專利名稱：快速檢測氯霉素殘留的膠體金試紙條制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及快速檢測氯霉素殘留的方法。
背景技術：
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是由土壤中的一些特定的委內瑞拉菌屬所產(chǎn)生 的一種抗菌劑，對革蘭氏陽性、陰性菌、立克次氏體，衣原體，支原體均有抑制作用，但被證 明其在動物性食品中的殘留會給人類帶來很大的毒副作用，比如再生障礙性貧血，并且較 難代謝排除。為此，許多國家禁止了氯霉素的使用，比如美國，加拿大，澳大利亞和歐盟成員 國。2002年中國農業(yè)部《動物性食品獸藥殘留規(guī)定》中規(guī)定氯霉素在可食部分不得檢出。 但有的不法分子由于氯霉素的廉價、抑菌效果良好，在利益的驅使下，仍然利用氯霉素治療 動物的細菌性感染等疾病。目前，檢測氯霉素殘留的方法有很多HPLC、GC、LC-MS-MS, GC-MS-MS，這些方法雖 然都很精確，有的檢測限甚至能達到0. lng/g，但都需要儀器，有的還很昂貴，耗時也較長。 基于免疫學的ELISA方法，雖然減小了檢測成本，也縮短了檢測時間，但操作繁瑣，需要專 業(yè)人員進行操作。膠體金免疫層析方法檢測氯霉素殘留提供了一種快速、簡便的氯霉素檢 測方法，這是一種利用膠體金標記單克隆抗體，利用抗原抗體的特異性結合判斷樣品中被 檢測物質的含量。其制備方法包括利用檸檬酸三鈉法制備膠體金，在適當?shù)臉擞洍l件下標 記氯霉素單克隆抗體得到金標抗體，然后離心純化金標抗體，接著將純化的好的金標抗體 噴在已處理好的玻璃纖維膜(結合墊)上，同時將包被抗原氯霉素-卵清蛋白(CAP-0VA)、 二抗羊抗小鼠IgG包被在硝酸纖維膜(NC膜)上，將干燥好的NC膜、結合墊、玻璃纖維膜 (樣品墊)、吸水紙依次有序貼在PVC底板上，制備膠體金試紙條。但在標記方法、離心純化 時重懸液配方、結合墊處理液配方方面較為復雜。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術氯霉素膠體金試紙條制備方法的不足，提供一種簡 單、易行檢測氯霉素殘留的膠體金試紙條的制備方法。實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案如下在現(xiàn)有的氯霉素膠體金試紙條制備的技術基礎上， 本發(fā)明采用膠體金標記氯霉素單克隆抗體時采用一種同時加入保護劑和抗體的方法制備 金標抗體，這樣由于保護劑的加入，更有利于抗體的標記；由于現(xiàn)有的重懸液配方復雜，金 標抗體的濃縮效果欠佳，在離心純化時使用經(jīng)過改良的重懸液；由于現(xiàn)有的結合墊處理液 不能產(chǎn)生理想的結合墊釋放效果，金標抗體結合墊采用經(jīng)過改良的結合墊處理液處理。本發(fā)明的工藝特點是采用同時加入保護劑和氯霉素單克隆抗體的方法制備金標 抗體，制得的金標抗體使用重懸液離心純化，金標抗體結合墊先用結合墊處理液處理，再噴 上金標抗體而制得。保護劑是海藻糖，海藻糖終質量濃度為0. 5% 3%，金標抗體離心純 化所用的重懸液其配方是終質量濃度為0. 0. 5%吐溫20， 3%海藻糖，0. 5% 2% BSA,0.01mol/L PBS pH7. 4溶液，結合墊處理液配方為終質量濃度為0. 0. 5%吐溫 20，1% 3%海藻糖，5% 10%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。本發(fā)明的有益效果是，工藝步驟操作簡單、易行，試劑價格低廉、易得。本發(fā)明氯霉 素膠體金試紙條檢測靈敏度達3ng/ml，檢測范圍為3 lOOOng/ml ；特異性實驗證明與新霉 素、土霉素、鏈霉素、四環(huán)素甲砜霉素等氯霉素的結構類似物的交叉反應在以下；假陽 性率在5%以下、假陰性率在以下；同一批次的試紙條10條結果統(tǒng)一，說明產(chǎn)品重復性 良好；常溫干燥條件下能保持20天，穩(wěn)定性良好。


說明書附圖1為氯霉素膠體金試紙條的示意圖。圖中1為樣品墊，2為樣品滴加方向，3為金標抗體結合墊，4為控制線(C線)，5為 吸水紙，6為PVC底板，7為層析方向，8為檢測線(T線)，9為NC膜。說明書附圖2為檢測結果示意圖。圖中，1為陰性結果，2為陽性結果，3為無效，C為控制線，T為檢測線。
具體實施例方式實施例11.膠體金制備在冷凝回流裝置中的圓底燒瓶中加入100ml超純水和Iml 的 氯金酸溶液，加熱至沸后加入Iml 1 %濃度的檸檬酸三鈉溶液，觀察顏色變化，待顏色穩(wěn)定時 繼續(xù)反應lOmin。冷卻靜置一天，利用粒度儀檢測制得粒徑為40nm膠體金，其最大吸收峰在 526nm。2.膠體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。膠體 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3調至pH8. 2，取最佳用量氯霉素單克隆抗體16 μ g/ml、終質量 濃度為的海藻糖同時加入100ml膠體金溶液，在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終質 量濃度為0. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。3.金標抗體的純化(1)金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min，棄去出凝聚的金顆粒形成的沉 淀，取紅色上清溶液于4°C再8000r/min離心30min。(2)溶液分為三層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的 金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸 液終質量濃度為0. 吐溫20，1%海藻糖，0. 5%BSA，0.01mol/L PBS pH7. 4溶液。(3)重復離心3次，最后重懸至原體積的1/20，加入0. 1 %的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆谩?.結合墊的前處理樣品墊和結合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封 閉處理，浸泡30min后37°C、2h烘干，結合墊處理液含有終質量濃度為0. 3% %吐溫20， 2%海藻糖，10%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.噴金金標抗體調濃度至OD526為5，點樣機將金標抗體在結合墊上均勻點樣，點 樣量在30μ l/cm2，37°C干燥。6.檢測線抗原和控制線二抗的包被將包被抗原CAP-OVA稀釋到1. 5mg/ml，二抗 稀釋度為商品化稀釋lmg/ml倍，手工點樣在NC膜上分別劃T線和C線，間距為5mm，37°C干
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7.試紙條的組裝將 2cmX0. 3cmNC 膜、1. 8cmX0. 3cm 吸水紙、IcmX0. 3cm 金標 墊、1. 5cmX0. 3cm樣品墊按圖1方式依次粘貼在PVC膠板上，即成氯霉素膠體金試紙條。8.將氯霉素競爭品按lng/m、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的濃度依次滴加在氯霉素 膠體金試紙條上，用PBS作為對照組，觀察實驗結果。實施例21.根據(jù)實施例1中1所述。2.膠體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。膠體 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3調至pH9. 2，取最佳用量氯霉素單克隆抗體16 μ g/ml、終質量 濃度為0. 5%的海藻糖同時加入IOOml膠體金溶液，在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終 質量濃度為0. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。3.金標抗體的純化(1)金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉 淀，取紅色上清溶液于4°C再10000r/min離心30min。(2)溶液分為三層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的 金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸 液終質量濃度為0. 2%吐溫20，2%海藻糖，1%85々，0.0111101/1 PBS pH7. 4溶液。(3)重復離心3次，最后重懸至原體積的1/20，加入0. 1 %的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆谩?.結合墊的前處理樣品墊和結合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封 閉處理，浸泡30min后37°C、2h烘干，結合墊處理液含有終質量濃度為0. 2% %吐溫20，
海藻糖，8%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.根據(jù)實施例1中5所述。6.根據(jù)實施例1中6所述。7.根據(jù)實施例1中7所述。8.根據(jù)實施例1中8所述。實施例31.根據(jù)實施例1中1所述。2.膠體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。膠體 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3調至pH9. 2，取最佳用量氯霉素單克隆抗體16 μ g/ml、終質量 濃度為2%的海藻糖同時加入100ml膠體金溶液，在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終質 量濃度為0. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。3.金標抗體的純化(1)金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉 淀，取紅色上清溶液于4°C再12000r/min離心30min。(2)溶液分為三層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的 金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸 液終質量濃度為0.5%%吐溫20，3%海藻糖，2%85々，0.0111101/1 PBS pH7. 4溶液。(3)重復離心3次，最后重懸至原體積的1/20，加入0. 1 %的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆谩?.結合墊的前處理樣品墊和結合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封 閉處理，浸泡30min后37°C、2h烘干，結合墊處理液含有終質量濃度為0. 5% %吐溫20，3%海藻糖，6%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.根據(jù)實施例1中5所述。6.根據(jù)實施例1中6所述。7.根據(jù)實施例1中7所述。8.根據(jù)實施例1中8所述。實施例41.根據(jù)實施例1中1所述。2.膠體金標記抗體最少穩(wěn)定蛋白量再增加10%左右為最佳標記蛋白用量。膠體 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3調至pH9. 2，取最佳用量氯霉素單克隆抗體16 μ g/ml、終質量 濃度為1. 5%的海藻糖同時加入IOOml膠體金溶液，在磁力攪拌器下混合IOmin后，加入終 質量濃度為0. 5%的BSA，4°C保存過夜后冷凍超速離心純化。3.金標抗體的純化(1)金標抗體溶液常溫低速(1500rpm)離心20min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉 淀，取紅色上清溶液于4°C再12000r/min離心30min。(2)溶液分為三層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的 金顆粒層。將可流動的暗紅色沉淀轉移到另外一個離心管中，用重懸液重懸至原量，重懸 液終質量濃度為0. 吐溫20，2.5%海藻糖，1.5%85六，0.0111101/1 PBS pH7. 4溶液。(3)重復離心3次，最后重懸至原體積的1/20，加入0. 1 %的疊氮鈉4°C保存?zhèn)溆谩?.結合墊的前處理樣品墊和結合墊經(jīng)剪裁后通過浸蘸前處理液進行水化和封 閉處理，浸泡30min后37°C、2h烘干，結合墊處理液含有終質量濃度為0. 3 %吐溫20， 2. 5%海藻糖，5%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.根據(jù)實施例1中5所述。6.根據(jù)實施例1中6所述。7.根據(jù)實施例1中7所述。8.根據(jù)實施例1中8所述。
權利要求
一種快速檢測氯霉素殘留的膠體金試紙條制備方法，包括膠體金的制備，膠體金標記氯霉素單克隆抗體制備金標抗體，金標抗體純化，金標抗體結合墊以及樣品墊的制備，硝酸纖維膜檢測線和控制線的包被，試紙條組裝，其特征是同時加入保護劑和氯霉素單克隆抗體制備金標抗體，制得的金標抗體使用重懸液離心純化，金標抗體結合墊先用結合墊處理液處理，再噴上金標抗體而制得。
2.根據(jù)權利要求1所述的快速檢測氯霉素殘留的膠體金試紙條制備方法，其特征是 所述保護劑是海藻糖，海藻糖終質量濃度為0. 5% 3%。
3.根據(jù)權利要求1所述的快速檢測氯霉素殘留的膠體金試紙條制備方法，其特征是 金標抗體離心純化所用的重懸液其配方是終質量濃度為0. 0. 5%吐溫20， 3% 海藻糖，0. 5% 2% BSA，0. 01mol/L PBS ρΗ7· 4 溶液。
4.根據(jù)權利要求1所述的快速檢測氯霉素殘留的膠體金試紙條制備方法，其特征是 結合墊處理液配方為終質量濃度為0. 0. 5%吐溫20， 3%海藻糖，5% 10%蔗 糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。
全文摘要
一種快速檢測氯霉素殘留的膠體金試紙條制備方法，是針對現(xiàn)有技術的制備工藝條件復雜的問題，在膠體金標記氯霉素抗體的方法、重懸液、結合墊處理液方面做出了改進，制備工藝簡單、易行，結果證明試紙條具有高靈敏度、高特異性、準確簡便、重復性好等優(yōu)點，制備試紙條的方法整個工藝條件穩(wěn)定、成熟、可靠，可以制備出質量較好的膠體金試紙條，可以用于氯霉素試紙條的生產(chǎn)，同時對其它試紙條的生產(chǎn)具有一定的參考價值。
文檔編號G01N33/577GK101943701SQ201010219939
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權日2010年7月7日
發(fā)明者嚴杰琳, 劉成梅, 涂宗財, 羅舜菁, 陳婷婷, 陳文榮, 陳臣, 高鵬 申請人:南昌大學