的比例 范圍，如果這個倍數(shù)很大，某些影響因素可以忽略不計)介質(zhì)長度為L，未結(jié)合的染料的起始位置距介質(zhì)邊緣短距離為X，未結(jié)合生物材料 的起始位置距介質(zhì)邊緣短距離為Y，當(dāng)它們均從介質(zhì)邊緣開始遷移時X，Y為0。未結(jié)合前的電泳時間tl，結(jié)合后染料移出介質(zhì)的電泳時間t2。同時的時間內(nèi)，結(jié)合后生物材料不能跑出介質(zhì)外，未結(jié)合的染料應(yīng)跑出介質(zhì)外。結(jié)合時染料遷移距離d2 = m2*tl，結(jié)合時未結(jié)合的生物材料遷移距離dl = ml*tl。則如下面幾種類型1、電泳分離前未結(jié)合，染料與生物材料遷移方向相反(圖6)m3*t2 < d2+x, m2*t2 > dl+y(即結(jié)合后同樣時間內(nèi)染料移出而結(jié)合的生物材料 不移出)L = x+d2+dl+y = x+m2 氺 tl+ml 氺 tl+y2、電泳分離前未結(jié)合，染料與生物材料遷移方向相同(圖7)m3*t2 < L-(dl+y)或 m3*t2 < L_(d2+x)m2*t2 > L-(dl+y)或 m2*t2 > L_(d2+x)L = x+m2*tl+m2*t2 = y+ml*tl+m2*t23、對電泳前已結(jié)合的生物材料與染料分離t為染料移出介質(zhì)的電泳時間 m3*t < m2*t (相同方向)，或 m3*t < (L_m2*t)(相反方向)其他一些類型也可以通過上述分析確定相關(guān)影響因素，選擇介質(zhì)、染料種類，調(diào)節(jié) 影響遷移率的因素以滿足較短的時間內(nèi)得到較好的分離效果。所述的染色法，其中步驟b未與生物聚合物結(jié)合的染料從介質(zhì)中部分移出的程度 使留在介質(zhì)中的未結(jié)合染料造成的背景色與結(jié)合染料的生物聚合物的顯色能夠區(qū)分出來。
所述的染色法，其中非可見光成像技術(shù)為熒光顯像、紅外顯像、紫外顯像、放射顯 像、數(shù)字成像技術(shù)。所述的染色法，其中染料為有機(jī)染料、無機(jī)染料、熒光染料、復(fù)合型染料中的一種 或多種，包括染料標(biāo)記試劑，如放射性標(biāo)記試劑等；生物聚合物為多肽、蛋白、RNA、DNA、低聚 糖中的一種或多種；介質(zhì)為濾紙、醋酸纖維素膜、瓊脂、凝膠中的一種。所述的染色法，其中有機(jī)染料為考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue)、氨基 黑(Amido black)，麗春紅(PonceauS)，固綠 FCF (Fast green FCF)，鋅試劑(zincon)，鉻黑 (chrome black)中的一種或多種；無機(jī)染料為銅離子、亞鐵離子以及其他重金屬離子中的 一種或多種；熒光染料為溴化乙啶、丫啶類染料、花菁染料中的一種或多種；復(fù)合型染料為 無機(jī)染料與有機(jī)染料復(fù)合物、熒光染料和有機(jī)染料的復(fù)合物、熒光染料和無機(jī)染料的復(fù)合 物等中的一種或多種；凝膠為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種。所述的染色法，其中包括下列步驟在正極板上放置浸濕溶液C的載體，將介質(zhì)放 在浸濕溶液C的載體之上，將浸濕溶液B的載體放在介質(zhì)之上，將浸濕溶液A的載體在浸濕 溶液B的載體之上，負(fù)極在這個三明治結(jié)構(gòu)的最上方；兩電極板之間施加適當(dāng)?shù)碾妷?；其中，溶液A為含異丙醇、乙醇、EDTA中一種或多種的水溶液，溶液B為含考馬斯 亮藍(lán)(考馬斯亮藍(lán)R-250或G-250)、異丙醇、Tris、EDTA (乙二胺四乙酸)、乙酸中一種或多 種的水溶液，溶液C為pH 2. O 11的磷酸緩沖液或者類似的緩沖液，介質(zhì)為濾紙、醋酸纖 維素膜、瓊脂、凝膠，載體為普通濾紙、轉(zhuǎn)印濾紙或海綿。進(jìn)一步，溶液A為含10 50%異丙醇、5 35%乙醇、1 30mmol/L EDTA的水溶 液，溶液B為0. 05 0. 5%考馬斯亮藍(lán)，20 60%乙醇，1 30mmol/L EDTA, 2 30%乙酸 的水溶液，溶液C為pH 6. 8的磷酸鹽緩沖液。一種染色試劑盒，該試劑盒含有正負(fù)電極、試劑A、試劑B、試劑C;或者還含有介質(zhì) 和/或用于浸漬試劑的載體。試劑盒中的材料可以分開包裝。試劑A為異丙醇、乙醇、EDTA 中一種或多種，試劑B含考馬斯亮藍(lán)(考馬斯亮藍(lán)R-250或G-250)、異丙醇、Tris、EDTA (乙 二胺四乙酸)、乙酸中一種或多種，試劑C為配制磷酸緩沖液或者類似的緩沖液的試劑。所述的染色試劑盒，該試劑盒的結(jié)構(gòu)為在正電極與負(fù)電極之間依次浸漬試劑C的 載體、介質(zhì)、浸漬試劑B的載體、浸漬試劑A的載體；其中介質(zhì)可以是已含有待染色的生物聚 合物的介質(zhì)。溶液B是含有負(fù)電荷的染料，溶液C是含有正負(fù)電荷的染料。兩電極板之間 的電壓可以調(diào)節(jié)，電壓范圍在不大于500伏特。本發(fā)明提供了用于包括蛋白質(zhì)染色分析的一種或者多種組成部分的試劑盒，在另 一個方面，該試劑盒包含了一個可以承載染料的部件以及一個或者多個用于蛋白質(zhì)染色分 析的部件，更進(jìn)一步的說，這個試劑盒包含了可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)染色脫色的整個過程。進(jìn)一步，本發(fā)明是提供一種改進(jìn)的快速檢測蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色方法，將傳統(tǒng) 的蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)的蛋白染色步驟(一)至(三)合并為一步。因此，這一方法將3 步減少為1步，所有的染色過程在正負(fù)兩電極板之間完成。電場力驅(qū)動染料分子通過凝膠 和蛋白質(zhì)相互作用，從而使凝膠中的蛋白質(zhì)被染色。染色時的電壓可以調(diào)整染料移動的速 度。因此，染色時間可降低至不到10分鐘。電泳后的承載生物聚合體的介質(zhì)與承載不同緩沖液的濾紙組成的如圖5所示的 三明治結(jié)構(gòu)置于電極之間，再施加一個電場，在保證生物聚合物的相對位置不會移動的前提下，施加電場的方向與電泳電場的方向可以成一定的角度。由于電場對生物聚合物還有 染料分子都發(fā)生作用，不過生物聚合物移動的速度與染料分子移動的速度相比，速度慢很 多倍，在比較短的時間內(nèi)(IOmin之內(nèi))，生物聚合物移動距離很短，相對于染料分子來說可 以忽略不計。即使時間略長，生物聚合物移動一定距離，只要生物聚合物不跑出介質(zhì)，而染 料分子早已跑出介質(zhì)，也能很好地將生物聚合物顯現(xiàn)出來。除非特別的申明，這里涉及到的所有技術(shù)上和學(xué)術(shù)上的術(shù)語和屬于這個發(fā)明的技 術(shù)的文章中的術(shù)語通常被理解為相同的意思。正如本文中所使用的“染色試劑”和“生物聚合物”應(yīng)屬于最廣泛的范圍。一個“染 色試劑”可以是任何顏色或無色的物質(zhì)。舉例來說，染色試劑，包括但不限于有機(jī)染料，無 機(jī)染料，熒光染料，金屬復(fù)合染料，放射性或放射性標(biāo)記分子，或無色物質(zhì)，改變顏色或成為 熒光結(jié)合后的生物聚合物?！吧锞酆衔铩卑ǖ幌抻诙嚯模鞍踪|(zhì)，RNA, DNA,低聚糖，一 種RNA的聚合物，或者一種DNA多肽聚合物等，或者這些物質(zhì)中二種或多種的混合物。染色試劑可以是一個單一的形式，或者也可以存在于混合物或溶液中。染色試劑 可以以修改形式(例如，化學(xué)改性)或不加修改的形式。本發(fā)明提供了蛋白染色必須的成分。其中一個成分是本文提及作為染色的溶液。 染色液包括考馬斯亮藍(lán)，異丙醇，Tris，EDTA和乙酸。所有這些因素可能會被文獻(xiàn)報道中相 類似的試劑取代，但是其功能實質(zhì)上是一樣的。例如異丙醇可以被甲醇或乙醇或者其他文 獻(xiàn)報道中比較類似的試劑代替?？捡R斯亮藍(lán)可由其他蛋白染色的染料取代，如氨基黑，麗春 紅，固綠FCF，鋅試劑，鉻黑等。染色液包括約0. 1克到5克每公升的考馬斯亮藍(lán)(R-250或 G-250)，但通常是約1克。染色液包括約10克至500克每升的異丙醇，但通常是大約200 克。乙酸量為一公升染色液由大約10克到300克，一般約150克。EDTA在每升染色液中 包含約0. 1克到10克左右，通常約1克。Tris在一公升染色液包含約0. 1克到10克左右， 通常約1克。對于染色的溶液，可在PH值的范圍約2. 0-11. 0左右，但通常是在5. 0。在以上的描述中，除了文章中提到的染料，其他的染色液可以被用于這個發(fā)明。一 個或一個以上的染色液成分可以省略，同樣一個或一個以上的試劑可以添加到染料之中。 變更染料的目的是提高染色效率，從而使固定，染色和脫色合并成一個步驟?？梢栽O(shè)想，其 他的染料提供類似的功能，正如染料能夠得到發(fā)展。在以上的描述中，文章中指出，其他染色試劑也可以用來染色的蛋白質(zhì)，除了在這 個發(fā)明中提到的染色試劑(考馬斯亮藍(lán)，R-250或G-250)，這些染色試劑包括，但不僅限于， 氨基黑，麗春紅S，固綠FCF，鋅試劑，鉻黑等等。在以上的描述中，文章中指出，熒光染色試劑也可以用來染色的蛋白質(zhì)，除了在這 個發(fā)明中提到的染色試劑(考馬斯亮藍(lán)R-250或G-250)，這些染色試劑包括但不僅限于羅 丹明(rhodamine)，Sypro系列(如Sypro Ruby,Sypro Rose)，深紫染料等。應(yīng)當(dāng)指出的是， 一些結(jié)合蛋白后變成的熒光染料。在以上的描述中，文章中指出，金屬離子或金屬絡(luò)合物(也稱為金屬螯合物)也可 用于染色的蛋白質(zhì)，除了在這個發(fā)明中提到的染色試劑(考馬斯亮藍(lán)，R-250或G-250)，這 些染色試劑包括，但不僅限于亞鐵，銦或鉬鄰苯三酚紅復(fù)合物，或其他金屬配合物與鄰苯二 酚紫形成的復(fù)合物，溴鄰苯三酚紅，二甲酚橙，鄰苯三酚酞等。應(yīng)當(dāng)指出的是，一些在結(jié)合蛋白后的熒光染料或者將要變成的熒光染料。
發(fā)明的染色液可以瓶裝和用作于一般在研究和診斷實驗室中。它也可以預(yù)染(介 質(zhì)為轉(zhuǎn)印濾紙)。發(fā)明包括的染料通常被用于蛋白染色或者類似的實驗。該發(fā)明提供了一種快速蛋白染色的方法類似常規(guī)蛋白染色(但減少了步驟和時 間)。一般常規(guī)蛋白染色，通常包括三個步驟，例如，在圖1。這些步驟包括一個固定步驟， 染色步驟和脫色步驟。常規(guī)蛋白染色的這些步驟的每一步都是必要的，以獲得可以接受的 結(jié)果。在以上的描述中，這些文章中提到的技術(shù)將會被有目的的修改，以進(jìn)一步改善染 色的靈敏度。這些修改包括但不僅限于，增加一個或多個步驟。其中一個例子是增加了脫 色步驟，以進(jìn)一步減少的背景。在以上的描述中，這些文章中所提到的技術(shù)，將有很多方法在兩個電極之間組裝 快速染色的分析。如圖5所示，發(fā)明中的染色液被一片轉(zhuǎn)印濾紙吸收然后放在膠上進(jìn)行染 色。如果染色液帶正電，用一片轉(zhuǎn)印濾紙浸潤染色液后放在膠下面進(jìn)行染色。當(dāng)電極轉(zhuǎn)換 后，帶正電的染色液將會向上移動到膠介質(zhì)中對蛋白進(jìn)行染色。需要指出的是，不同染色液 的混合物也能用來改進(jìn)染色的靈敏度。雖然正負(fù)極染色液在染色之前被膠介質(zhì)分離，但是 同時用負(fù)極染色液或者混合物和正極染色液或者混合物進(jìn)行染色是可行的。在以上的描述中，這些文章中提到的技術(shù)中有很多種方法定位兩個電極。如圖5 所示，正極在底部，而負(fù)極在頂部。正極和負(fù)極的位置可以轉(zhuǎn)換。而且染色液的位置也可以 改變，將會對介質(zhì)膠中的蛋白進(jìn)行染色。給這個染色裝置提供的電壓可以是不高于500V。本發(fā)明的有益效果這個發(fā)明提供了為在介質(zhì)中的生物聚合物快速染色的方法和有用的組分。一方 面，這個發(fā)明提供了傳統(tǒng)生物聚合物(如蛋白)染色技術(shù)的一個顯著的改進(jìn)。這個發(fā)明提 供的方法使傳統(tǒng)方法的蛋白染色的多個步驟合并成了一步。另一方面，這個發(fā)明提供了一 種用陽極和陰極提供的電場力使帶電的染色液在介質(zhì)中移動的方法。陽極和陰極提供的電 壓使染色液移動速度比傳統(tǒng)染色方法中處于主導(dǎo)地位的擴(kuò)散作用的速度更快。因此電場力 不僅能使染色液快速移動進(jìn)入凝膠介質(zhì)中與生物聚合物結(jié)合，使生物聚合物染色，而且能 使未與生物聚合物結(jié)合的染料從膠介質(zhì)中快速移出使膠介質(zhì)脫色。這個發(fā)明大大減少了生 物聚合物的染色(檢測鑒定)的時間和成本。1、本發(fā)明提供的染色方法染色全過程耗時短，染料和介質(zhì)選擇余地大，應(yīng)用范圍2、本發(fā)明提供的染色法使用的染料的量很少，同時避免使用脫色液，可節(jié)約成本。3、本發(fā)明提供的方法操作簡單，染色、脫色、顯色可一步完成，也可將生物材料分 離與染色步驟結(jié)合在一起完成。4.本發(fā)明提供的方法占用實驗室的空間非常小，最大程度的減少污染的面積。5.本發(fā)明提供的方法實驗結(jié)果的靈敏度較高。6.本發(fā)明使用的試劑避免使用傳統(tǒng)的有毒性試劑，安全。


圖1 常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色程序示意圖。凝膠固定1小時，1小時染色和3小時脫色共5個小時。
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圖2 實施例1按本發(fā)明方法進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)快速染色牛血清白蛋白的結(jié)果，時間 為6分鐘。M是蛋白質(zhì)標(biāo)記(GenScript，MM0900)。圖3 實施例1按傳統(tǒng)方法進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色牛血清白蛋白的結(jié)果，時間為5小 時。M是蛋白質(zhì)標(biāo)記(GenScript，MM0900)。圖4 本發(fā)明考馬斯亮藍(lán)快速染色三明治結(jié)構(gòu)的安裝示意圖。圖5 實施例2采用帶正電的染料(溴化乙啶)在電場的驅(qū)動下與DNA結(jié)合后，在 紫外燈下成像。介質(zhì)為瓊脂糖凝膠，濃度為2%。樣品是一種核酸標(biāo)記。500ng/泳道，核酸 被分別上樣到預(yù)制核酸凝膠(金思特公司，GenScript，貨號L00335)中的1、2、3、4、5、6、7 泳道中。染色時間為3分鐘。圖6 電泳分離前未結(jié)合，染料與生物材料遷移方向相反的示意圖。圖7 電泳分離前未結(jié)合，染料與生物材料遷移方向相同的示意圖。圖6、圖7中， 代表染料，■代表未結(jié)合染料的生物聚合物，+代表結(jié)合了染料的 生物聚合物。圖8 實施例3按本發(fā)明方法染色的結(jié)果。圖9 實施例4按本發(fā)明方法染色的結(jié)果。圖10 實施例5按本發(fā)明方法染色的結(jié)果，左圖為肉眼直接觀察，右圖為在紫外燈 下成像。圖11 實施例6按本發(fā)明方法染色的結(jié)果。圖12 實施例7按本發(fā)明方法染色的結(jié)果。圖13 實施例8按本發(fā)明方法染色的結(jié)果。
具體實施例方式下列針對性的實驗更進(jìn)一步的說明這個發(fā)明，必須指出的是，這個發(fā)明不僅限于 此。一般性說明由于實施例中采用的生物聚合物分子量與所用染料相比有顯著的差 別，在同樣的電泳條件下，結(jié)合或未結(jié)合染料的生物聚合物的遷移率明顯小于染料的遷移 率，故實施例中不再對它們的遷移率一一測定。實施例1先電泳分離蛋白質(zhì)再染色。牛血清白蛋白染色。1500ng、750ng、300ng、150ng、75ng、30ng的牛血清白蛋白被 分別上樣兩塊PAGE膠(Genscript，MG008W10)的1到6號泳道，電泳后，一塊膠被用于快 速染色，具體地說，電泳后，把膠取出，將膠放在如圖4所示的三明治結(jié)構(gòu)之中。溶液A為含 10 50% (ν/ν)異丙醇、5 35% (ν/ν)乙醇、1 30mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，溶液 B為含0. 05 0. 5% (質(zhì)量體積比)的考馬斯亮藍(lán)，20 60% (ν/ν)乙醇，1 30mmol/L 的乙二胺四乙酸，2 30% (ν/ν)乙酸的水溶液，C為ρΗ 4. 0 10的磷酸或者類似的緩沖 液(優(yōu)選Α為含25%異丙醇、10%乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B為含0.3%的 考馬斯亮藍(lán)、46%乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸、8%乙酸的水溶液，C為ρΗ 6. 8%的磷酸緩 沖液)。用電源給三明治結(jié)構(gòu)通電18V，6分鐘。整個過程持續(xù)大概6分鐘，結(jié)果見圖2。第二塊膠被用于傳統(tǒng)的方法染色，具體地說電泳之后，把膠取出，用固定液(含 10% (ν/ν)乙酸和20% (ν/ν)甲醇的水溶液)固定1小時，固定之后，將固定液吸出，加IOOmL染色液(含0. 1% (質(zhì)量體積比)考馬斯亮藍(lán)，25% (ν/ν)甲醇以及10% (ν/ν)乙酸 的水溶液)，染色1小時。將溶液吸出，加IOOmL脫色液(含25% (ν/ν)甲醇及10% (ν/ν) 乙酸的水溶液)，震蕩1小時，脫色步驟重復(fù)三次，直到蛋白條帶被看見，沒有背景。整個過 程持續(xù)大概5小時，結(jié)果見圖3。經(jīng)比較，圖2與圖3基本一致，說明采用本發(fā)明方法僅需6分鐘就能達(dá)到傳統(tǒng)考馬 斯亮藍(lán)染色5小時的染色效果。實施例2 分別取DNA Marker (Genscript，IOObp ladder)，上樣于濃度為2%的瓊脂糖凝膠， 500ng/泳道，核酸被分別上樣到預(yù)制核酸凝膠中的1、2、3、4、5、6、7泳道中，在TBE (含445 mmol/L Tris堿，445mmol/L硼酸鹽，10mmol/L EDTA的水溶液)緩沖液中，恒流300mA，20分 鐘。電泳結(jié)束后，將浸濕帶正電染料(溴化乙啶稀釋10000倍)的濾紙平鋪于正極板上，電 泳后的瓊脂糖凝膠位于其上，瓊脂糖上方再平鋪上兩層浸濕TBE的濾紙，上方加上負(fù)電極 組成三明治結(jié)構(gòu)，在兩電極上施加50V的電壓，3分鐘。在電場的驅(qū)動下與DNA結(jié)合后，在紫 外燈下成像。染色時間為3分鐘，結(jié)果見圖5。實施例3 多種生物聚合物的電泳分離與染色合二為一。分別取分子量為67KD的蛋白質(zhì)(牛血清白蛋白)500yg和分量為6KD的多肽 500 μ g，加入Iml水中，配成多種生物聚合物混合的水溶液，加入Iml溶液B (含0. 3%考馬 斯亮藍(lán)，46%乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸，8%乙酸的水溶液)，使染料與生物聚合物保持 接觸1分鐘，對生物聚合物進(jìn)行染色，然后取該溶液上樣于醋酸纖維素膜介質(zhì)一端(長度為 10cm，浸漬于pH8. 6的濃度為0. 07mol/L巴比妥緩沖液中)，介質(zhì)施加電壓200v，分離時間 20分鐘，即可見到多肽和蛋白質(zhì)能夠被分離并清晰顯色，結(jié)果見圖8。實施例4 核酸中含有蛋白取核酸片段大小為500bp的DNA片段濃度為1 μ g/ μ 1 5 μ 1與分子量為56KD的 蛋白(牛血清白蛋白)濃度為1 μ g/ μ 1 5 μ 1均勻混合后取5 μ 1上樣與8%的PAGE預(yù)置 膠中(Genscript，MG008W10)的一個泳道中，電泳條件140V，40分鐘。電泳后，把膠取出，將 膠放在如圖4所示的三明治結(jié)構(gòu)之中。溶液A為含25 %異丙醇，10 %乙醇，5mmol/L乙二胺 四乙酸的水溶液，溶液B為含0. 3%考馬斯亮藍(lán)，46%乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸，8%乙酸 的水溶液，6. 8%的磷酸緩沖液。用電源給三明治結(jié)構(gòu)通電18V，6分鐘。結(jié)果見圖 9。實施例5:取核酸片段大小為500bp的DNA片段濃度為1 μ g/ μ 1 5 μ 1與分子量為56KD的 蛋白(牛血清白蛋白)濃度為lyg/μ 5μ1均勻混合后取5μ1上樣與8%的PAGE預(yù)置 膠中(Genscript，MG008W10)的一個泳道中，電泳條件140V，40分鐘。電泳后，把膠取出， 將膠放在類似圖4所示的三明治結(jié)構(gòu)之中，與其不同的是在在介質(zhì)與含C的轉(zhuǎn)印濾紙之間 添加了一層浸濕帶正電的染料(溴化乙啶稀釋10000倍)的濾紙。溶液A為含25%異丙 醇，10%乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B為含0. 3%考馬斯亮藍(lán)，46%乙醇，5mmol/ L乙二胺四乙酸，8%乙酸的水溶液，6.8%的磷酸緩沖液。用電源給三明治結(jié)構(gòu)通 電18V，6分鐘。用肉眼觀察和在紫外燈下成像，結(jié)果見圖10 左圖為肉眼直接觀察，右圖為 在紫外燈下成像。
實施例6 金屬離子染料(鋅染)牛血清白蛋白染色。1500ng、750ng、300ng、150ng、75ng、30ng的牛血清白蛋白被 PAGE膠(Genscript，MG008W10)的1到6號泳道，電泳后，膠被用于金屬離子快速染色，具 體地說，電泳后，把膠取出，將膠放在如圖4所示的三明治結(jié)構(gòu)之中。溶液A為含1 50% (w/v)碳酸鈉、5 35% (ν/ν)乙醇，C為ρΗ 2. 0 7. 0的硫酸鋅溶液(1 10% (w/v))。 用電源給三明治結(jié)構(gòu)通電18V，6分鐘。整個過程持續(xù)大概6分鐘(本實施例將三明治結(jié)構(gòu) 中的B去掉)，結(jié)果見圖11。實施例7 金屬離子染色后再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色(鋅染后考染)牛血清白蛋白染色。1500ng、750ng、300ng、150ng、75ng、30ng的牛血清白蛋白被 PAGE膠(Genscript，MG008W10)的1到6號泳道，電泳后，膠被用于金屬離子快速染色，具體 地說，電泳后，把膠取出，將膠放在如圖4所示的三明治結(jié)構(gòu)之中。溶液A為含1 50 % (w/ ν)碳酸鈉、5 35% (ν/ν)乙醇，B為ρΗ 2. 0 7. 0的硫酸鋅溶液(1 10% (w/v))。用 電源給三明治結(jié)構(gòu)通電18V，6分鐘。整個過程持續(xù)大概6分鐘，之后將鋅染后的膠浸于雙蒸 水中10秒后，將膠放在如圖4所示的三明治結(jié)構(gòu)之中。溶液A為含10 50% (ν/ν)異丙 醇、5 35% (ν/ν)乙醇、1 30mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，溶液B為含0. 05 0. 5% (質(zhì)量體積比)的考馬斯亮藍(lán)，20 60% (ν/ν)乙醇，1 30mmol/L的乙二胺四乙酸，2 30% (ν/ν)乙酸的水溶液，C為ρΗ 4. 0 10的磷酸或者類似的緩沖液(優(yōu)選Α為含25% 異丙醇、10%乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B為含0. 3%的考馬斯亮藍(lán)、46%乙醇、 5mmol/L乙二胺四乙酸、8%乙酸的水溶液，C為ρΗ 6. 8%的磷酸緩沖液)。用電源給三明治 結(jié)構(gòu)通電18V，6分鐘，效果見圖12 (本實施例鋅染步驟將三明治結(jié)構(gòu)中的B去掉，考馬斯亮 藍(lán)染色將三明治結(jié)構(gòu)B加上)。實施例8 先常規(guī)方法染色，待膠染上色之后用此原理脫色蛋白marker 染色。1 μ 1、2 μ 1、3 μ 1、4 μ 1、5 μ 1 蛋白 marker 被上樣于 PAGE 膠 (Genscript, MG008W10)的1、10，2、9，3、8，4、7，5、6泳道，電泳后，膠被用于常規(guī)方法染色， 具體的做法是電泳之后，把膠取出，用固定液(含10% (ν/ν)乙酸和20% (ν/ν)甲醇的水 溶液)固定1小時，固定之后，將固定液吸出，加IOOmL染色液(含0. 1 % (質(zhì)量體積比)考 馬斯亮藍(lán)，25% (ν/ν)甲醇以及10% (ν/ν)乙酸的水溶液)，染色1小時。染色之后，將膠 取出，放在如圖4所示的三明治結(jié)構(gòu)之中。溶液A為含10 50% (ν/ν)異丙醇、5 35% (ν/ν)乙醇、1 30mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，溶液B為含0.05 0.5% (質(zhì)量體積 比)的考馬斯亮藍(lán)，20 60% (ν/ν)乙醇，1 30mmol/L的乙二胺四乙酸，2 30% (ν/ ν)乙酸的水溶液，C為ρΗ 4. 0 10的磷酸或者類似的緩沖液(優(yōu)選Α為含25%異丙醇、 10%乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B為含0. 3%的考馬斯亮藍(lán)、46%乙醇、5mmol/L 乙二胺四乙酸、8%乙酸的水溶液，6.8%的磷酸緩沖液)。用電源給三明治結(jié)構(gòu)通 電18V，6分鐘。效果如圖13。
權(quán)利要求
一種生物聚合物染色法，包括染料與待染色的生物聚合物結(jié)合、未結(jié)合的染料與已結(jié)合染料的生物聚合物的分離、已結(jié)合染料的生物聚合物顯像，其特征在于a.染料與生物聚合物結(jié)合將染料與待染色的生物聚合物直接混合進(jìn)行染色，或者將待染色的生物聚合物與含有染料的載體接觸，或者將染料與待染色的生物聚合物在施加或不施加電場的介質(zhì)中保持接觸，使染料與待染色的生物聚合物結(jié)合而進(jìn)行染色；b.未結(jié)合的染料與已結(jié)合染料的生物聚合物的分離將染料與待染或已染生物聚合物置于施加電場的介質(zhì)中，使未與生物聚合物結(jié)合的染料從介質(zhì)中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介質(zhì)中；c.已結(jié)合染料的生物聚合物顯像保留在介質(zhì)中的已結(jié)合染料的生物聚合物采用可見光下顯像或采用非可見光成像技術(shù)顯像；其中，在施加電場的介質(zhì)中，結(jié)合或未結(jié)合染料的生物聚合物的遷移率小于染料的遷移率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色法，其特征在于染料與生物聚合物在介質(zhì)中的遷移方向 相同或不相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色法，其特征在于步驟a與b中的介質(zhì)為同一介質(zhì)或不同 介質(zhì)；當(dāng)存在多個生物聚合物時，步驟b中施加的電場使生物聚合物在介質(zhì)中遷移的方向 與步驟a中施加的電場使生物聚合物在介質(zhì)中遷移的方向不相反。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色法，其特征在于步驟b使未與生物聚合物結(jié)合的染料從 介質(zhì)中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介質(zhì)中的方法是通過控制遷移時間、與遷移 方向平行的介質(zhì)長度、遷移率、生物聚合物起始遷移位置來實現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色法，其特征在于步驟b未與生物聚合物結(jié)合的染料從介 質(zhì)中部分移出的程度使留在介質(zhì)中的未結(jié)合染料造成的背景色與結(jié)合染料的生物聚合物 的顯色能夠區(qū)分出來。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色法，其特征在于非可見光成像技術(shù)為熒光顯像、紅外顯 像、紫外顯像、放射顯像、數(shù)字成像技術(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色法，其特征在于染料為有機(jī)染料、無機(jī)染料、熒光染料、 復(fù)合型染料中的一種或多種；生物聚合物為多肽、蛋白、RNA、DNA、低聚糖中的一種或多種； 介質(zhì)為濾紙、醋酸纖維素膜、瓊脂、凝膠中的一種；載體為普通濾紙、轉(zhuǎn)印濾紙或海綿。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的染色法，其特征在于有機(jī)染料為考馬斯亮藍(lán)、氨基黑、麗春 紅、固綠FCF、鋅試劑、鉻黑中的一種或多種；無機(jī)染料為銅離子、亞鐵離子及其他重金屬離 子中的一種或多種；熒光染料為溴化乙啶、丫啶類染料、花菁染料中的一種或多種；復(fù)合型 染料為無機(jī)染料與有機(jī)染料復(fù)合物、熒光染料和有機(jī)染料的復(fù)合物、熒光染料和無機(jī)染料 的復(fù)合物等中的一種或多種；凝膠為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色法，其特征在于包括下列步驟在正極板上放置浸濕溶 液C的載體，將介質(zhì)放在浸濕溶液C的載體之上，將浸濕溶液B的載體放在介質(zhì)之上，將一 個浸濕溶液A的載體在浸濕溶液B的載體之上，負(fù)極在這個三明治結(jié)構(gòu)的最上方；其中，溶液A為含異丙醇、乙醇、EDTA中一種或多種的水溶液，溶液B為含考馬斯亮藍(lán)、 異丙醇、Tris、EDTA、乙酸中一種或多種的水溶液，溶液C為pH 2.0 11的磷酸緩沖液或者 類似的緩沖液，介質(zhì)為濾紙、醋酸纖維素膜、瓊脂、凝膠，載體為普通濾紙、轉(zhuǎn)印濾紙或海綿。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的染色法，其特征在于溶液A為含10 50%異丙醇、5 35% 乙醇、1 30mmol/L EDTA的水溶液，溶液B為0. 05 0. 5%考馬斯亮藍(lán)，20 60%乙醇， 1 30mmol/L EDTA，2 30%乙酸的水溶液，溶液C為pH 6. 8的磷酸緩沖液。
11.一種染色試劑盒，其特征在于該試劑盒含有正負(fù)電極、試劑A、試劑B、試劑C ；或者 還含有介質(zhì)和/或用于浸漬試劑的載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的染色試劑盒，其特征在于該試劑盒的結(jié)構(gòu)為在正電極與負(fù) 電極之間依次浸漬試劑C的載體、介質(zhì)、浸漬試劑B的載體、浸漬試劑A的載體；其中介質(zhì)可 以是已含有待染色的生物聚合物的介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了生物聚合物快速染色法。該方法包括染料與待染色的生物聚合物結(jié)合、未結(jié)合的染料與已結(jié)合染料的生物聚合物的分離、已結(jié)合染料的生物聚合物顯像，該方法利用染料與生物聚合物在施加電場的介質(zhì)中的遷移率不同，使染料快速與生物聚合物結(jié)合，并能快速使未結(jié)合的染料與已結(jié)合染料的生物聚合物分離，縮短整個染色時間，節(jié)約成本，該方法操作簡單，染色、脫色、顯色可一步完成，也可將生物聚合物的分離與染色步驟結(jié)合在一起完成。
文檔編號G01N1/30GK101936837SQ201010220009
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者孟凡麗, 戴瞻, 楊錦宇, 王珠銀, 章方良, 賴兵 申請人:南京金斯瑞生物科技有限公司