專利名稱：自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體和相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及疾病特異性抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體和相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
生物醫(yī)藥行業(yè)，尤其是體外診斷試劑產(chǎn)業(yè)，利潤(rùn)空間大，能源消耗小，技術(shù)水平高， 是中國(guó)國(guó)家改革與發(fā)展委員會(huì)確定的政策扶持性行業(yè)，已經(jīng)列入國(guó)家改革與發(fā)展委員會(huì) 2010年之前中國(guó)重點(diǎn)發(fā)展行業(yè)指導(dǎo)名錄。各省政府等地方政府對(duì)該類項(xiàng)目，均列入關(guān)鍵技 術(shù)、重大項(xiàng)目進(jìn)行扶持，在人力、財(cái)力上享受特別的優(yōu)惠待遇。自身免疫性疾病是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起 的疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥以及慢性淋 巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)等，發(fā)病機(jī)理不清，診斷指標(biāo)繁多、特異性不強(qiáng)，導(dǎo)致其診斷 和治療困難，是現(xiàn)代社會(huì)主要的致殘性疾病之一，嚴(yán)重影響人類健康。因此，自身免疫性疾 病的診斷和治療評(píng)估一直是臨床上的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上檢測(cè)自發(fā)性免疫性疾病絕大部分應(yīng)用自發(fā)性免疫性疾病相關(guān) 抗原，因此其敏感性和特異性均較低。因此，當(dāng)前普遍應(yīng)用的臨床檢測(cè)方法的特異性僅為 45%，靈敏性僅為68%。不能夠高特異地、高靈敏度地對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行診斷評(píng)估、 對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)治療、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行預(yù)后判斷，從而無(wú)法為醫(yī)生 準(zhǔn)確制定高度針對(duì)性的治療方案提供依據(jù)，進(jìn)而容易延誤患者治療時(shí)間，加重患者病情，給 患者帶來(lái)額外的痛苦。因此，需要提供一種新的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體和相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾 病診斷試劑盒，其能高特異地、高靈敏度地對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行診斷評(píng)估、對(duì)自發(fā)性免 疫性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)治療、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行預(yù)后判斷，為自發(fā)性免疫性疾病患者帶 來(lái)福音。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種自發(fā)性免疫性疾病特異 性抗體和相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒，該自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體能高特異 地、高靈敏度地對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行診斷評(píng)估、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)治療、對(duì) 自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行預(yù)后判斷，相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒具有高敏感性、高 特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，為自發(fā)性免疫性疾病患者帶來(lái)福音，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了 一種自發(fā)性免疫性疾病特異性 抗體，其特點(diǎn)是，所述自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體是AM-C5b9特異性抗體，所述AM-C5b9 特異性抗體是用AM-C5b9作為抗原制備的單克隆抗體或多克隆抗體。AM-C5b9是人自發(fā)性 免疫性疾病特異性蛋白質(zhì)(或抗原)。
較佳地，所述單克隆抗體是用AM_C5b9抗原免疫小鼠后得到的，所述多克隆抗體 是用AM-C5b9免疫大兔后得到的。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種上述的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體在制備自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒中的用途。在本發(fā)明的第三方面，提供了上述的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體在診斷、檢測(cè) 和/或監(jiān)測(cè)自發(fā)性免疫性疾病中的用途。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒，其特點(diǎn)是，包括 裝有上述的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體的第一試劑容器和裝有標(biāo)記的抗自發(fā)性免疫性 疾病特異性抗體的二抗的第二試劑容器。較佳地，所述第二試劑容器裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗自發(fā)性免疫性疾病特異 性抗體的二抗。更佳地，所述自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒還包括裝有使辣根過(guò)氧化物酶顯色的 顯色劑的第三試劑容器。較佳地，所述自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒還包括包被有作為捕獲抗體的 AM-C5b9特異性抗體的ELISA板。在本發(fā)明的第五方面，提供了上述的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒在診斷、檢測(cè) 和/或監(jiān)測(cè)自發(fā)性免疫性疾病中的用途。本發(fā)明的有益效果在于1、本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的自發(fā)性免疫性疾病特異標(biāo)記蛋白質(zhì)(AM_C5b9)，本發(fā)明 的標(biāo)記的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體可以與其結(jié)合，再通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記可以，特異地、高靈 敏度地對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行診斷評(píng)估、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)治療、對(duì)自發(fā)性 免疫性疾病進(jìn)行預(yù)后判斷，為自發(fā)性免疫性疾病患者帶來(lái)福音，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。2、本發(fā)明以自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體(AM_C5b9特異性抗體)為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)出 以人自發(fā)性免疫性疾病特異性抗原AM-C5b9為靶標(biāo)的兩種試劑盒——AM-5b9-E免疫分析 法(診斷血樣試驗(yàn))試劑盒和AM-5b9-IHC組織化學(xué)法(預(yù)測(cè)的組織學(xué)變化試驗(yàn))試劑盒， 能夠特異地、高靈敏度地對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行診斷評(píng)估、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行監(jiān) 測(cè)治療、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行預(yù)后判斷，為自發(fā)性免疫性疾病患者帶來(lái)福音，且使用方 便，快速靈敏準(zhǔn)確，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，獲得一種自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體即 AM-C5b9特異性抗體，該AM-C5b9特異性抗體對(duì)人AM_C5b9具有優(yōu)異的特異性結(jié)合作用，從 而AM-C5b9成為新的自發(fā)性免疫性疾病特異標(biāo)記蛋白質(zhì)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的 實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體即AM_C5b9特異性抗體的制備1. 1自發(fā)性免疫性疾病特異蛋白質(zhì)AM_C5b9的分離
自發(fā)性免疫性疾病特異蛋白質(zhì)AM_C5b9的分離方法可以參照文獻(xiàn)(Kolb WP andMulIer-Eberhard HJ. The membrane attack mechanism of complement. Isolation and subunitcomposition of the C5b-9complex. J Exp Med. 1975 ；141 724-735)白勺力夕去/人入 自發(fā)性免疫性疾病病人血中分離。1. 2AM-C5b9特異性抗體的制備將上述分離的自發(fā)性免疫性疾病特異蛋白質(zhì)AM_C5b9免疫小鼠獲得AM_C5b9單克隆抗體；將上述分離的自發(fā)性免疫性疾病特異蛋白質(zhì)AM-C5b9免疫大兔獲得AM-C5b9多克 隆抗體。實(shí)施例2AM-5b9_IHC組織化學(xué)法(預(yù)測(cè)的組織學(xué)變化試驗(yàn))試劑盒的制備和使用2. 1以實(shí)施例1獲得的AM_C5b9單克隆抗體為一抗，將AM_C5b9單克隆抗體 為抗原免疫大兔獲得多克隆二抗，并對(duì)多克隆二抗進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，形成一種 AM-5b9-IHC組織化學(xué)法(預(yù)測(cè)的組織學(xué)變化試驗(yàn))試劑盒。ROC分析本試劑盒的敏感性和特異性60份病人血淋巴細(xì)胞樣本，包括35個(gè)SLE 病人、25個(gè)RA病人。所有臨床病人均經(jīng)過(guò)活檢證實(shí)，雙盲隨機(jī)取樣。當(dāng)被檢測(cè)樣品達(dá)到90% 的敏感度時(shí)，其特異性達(dá)到75% ；而當(dāng)其敏感度達(dá)到95%時(shí)，其特異性達(dá)到86%左右。2. 2 以實(shí)施例1獲得的AM-C5b9多克隆抗體為一抗，將AM-C5b9多克隆抗體為抗原免疫大兔獲 得多克隆二抗，并對(duì)多克隆二抗進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，形成另一種AM-5b9-IHC組織化 學(xué)法(預(yù)測(cè)的組織學(xué)變化試驗(yàn))試劑盒。ROC分析本試劑盒的敏感性和特異性60份病人血淋巴細(xì)胞樣本，包括35個(gè)SLE 病人、25個(gè)RA病人。所有臨床病人均經(jīng)過(guò)活檢證實(shí)，雙盲隨機(jī)取樣。當(dāng)被檢測(cè)樣品達(dá)到 85%的敏感度時(shí)，其特異性達(dá)到68% ；而當(dāng)其敏感度達(dá)到90%時(shí)，其特異性達(dá)到80%左右。 實(shí)施例3AM-5b9-E免疫分析法(診斷血樣試驗(yàn))試劑盒的制備和使用3. 1以實(shí)施例1獲得的AM_C5b9單克隆抗體為一抗，將AM_C5b9單克隆抗體為抗原 免疫大兔獲得多克隆二抗，并對(duì)多克隆二抗進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，將AM-C5b9單克隆 抗體作為捕獲抗體包埋在ELISA板上，形成一種AM-5b9-E免疫分析法(診斷血樣試驗(yàn))試 劑盒。ROC分析(需要指出分析采用的方法，因此，在實(shí)施例2中同樣補(bǔ)充了“R0C分析”) 本試劑盒的敏感性和特異性60份病人血清樣本，包括35個(gè)SLE病人、25個(gè)RA病人。所有 臨床病人均經(jīng)過(guò)活檢證實(shí)，雙盲隨機(jī)取樣。當(dāng)被檢測(cè)樣品達(dá)到88. 2%的敏感度時(shí)，其特異性 達(dá)到68. 2% ；而當(dāng)其敏感度達(dá)到86%時(shí)，其特異性達(dá)到80%左右。與常用檢測(cè)特異抗原方法相比，采用本試劑盒在檢測(cè)60病人血清中的自發(fā)性免 疫性疾病特異抗原(AM-C5b9)時(shí)敏感度較高，一般在85-95%之間。而在2.5-10納克/ 毫升的總特異抗原灰色區(qū)，當(dāng)敏感度達(dá)到88%時(shí)，采用本試劑盒檢測(cè)的方法的特異性達(dá)到 70%。在測(cè)定60病人血清樣本中病人血清中的自發(fā)性免疫性疾病特異抗原(AM-C5b9)與 AM-C5b9單克隆抗體達(dá)到> 10納克/毫升時(shí)，其敏感度接近100%。3. 2以實(shí)施例1獲得的AM_C5b9多克隆抗體為一抗，將AM_C5b9多克隆抗體為抗原 免疫大兔獲得多克隆二抗，并對(duì)多克隆二抗進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，將AM-C5b9多克隆 抗體作為捕獲抗體包埋在ELISA板上，形成另一種AM-5b9-E免疫分析法(診斷血樣試驗(yàn)) 試齊U盒。
ROC分析本試劑盒的敏感性和特異性60份病人血清樣本，包括35個(gè)SLE病人、25 個(gè)RA病人。所有臨床病人均經(jīng)過(guò)活檢證實(shí)，雙盲隨機(jī)取樣。當(dāng)被檢測(cè)樣品達(dá)到75%的敏感 度時(shí)，其特異性達(dá)到58% ；而當(dāng)其敏感度達(dá)到90%時(shí)，其特異性達(dá)到70%左右。AM-5b9-E免疫分析法(診斷血樣試驗(yàn))試劑盒和AM_5b9_IHC組織化學(xué)法(預(yù)測(cè) 的組織學(xué)變化試驗(yàn))試劑盒，這兩種試劑盒是基于同一生物靶標(biāo)的不同免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。 新一代檢測(cè)自發(fā)性免疫性疾病特異抗原的基本原理是捕獲抗體(AM-C5b9特異性抗體) 能特異地識(shí)別病人血清樣品或組織樣品中的自發(fā)性免疫性疾病特異抗原AM-C5b9，當(dāng)加入 被標(biāo)記上的抗AM-C5b9特異性抗體的二抗時(shí)，只有血清樣品中自發(fā)性免疫性疾病特異抗原 AM-C5b9才能被二抗檢測(cè)到。而自發(fā)性免疫性疾病特異抗原AM-C5b9的高含量與自發(fā)性免 疫性疾病病人密切相關(guān)。這是新一代檢測(cè)方法的核心成分。采用本發(fā)明顯著提高了自發(fā)性免疫性疾病檢測(cè)的特異性和靈敏度，特異性從45% 左右提高到70%左右，靈敏度從68%左右提高到92%左右。本發(fā)明的試劑盒具有高敏感 性，高特異性和高準(zhǔn)確性，可作為病人普查檢測(cè)用和療效追蹤診斷用。新開(kāi)發(fā)的診斷產(chǎn)品采 用優(yōu)先篩選的抗體，應(yīng)用于免疫夾心法的抗體協(xié)調(diào)配對(duì)。由于這些抗體具有較高的親和性 和特異性，能最大限度的減少與檢測(cè)樣品中的其它分子的交叉反應(yīng)。自發(fā)性免疫性疾病特異抗原(AM_C5b9)是本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年的研究開(kāi)發(fā)發(fā)現(xiàn)的 一種高特異性、高靈敏度地診斷和評(píng)估多種自身免疫疾病的生物靶標(biāo)。本發(fā)明以人自發(fā) 性免疫性疾病特異性抗原(AM-C5b9)為生物靶標(biāo)，發(fā)了新一代自發(fā)性免疫性疾病特異抗原 (AM-C5b9)的檢測(cè)自發(fā)性免疫性疾病檢測(cè)試劑盒，包括AM-5b9-E免疫分析試劑盒(診斷血 樣試驗(yàn))和AM-5b9-IHC組織化學(xué)試劑盒(預(yù)測(cè)的組織學(xué)變化試驗(yàn))，對(duì)自發(fā)性免疫性疾病 進(jìn)行診斷評(píng)估；對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)治療；對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行預(yù)后判斷。在臨床上，新型診斷技術(shù)可對(duì)自發(fā)性免疫性疾病做出預(yù)示、監(jiān)測(cè)、治療，這對(duì)醫(yī)生 制定治療方案非常重要。而且為醫(yī)生提供了一個(gè)可隨時(shí)觀察病人對(duì)治療反應(yīng)的可靠工具。 另外，本發(fā)明的特有優(yōu)勢(shì)不但被檢測(cè)自發(fā)性免疫性疾病研究市場(chǎng)普遍接受，也深受中國(guó)檢 測(cè)自發(fā)性免疫性疾病臨床研究和應(yīng)用領(lǐng)域的普遍關(guān)注。由于對(duì)新的自發(fā)性免疫性疾病生物 標(biāo)志的研究的認(rèn)識(shí)，類似本發(fā)明的產(chǎn)品目前在市場(chǎng)尚未出現(xiàn)。相對(duì)于現(xiàn)有的臨床診斷方法，采用本發(fā)明，特異性、敏感性和準(zhǔn)確性有了巨大的提 高，能夠準(zhǔn)確地對(duì)中國(guó)每年800以上的患者進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和治療評(píng)估。因此本項(xiàng)目具有 顯著的社會(huì)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)效益和技術(shù)先進(jìn)性，符合國(guó)家和地方的產(chǎn)業(yè)扶持政策。綜上，本發(fā)明的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體能高特異地、高靈敏度地對(duì)自發(fā)性 免疫性疾病進(jìn)行診斷評(píng)估、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)治療、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行 預(yù)后判斷，相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒具有高敏感性、高特異性和高準(zhǔn)確性的特 點(diǎn)，為自發(fā)性免疫性疾病患者帶來(lái)福音，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書(shū)和附圖
應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的 而非限制性的。
權(quán)利要求
一種自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體，其特征在于，所述自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體是AM-C5b9特異性抗體，所述AM-C5b9特異性抗體是用AM-C5b9作為抗原制備的單克隆抗體或多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體，其特征在于，所述單克隆抗 體是用AM-C5b9抗原免疫小鼠后得到的，所述多克隆抗體是用AM-C5b9免疫大兔后得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體在制備自發(fā)性免疫性疾病診 斷試劑盒中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體在診斷、檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)自發(fā) 性免疫性疾病中的用途。
5.一種自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒，其特征在于，包括裝有根據(jù)權(quán)利要求1所述的 自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體的第一試劑容器和裝有標(biāo)記的抗自發(fā)性免疫性疾病特異性 抗體的二抗的第二試劑容器。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒，其特征在于，所述第二試劑 容器裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體的二抗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒，其特征在于，所述自發(fā)性免 疫性疾病診斷試劑盒還包括裝有使辣根過(guò)氧化物酶顯色的顯色劑的第三試劑容器。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒，其特征在于，所述自發(fā)性免 疫性疾病診斷試劑盒還包括包被有作為捕獲抗體的AM-C5b9特異性抗體的ELISA板。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一所述的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒在診斷、檢測(cè)和/或監(jiān) 測(cè)自發(fā)性免疫性疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體，其是AM-C5b9特異性抗體，AM-C5b9特異性抗體是用AM-C5b9作為抗原制備的單克隆抗體或多克隆抗體，較佳地，單克隆抗體是用AM-C5b9抗原免疫小鼠后得到的，多克隆抗體是用AM-C5b9免疫大兔后得到的，還提供了相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒和在診斷、檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)自發(fā)性免疫性疾病中的用途，本發(fā)明的自發(fā)性免疫性疾病特異性抗體能高特異地、高靈敏度地對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行診斷評(píng)估、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)治療、對(duì)自發(fā)性免疫性疾病進(jìn)行預(yù)后判斷，相關(guān)的自發(fā)性免疫性疾病診斷試劑盒具有高敏感性、高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，為自發(fā)性免疫性疾病患者帶來(lái)福音，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101839910SQ20101016950
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者劉東旭 申請(qǐng)人:劉東旭