專利名稱：一種檢測對人體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測對人體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法及其專用試劑盒。

背景技術(shù)：
近年來食品質(zhì)量安全的惡性事件頻發(fā)，嚴(yán)重威脅人民的健康和生命安全，食品安全問題已成為全社會關(guān)注的焦點。對獸藥、農(nóng)藥、食品添加劑、激素等殘留和危害物質(zhì)進行有效監(jiān)控是保障動物源食品安全、維護社會穩(wěn)定的關(guān)鍵。
目前檢測上述殘留物或危害物質(zhì)的普遍方法為酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。其高靈敏度和特異性，使殘留分析操作大大簡化。由于免疫分析成本低、快速、可靠，且傳感器靈敏度高因而廣泛用于殘留分析和監(jiān)測。但ELISA技術(shù)亦有其自身的缺陷，由于抗原抗體的特異性結(jié)合，只可以對一種藥物進行檢測，即使制備廣譜性抗體也只能實現(xiàn)對同一類藥物的多殘留檢測，與真正意義上的多種藥物殘留檢測相距甚遠。
半導(dǎo)體量子點納米晶(semiconductor nanocrystal)，簡稱量子點(quantumdots，QDs)，是由一定數(shù)量的實際原子組成的聚集體，尺寸小于10nm的半導(dǎo)體化合物，是一類理想的熒光指示劑。QDs具有熒光量子產(chǎn)率高、抗光漂白能力強、激發(fā)光譜分布連續(xù)、熒光發(fā)射光譜窄、峰形對稱、熒光發(fā)射波長隨尺寸變化可調(diào)等一系列獨特的光學(xué)性質(zhì)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種可同時檢測三種對人體有害的小分子物質(zhì)的免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的免疫試劑盒，包括不透明微孔板和發(fā)光復(fù)合物，所述不透明微孔板中至少有一個孔包被有三種小分子物質(zhì)包被原； 不透明微孔板可為白色不透明微孔板或黑色不透明微孔板；具體可為96孔的微孔板； 所述三種小分子物質(zhì)包被原選自如下任意一種且不相同小分子物質(zhì)I的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、小分子物質(zhì)II的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物和小分子物質(zhì)III的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III不相同； 所述發(fā)光復(fù)合物為如下1)、2)和3)所示 1)抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗抗體和量子點I形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物I；其中，量子點I與抗抗體形成復(fù)合物，復(fù)合物再通過抗抗體與抗小分子物質(zhì)I的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)I的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物I； 2)抗小分子物質(zhì)II的抗體、生物素、親和素與量子點II形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物II；其中，抗小分子物質(zhì)II的抗體與生物素形成復(fù)合物I，親和素與量子點II形成復(fù)合物II，復(fù)合物I與復(fù)合物II通過生物素與親和素的相互作用而結(jié)合形成結(jié)合物II； 3)抗小分子物質(zhì)III的抗體、金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點III形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物III；其中，金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點III形成復(fù)合物III，復(fù)合物III再通過金黃色葡萄球菌A蛋白與抗小分子物質(zhì)III的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)III的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物III； 所述量子點I、量子點II和量子點III在相同的激發(fā)波長下具有不同的特征發(fā)射波長；量子點I、量子點II和量子點III的發(fā)射波長相差30nm～70nm。
選擇具有不同發(fā)射波長的量子點，是為了區(qū)別各量子點所標(biāo)記的物質(zhì)。
所述偶聯(lián)物是通過戊二醛法或混合酸酐法或重氮化法制備得到的。
在上述試劑盒的具體應(yīng)用中，實際上是發(fā)光復(fù)合物對應(yīng)了三種檢測體系，即 (a)生物素-親和素體系“生物素化一抗”與“親和素-量子點”的結(jié)合物； (b)金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)體系一抗與“SPA-量子點”的結(jié)合物； (c)二抗體系一抗與“量子點-二抗”的結(jié)合物。
上述免疫試劑盒中，所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III為對人體或動物體有危害的小分子物質(zhì)。
上述免疫試劑盒中，還可包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣品稀釋液； 所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為所述小分子物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液； 所述樣品稀釋液為0.03mol/L～0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7.2。
上述免疫試劑盒中，所述對人體或動物體有危害的小分子物質(zhì)為磺胺藥物、喹諾酮藥物、阿維菌素類藥物、聚醚類藥物、氯霉素類藥物、四環(huán)素類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、氨基糖苷類藥物、青霉素類藥物、鏈霉素藥物、蘇丹紅、孔雀石綠或三聚氰胺。
上述免疫試劑盒中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血藍蛋白。
上述免疫試劑盒中，所述聚醚類藥物為鹽霉素；所述磺胺藥物為磺胺喹噁啉；所述阿維菌素類藥物為阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素； 所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III選自如下a)、b)和c)中的任意一種且不相同a)鹽霉素，b)磺胺喹噁啉，c)阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素； 所述抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗小分子物質(zhì)II的抗體和抗小分子物質(zhì)III的抗體選自如下任意一種且不相同由保藏編號為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3分泌得到的單克隆抗體、由保藏編號為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細胞株A-1-4分泌得到的單克隆抗體和由保藏編號為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細胞株A-4-1分泌得到的單克隆抗體； 所述抗鹽霉素的抗體為由保藏編號為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3分泌得到的； 所述抗阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素的抗體為由保藏編號為CGMCCNo.1606的單克隆雜交瘤細胞株A-1-4分泌得到的； 所述抗磺胺喹噁啉的抗體為由保藏編號為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細胞株A-4-1分泌得到的； 所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下1)、2)和3)所示 1)如下各濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L； 2)如下各濃度的鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L； 3)如下各濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L。
所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液是用樣品稀釋液稀釋各標(biāo)準(zhǔn)品得到的，所述濃度為0μg/L的各標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
上述免疫試劑盒中，所述抗抗體為羊抗鼠抗體。
上述免疫試劑盒中，所述量子點為具有如下發(fā)射波長的量子點525nm、585nm、655nm，激發(fā)波長范圍為360nm~440nm。量子點的特征是激發(fā)帶寬發(fā)射帶窄，在360nm~440nm范圍內(nèi)均可作為激發(fā)波長，激發(fā)波長優(yōu)選為400-420nm。
生物素和親和素為現(xiàn)有技術(shù)中常用的能相互結(jié)合的生物素和親和素即可。但是本發(fā)明中的N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)更易標(biāo)記抗體，且和親和素具有更好的結(jié)合效果。
上述免疫試劑盒中，所述不透明微孔板中，所述三種小分子物質(zhì)包被原的量分別為(48-50)ng/孔、(38-42)ng/孔、(28-32)ng/孔。相同孔中三種小分子物質(zhì)包被原的量具體可分別為48ng/孔、40ng/孔、30ng/孔。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測樣品中對人體或動物體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法。
本發(fā)明所提供的檢測樣品中對人體或動物體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法，是用上述任一所述免疫試劑盒對待測樣品進行檢測。
上述方法中，所述方法包括如下步驟 1)制作上述任一所述免疫試劑盒中的每種小分子物質(zhì)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值、所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的對數(shù)值或所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的半對數(shù)值，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為各小分子物質(zhì)包被原與孔內(nèi)發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度； 2)向上述任一所述免疫試劑盒中的不透明微孔板的孔中加入待測樣品的溶液，再加入所述免疫試劑盒中的三種發(fā)光復(fù)合物，孵育；檢測孔中各種所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度； 3)將步驟2)中得到的小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度與步驟1)中的小分子物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相對熒光強度進行比較，得出所測樣品中小分子物質(zhì)的濃度值； 所述檢測孔中各種所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度是指用熒光酶標(biāo)儀特定波長下激發(fā)，得到包被抗原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比求出待測樣品中小分子物質(zhì)的濃度。通常樣品中待測抗原(即下分子物質(zhì))濃度越大，包被原結(jié)合的發(fā)光復(fù)合物越少，所測得的相對熒光強度越低。
相對熒光強度定義熒光的相對強弱，以不同峰、谷的熒光強度之差來表示，是一個對應(yīng)的值。
所述方法中，在步驟2)前，包括對待測樣品進行前處理的步驟。
所述待測樣品為食品、血清或飼料。
所述食品為蜂蜜、牛奶、奶粉、禽畜肉、禽畜肝臟或水產(chǎn)。
食品均為新鮮未變質(zhì)的，通過正常商業(yè)渠道均可獲得。
對牛奶進行前處理的方法包括如下步驟將牛奶進行脫脂，用PBS溶液將脫脂后的牛奶稀釋，得到的稀釋液即為待測樣品溶液。
本發(fā)明為多組分同步分析，具體是采用多種競爭抗原包被，多種抗體發(fā)光復(fù)合物競爭，采用同一波長激發(fā)，可以測得不同發(fā)射波長的熒光強度，從而實現(xiàn)同一樣品種不同組分的定量分析。
本發(fā)明利用量子點的多色標(biāo)記功能，以量子點納米晶作為熒光標(biāo)記物，將不同直徑的量子點分別標(biāo)記不同物質(zhì)的抗體，將三種標(biāo)記的抗體同時用于檢測，以量子點為熒光探針，根據(jù)其熒光強度的變化得到小分子物質(zhì)的濃度，即可同時檢測出三種小分子物質(zhì)的含量。本發(fā)明方法實現(xiàn)了三種小分子物質(zhì)的同步檢測，大大提高了檢測效率。量子點具有激發(fā)譜寬、發(fā)射譜窄、熒光性強、顏色的可調(diào)性等優(yōu)勢。量子點與傳統(tǒng)熒光染料相比，熒光光譜對稱，熒光強度高，較ELISA相比，熒光穩(wěn)定性強，檢測重復(fù)性好。本發(fā)明方法的檢測靈敏度遠遠高于普通的ELISA方法，檢測靈敏度可提高1～2個數(shù)量級，熒光強度高，穩(wěn)定時間長，減少加入酶標(biāo)二抗和底物顯色的步驟，整個反應(yīng)只需1步即可完成，大大縮短檢測時間和技術(shù)難度，減少操作誤差。另外，本發(fā)明方法樣品前處理過程簡單，操作簡單，實現(xiàn)同步檢測，能夠快速大量的檢測樣品，適合于現(xiàn)場監(jiān)測或大批量樣品的初篩。



圖1為量子點標(biāo)記的競爭型反應(yīng)過程模式圖。
圖2為三種不同顏色量子點發(fā)射圖譜(激發(fā)波長400nm)。
圖3為阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施例方式 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
SPA購自上海翔升生物有限公司，產(chǎn)品目錄號為EK11230；N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)購自上海銳聰科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號為RC2006；鏈親和素購于上海銳聰科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號為RC00433A。
實施例1、試劑盒的組成及制備 1、同一孔中同時包被阿維菌素包被原、鹽霉素包被原和磺胺喹噁啉包被原的酶標(biāo)板； 阿維菌素包被原為阿維菌素半抗原與卵血清白蛋白的偶聯(lián)物。
鹽霉素包被原為鹽霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物。
磺胺喹噁啉包被原為磺胺喹噁啉半抗原與人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)物。
2、發(fā)光復(fù)合物 1)鹽霉素單克隆抗體與“量子點與羊抗鼠抗體復(fù)合物”形成的結(jié)合物；量子點的特征發(fā)射波長585nm； 2)“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點的復(fù)合物”形成的結(jié)合物；生物素為N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)，親和素為鏈親和素；量子點的特征發(fā)射波長525nm； 3)磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點的復(fù)合物”形成的結(jié)合物；量子點的特征發(fā)射波長655nm。
阿維菌素單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細胞株A-1-4分泌得到的(ZL 200610007260.7)； 鹽霉素單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3分泌得到的(ZL 200610007285.7)； 磺胺喹噁啉單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細胞株A-4-1分泌得到的(ZL 200610007256.0)。
3、標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1)如下不同濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品為阿維菌素；該標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號為31732；用樣品稀釋液將該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如上濃度的溶液；0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
2)如下不同濃度的鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品為鹽霉素；該標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號為84350；用樣品稀釋液將該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如上濃度的溶液；0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
3)如下不同濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品為磺胺喹噁啉；該標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號為86024；用樣品稀釋液將該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如上濃度的溶液；0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
4、洗滌液由吐溫20、疊氮化鈉和磷酸鹽緩沖液組成；洗滌液中磷酸鹽的終濃度為0.01M，吐溫20在洗滌液中的終濃度為1.0％(v/v)，疊氮化鈉在洗滌液中的終濃度為0.5mg/L；洗滌液pH值為7.4； 5、樣品稀釋液0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.2。是將濃縮液稀釋20倍得到，濃縮液為0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。
二、試劑盒的制備 (一)包被原及包被有包被原的酶標(biāo)板的制備 1、包被原的制備 1.1、阿維菌素包被原的制備及驗證 t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosi lane)購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號為19905； 阿維菌素半抗原是在阿維菌素的C4″位置上連接琥珀酸酐得到的4″-羥-琥珀酸酐阿維菌素(4″-o-succinoyl AVM)即為阿維菌素半抗原。阿維菌素半抗原的合成分三步 (1)5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-0H的合成將1.0g阿維菌素置于25mL三口雞心瓶中，6mL N，N-二甲基酰胺(DMF)溶解，加0.47g咪唑，混合。機械攪拌下，將2mL DMF稀釋的0.52g t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosilane)逐滴加入，30℃反應(yīng)2h。向反應(yīng)液中加入100mL乙酸乙酯(EtoAc)混合?；旌弦河?0mL水洗滌3次。分離EtoAc層，MgSO4干燥，減壓濃縮得到微黃色粘稠物。將該微黃色粘稠物用CH2Cl2溶解，硅膠柱層析分離產(chǎn)物，干燥后得到5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-OH。
(2)5-o-t-BuM2Si-AVM-4″-o-succinoyl的合成取0.50g 5-o-t-BuM2Si-R-4″-OH置于50mL三口雞心瓶中，加12mLCH2Cl2使其溶解，依次加入0.28g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、0.45g三乙胺和0.92g琥珀酸酐，水浴中回流2.5小時，溶液由無色變?yōu)樽厣?、黑?與反應(yīng)原料無關(guān))。減壓蒸干CH2Cl2后，加入100mL乙醚，過濾除去不溶物后轉(zhuǎn)至250mL分液漏斗中，乙醚層用100mL 3.6％(質(zhì)量百分含量)HCl洗滌2次，再用100mL水洗滌2次。MgSO4干燥，濃縮，得淡黃色粘稠物，用CH2Cl2溶解后，用薄層色譜(TLC)對產(chǎn)物進行分離(展開劑各成分體積比為CH2Cl2∶四氫呋喃(THF)∶CH3OH＝95∶5∶5)。TLC出現(xiàn)三條區(qū)帶，將中間最大的區(qū)帶刮下，用CH2Cl2和CH3OH(體積比為1∶1)淋洗，減壓濃縮，真空干燥24h(避光)得到5-o-t-BuM2Si-AVM-″-o-succinoyl。
(3)將步驟2)得到的產(chǎn)物脫去保護基5-o-t-BuM2Si，得到4″-o-succinoyl-AVM，即為阿維菌素半抗原。
包被原的制備本試驗采用N-羥基琥珀酰亞胺酯法(NHS)將阿維菌素半抗原與載體蛋白卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，得到OVA-AVM偶聯(lián)物即為包被原。
包被原合成的具體步驟如下 1)取12mg阿維菌素半抗原置于5mL圓底燒瓶中，加0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)使阿維菌素半抗原溶解，再加入2.7mg N-羥基琥珀酰亞胺酯和4.7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)，混合后，室溫(18-20℃)避光攪拌10小時。
2)攪拌下，在1h內(nèi)將步驟1)得到的反應(yīng)液逐滴加到6mL含30mg OVA和0.6ml DMF的硼酸鹽緩沖液(0.2M，pH 9.4)。溶液開始略顯混濁，最后有少量沉淀出現(xiàn)，繼續(xù)攪拌1小時，再轉(zhuǎn)至4℃下攪拌10-12小時，立即進行下述透析純化。
3)將步驟2)得到的反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋(截止分子量10,000Da)4℃攪拌下，透析2d，其間換PBS三次。將透析物1000rpm離心5min，除去沉淀，得到的上清液即為包被原OVA-AVM偶聯(lián)物。
通過紫外分光光度法測定特定吸收值，再根據(jù)朗伯-比爾定律計算反應(yīng)產(chǎn)物的偶聯(lián)比，結(jié)果表明卵清蛋白和阿維菌素半抗原的偶聯(lián)比率為卵清蛋白阿維菌素半抗原＝1∶11，偶聯(lián)物的濃度為3.8mg/mL。
1.2、鹽霉素包被原的制備 半抗原的合成將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)合成鹽霉素半抗原。具體步驟為將鹽霉素和對氨基苯甲酸按1∶1比例混合攪拌反應(yīng)，室溫下反應(yīng)過夜，得到鹽霉素半抗原。
包被原的合成采用混合酸酐法將鹽霉素半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原。
包被原的具體制備方法如下 (1)取鹽霉素半抗原2g溶于30ml，50％的N，N’-二甲基甲酰胺溶液中； (2)取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中，加到步驟1)得到的半抗原溶液中，室溫攪拌反應(yīng)4小時； (3)取卵清蛋白22g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中； (4)將步驟(3)得到的卵清蛋白滴加到步驟(2)得到的半抗原溶液中，4℃攪拌過夜； (5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物用0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次，即得到鹽霉素包被原。
通過紫外分光光度法測定特定吸收值，再根據(jù)朗伯-比爾定律計算反應(yīng)產(chǎn)物的偶聯(lián)比，結(jié)果表明卵清蛋白(OVA)和鹽霉素半抗原的偶聯(lián)比率為卵清蛋白∶鹽霉素半抗原＝1∶9，偶聯(lián)物的濃度為4.5mg/mL。
1.3、磺胺喹噁啉包被原的制備 (1)磺胺喹噁啉半抗原的合成方法將磺胺喹噁啉和對羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)合成磺胺喹噁啉半抗原，給磺胺喹噁啉接出了一個含苯環(huán)的間隔臂，這樣突出了磺胺喹噁啉分子結(jié)構(gòu)中的特征基團——喹噁啉。同時也增加了半抗原的抗原性。
其半抗原的制備的過程為取1g磺胺喹噁啉加入無水乙醇溶解，為溶液I；另取對羧基苯甲醛1g溶于無水乙醇中，為溶液II；將溶液I和溶液II混合，室溫條件下磁力攪拌反應(yīng)2小時，經(jīng)硅膠柱層析分離得到磺胺喹噁啉半抗原。
(2)包被原將磺胺喹噁啉半抗原和人血清白蛋白(HSA)水溶性碳化二亞胺法進行偶聯(lián)得到。
包被原的具體制備方法如下取磺胺喹噁啉半抗原300mg和人血清白蛋白(HSA)500mg混合溶于50ml水，加入EDC 100μl室溫攪拌過夜，得到磺胺喹噁啉包被原。
通過紫外分光光度法測定特定吸收值，再根據(jù)朗伯-比爾定律計算反應(yīng)產(chǎn)物的偶聯(lián)比，結(jié)果表明人血清白蛋白(HSA)和磺胺喹噁啉半抗原的偶聯(lián)比率為人血清白蛋白∶磺胺喹噁啉半抗原＝1∶13，偶聯(lián)物的濃度為4.2mg/mL。
2、包被阿維菌素包被原、鹽霉素包被原和磺胺喹噁啉包被原的酶標(biāo)板的制備 用包被緩沖液稀釋阿維菌素包被原，得到阿維菌素包被原溶液，其中阿維菌素包被原的濃度為0.76μg/mL。
用包被緩沖液稀釋鹽霉素包被原，得到鹽霉素包被原溶液，其中鹽霉素包被原的濃度為1.2μg/mL。
用包被緩沖液稀釋磺胺喹噁啉包被原，得到磺胺喹噁啉包被原溶液，其中磺胺喹噁啉包被原的濃度為1.0μg/mL。
在白色不透明96孔酶標(biāo)板的同一孔中加入阿維菌素包被原溶液40μl、鹽霉素包被原溶液40μl和磺胺喹噁啉包被原溶液40μL，同一孔中鹽霉素包被原、阿維菌素包被原和磺胺喹噁啉包被原的物質(zhì)的量比為1∶1∶1；在pH值9.6、37℃條件下包被2小時；取出，甩干孔內(nèi)包被液，加入洗滌液260μL/孔，室溫反應(yīng)3~4分鐘，倒出孔內(nèi)液體，拍干；加入封閉液，180μL/孔，37℃封閉2小時，倒出孔內(nèi)液體，拍干。用鋁膜真空密封保存。
包被緩沖液組成碳酸鈉1.59g；碳酸氫鈉2.9g；去離子水1000mL。
洗滌液組成氯化鈉320g；磷酸氫二鉀10g；氯化鉀0.18g；十二水合磷酸二氫鈉116g；吐溫-20100mL；Proclin300 1.5mL；去離子水4900mL； 封閉液組成蔗糖50g；十二水合磷酸二氫鈉5.8g；小牛血清50mL；Proclin300300μL；去離子水950mL； (二)發(fā)光復(fù)合物的制備 1、鹽霉素單克隆抗體與“量子點與羊抗鼠抗體復(fù)合物”的結(jié)合物； 量子點的表征1、量子點的組成核為CdSe，殼為ZnS；2、量子點的直徑10~15nm；3、量子點的發(fā)光情況橙色熒光；4、在酶標(biāo)儀檢測的波長(即激發(fā)波長400nm)下，量子點的特征發(fā)射波長585nm。
上述量子點為表面氨基修飾的量子點，購自invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號Cat.No.Q21511MP； 量子點與羊抗鼠抗體的復(fù)合物的制備 (1)活化量子點表面氨基(-NH2)修飾的水溶性QDs 2ml經(jīng)20μl偶聯(lián)劑SMCC(琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷)活化，形成活性表面，得到活化的量子點。凝膠柱去除過量的SMCC。
(2)還原羊抗鼠抗體羊抗鼠抗體2ml中加入還原劑DTT 25μl(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)，斷開二硫鍵形成的巰基。凝膠柱去除DTT。
(3)將活化的量子點和還原的羊抗鼠抗體混合，37℃反應(yīng)1小時，10μl beta-巰基乙醇終止反應(yīng)，形成量子點標(biāo)記的羊抗鼠抗體。最終的反應(yīng)溶液經(jīng)凝膠柱分離純化，收集量子點與羊抗鼠抗體復(fù)合物，利用紫外分光光度儀測定濃度。
鹽霉素單克隆抗體的制備將保藏編號為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。
所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％，使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為2mg/L；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
鹽霉素單克隆抗體與“量子點與羊抗鼠抗體復(fù)合物”的結(jié)合物的制備取鹽霉素單克隆抗體工作液(A液)5ml，加入量子點與羊抗鼠抗體復(fù)合物(B液)3ml(即反應(yīng)物中，鹽霉素單克隆抗體與羊抗鼠抗體的摩爾比為1∶1.5)，輕輕混合，室溫下孵育20min后，4℃，避光保存。
2、“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點的復(fù)合物”的結(jié)合物； 量子點的表征1、量子點的組成核為CdSe，殼為ZnS；2、量子點的直徑10~15nm；3、量子點的發(fā)光情況綠色熒光；4、在酶標(biāo)儀檢測的波長(即激發(fā)波長400nm)下，量子點的特征發(fā)射波長525nm。
上述量子點為表面羧基修飾的量子點，購自invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為Cat.No.Q21541MP； 阿維菌素單克隆抗體的制備將保藏編號為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細胞株置于細胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。
所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％，使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為2mg/L；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物的制備將阿維菌素單克隆抗體用0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5mol/L硼酸緩沖液(pH 8.6)稀釋到1mg/m L，對抗體充分透析。用1ml DMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)1mg，向1ml抗體溶液(即一抗蛋白質(zhì)1mg)加入120μl NHSB溶液(即NHSB 120μg)；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2~4小時；加入9.6μl1mol/l NH4Cl水溶液(即每25μgNHSB加1μl NH4Cl水溶液)，在室溫下攪拌10分鐘；在4℃，超濾除去游離的生物素；將樣品上1ml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1ml/管，蛋白質(zhì)在1~3ml之間洗下，得到一抗與生物素的復(fù)合物；最后，樣品加入疊氮鈉(疊氮鈉在樣品中的終濃度0.5g/L)及BSA(BSA在樣品中的終濃度為1.0g/L)。將產(chǎn)物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。
親和素與量子點的復(fù)合物的制備用磷酸緩沖液(PBS 0.1mol/L，pH＝8.2)將量子點進行10倍稀釋成濃度為0.08μM，加入100μL濃度為5.0g/L的EDC，室溫下攪拌1min后，并向其加入5mg的鏈親和素，室溫下攪拌反應(yīng)2.5h后。經(jīng)過Sephadex G2100層析柱進行分離純化，得到得到量子點標(biāo)記的鏈親和素溶液，將產(chǎn)物置4℃，避光保存。
“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點的復(fù)合物”的結(jié)合物的制備取“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”(C液)5ml，加入“親和素與量子點的復(fù)合物”(D液)3ml(即反應(yīng)物中，生物素和親和素的摩爾比為1∶1)，輕輕混合，室溫下孵育20min后，得到“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點的復(fù)合物”的結(jié)合物；4℃，避光保存。
3、磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點的復(fù)合物”的結(jié)合物 金黃色葡萄球菌A蛋白即為SPA； 量子點的表征1、量子點的組成核為CdSe，殼為ZnS；2、量子點的直徑10~15nm；3、量子點的發(fā)光情況紅色熒光；4、在酶標(biāo)儀檢測的波長(即激發(fā)波長400nm)下，量子點的特征發(fā)射波長655nm。
上述量子點為表面氨基修飾的量子點，購自invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為Cat.No.Q21521MP； 磺胺喹噁啉單克隆抗體的制備將保藏編號為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。
所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％(體積百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為2mg/L；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
“SPA與量子點的復(fù)合物”的制備取氨基修飾的量子點溶于0.2ml的25％戊二醛溶液中(以0.1M、pH值為6.8的PBS緩沖液配制)，蓋好瓶蓋。室溫放置18小時(防止干燥，可放在溫盒中)。于4℃下對1000ml生理鹽水透析三天，換水3~4次，以除去游離的戊二醛，然后加生理鹽水至1ml。加1ml濃度為5mg/ml的SPA生理鹽水溶液。加0.1ml 1.0M碳酸鹽緩沖液(pH9.5)，混勻，4℃冰箱內(nèi)靜置24小時。加0.1ml、0.2M賴氨酸水溶液，混勻后室溫靜置2小時，以封閉戊二醛上多余的醛基。1000ml 0.02M PBS緩沖液(pH7.4)透析24小時。攪拌下逐滴加等量100％飽和度的硫酸銨，4℃冰箱內(nèi)靜置60分鐘后，離心3000rpm，30分鐘(或4000rpm，15分鐘)，收集沉淀，沉淀即為SPA與量子點的復(fù)合物。沉淀用50％飽和度的硫酸胺洗2次。將沉淀溶于少量0.02M PBS緩沖液(pH7.4)中。4℃PBS緩沖液透析24小時，中間換液三次。結(jié)合物4℃，避光保存。
磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點的復(fù)合物”的結(jié)合物的制備取磺胺喹噁啉單克隆抗體(E液)5ml，加入“SPA與量子點的復(fù)合物”溶液(F液)3ml(即反應(yīng)物中，磺胺喹噁啉單克隆抗體與SPA的摩爾比為1∶2)，輕輕混合，室溫下孵育20min后，得到磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點的復(fù)合物”的結(jié)合物，4℃，避光保存。
實施例2、檢測方法 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 向包被有三種包被原的酶標(biāo)板的同一微孔中加入鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μl、阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μl、磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μl，隨后相繼加入三種發(fā)光復(fù)合物各40μl，37℃溫育30分鐘，倒出孔內(nèi)液體，260μl/孔洗滌4次，拍干。設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長(激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長鹽霉素發(fā)光復(fù)合物對應(yīng)的發(fā)射波長585nm；阿維菌素復(fù)合物對應(yīng)的發(fā)射波長525nm；磺胺喹噁啉發(fā)光復(fù)合物對應(yīng)的發(fā)射波長655nm；)，多功能酶標(biāo)儀進行讀數(shù)，測定相對熒光強度。
鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液設(shè)如下不同濃度0、0.2、1、5、25、125μg/l； 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液設(shè)如下不同濃度0、0.2、1、5、25、125μg/l； 磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液設(shè)如下不同濃度0、0.2、1、5、25、125μg/l； 對于每種標(biāo)準(zhǔn)品而言，用每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相對熒光強度平均值(F)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的相對熒光強度(F0)再乘以100％，得到百分相對熒光強度值。以該種標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分相對熒光強度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品、阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品、磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。
百分相對熒光強度值(％)＝(F/F0)×100％。
2、對檢測樣本溶液進行檢測 向包被有三種包被原的酶標(biāo)板同一微孔中加入檢測樣本溶液50μl，隨后相繼加入三種發(fā)光復(fù)合物各40μl，37℃溫育30分鐘，倒出孔內(nèi)液體，260μl/孔洗滌4次，拍干。設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長，多功能酶標(biāo)儀進行讀數(shù)，測定相對熒光強度。
結(jié)果判斷用加入檢測樣本溶液的孔中鹽霉素包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度平均值(F)除以第一個鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的相對熒光強度值(F0)再乘以100％，得到百分相對熒光強度值。將百分相對熒光強度值與鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線中的百分相對熒光強度值對應(yīng)，則從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出該檢測樣本中鹽霉素的殘留量。同理，得到該檢測樣本中阿維菌素、磺胺喹噁啉的殘留量。
3、樣品前處理 在檢測前，可對待檢測樣品進行前處理，例如牛奶樣品的處理如下 對牛奶樣品進行脫脂(4000rmp離心5min)后，棄去上層脂類物質(zhì)，用吸管吸取2ml至50ml聚苯乙烯離心管中，加入0.1mol/l pH7.2的PBS溶液按1∶9進行稀釋，混勻后取50μl分析。
實施例3、試劑盒的效果 (一)靈敏度(IC50和檢測限) 評價競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗反應(yīng)靈敏度的方法，常用的有IC50抑制濃度(指標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的50％處所對應(yīng)的藥物濃度)和檢測限，兩者值越低說明方法的靈敏度越高。檢測限的定義有多種，本實驗中檢測限的定義為20份空白樣品或零標(biāo)準(zhǔn)品的測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為方法的檢測限。
根據(jù)實驗二中的三種標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到三種物質(zhì)對應(yīng)的IC50抑制濃度，如表1-3所示。
將20份不含阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的牛奶樣品分別按照實施例2中所述方法進行前處理，然后按照實施例2中所述方法進行檢測，計算檢測限。結(jié)果如表4-表6所示。
表1阿維菌素類IC50統(tǒng)計表μg/l
表2鹽霉素IC50統(tǒng)計表μg/l
表3磺胺喹噁啉IC50統(tǒng)計表μg/l
表4阿維菌素空白牛奶測定結(jié)果統(tǒng)計表μg/l
表5鹽霉素空白牛奶測定結(jié)果統(tǒng)計表μg/l
表6磺胺喹噁啉空白牛奶測定結(jié)果統(tǒng)計表μg/l
結(jié)果表明，本方法對阿維菌素檢測的IC50在2.0μg/l左右，對牛奶樣品中阿維菌素的檢測限為0.5μg/l；對鹽霉素檢測的IC50在1.5μg/l左右，對牛奶樣品中鹽霉素的檢測限為0.4μg/l；對磺胺喹噁啉檢測的IC50在1.0μg/l左右，對牛奶樣品中磺胺喹噁啉的檢測限為0.15μg/l。
(二)添加回收率試驗 向同一份不含阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的空白牛奶樣品中，添加阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉三種標(biāo)準(zhǔn)品，使牛奶樣品中阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的濃度分別為1μg/l和2μg/l；將添加后的樣品按照實施例2中樣品前處理方法進行前處理，得到樣本溶液，再按照實施例2中檢測方法進行檢測。每個濃度做5個平行，分別計算每種添加物質(zhì)的回收率(回收率＝實測值/添加值)。
結(jié)果見表7。
表7樣本回收率測定
結(jié)果表明，牛奶樣品中三種物質(zhì)的添加回收率在73.5％~97.2％之間，符合準(zhǔn)確度的測定標(biāo)準(zhǔn)。
(三)精密度試驗 向同一份不含阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的空白牛奶樣品中，添加阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉三種標(biāo)準(zhǔn)品，使牛奶樣品中阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的濃度分別為4.0μg/l；將添加后的樣品按照實施例2中樣品前處理方法進行前處理，得到樣本溶液，再按照實施例2中檢測方法進行檢測。每個實驗重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表8、9、10。
板內(nèi)變異系數(shù)的計算方法板內(nèi)變異系數(shù)＝同一次測定的同一塊板內(nèi)某樣本(一般為中等水平)重復(fù)測定次數(shù)所得結(jié)果的變異系數(shù)。
批內(nèi)變異系數(shù)的計算方法批內(nèi)變異系數(shù)＝同一次測定中各平行樣本的變異系數(shù)。
批間變異系數(shù)的計算方法批間變異系數(shù)＝同一樣本在不同批次測定結(jié)果的變異系數(shù)，取其平均值。
表8添加阿維菌素的精密度試驗結(jié)果(添加濃度4.0μg/l)
表9添加鹽霉素的精密度試驗結(jié)果(添加濃度4.0μg/l)
表10添加磺胺喹噁啉的精密度試驗結(jié)果(添加濃度4.0μg/l)

結(jié)果，本試劑盒添加阿維菌素類藥物樣品的精密度在4.7％~10.2％之間，添加鹽霉素藥物樣品精密度在5.5％~9.6％，添加磺胺喹噁啉藥物樣品精密度在3.4％~9.2％，滿足殘留檢測需求。
(四)交叉反應(yīng)率試驗 選擇與待測藥物類似結(jié)構(gòu)的化合物和臨床使用的代表獸藥，測定交叉反應(yīng)率。通過各種標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計算該方法對其它類似物的交叉反應(yīng)率。

結(jié)果如表11所示。
表11交叉反應(yīng)率 結(jié)果表明，本方法對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、愛普菌素、磺胺喹噁啉和鹽霉素的特異性好，可以用于對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、愛普菌素、磺胺喹噁啉和鹽霉素藥物的同步測定。
權(quán)利要求
1.一種免疫試劑盒，包括不透明微孔板和發(fā)光復(fù)合物，所述不透明微孔板中至少有一個孔包被有三種小分子物質(zhì)包被原；
所述三種小分子物質(zhì)包被原選自如下任意一種且不相同小分子物質(zhì)I的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、小分子物質(zhì)II的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物和小分子物質(zhì)III的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III不相同；
所述發(fā)光復(fù)合物為如下1)、2)和3)所示
1)抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗抗體和量子點I形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物I；其中，量子點I與抗抗體形成復(fù)合物，復(fù)合物再通過抗抗體與抗小分子物質(zhì)I的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)I的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物I；
2)抗小分子物質(zhì)II的抗體、生物素、親和素與量子點II形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物II；其中，抗小分子物質(zhì)II的抗體與生物素形成復(fù)合物I，親和素與量子點II形成復(fù)合物II，復(fù)合物I與復(fù)合物II通過生物素與親和素的相互作用而結(jié)合形成結(jié)合物II；
3)抗小分子物質(zhì)III的抗體、金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點III形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物III；其中，金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點III形成復(fù)合物III，復(fù)合物III再通過金黃色葡萄球菌A蛋白與抗小分子物質(zhì)III的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)III的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物III；
所述量子點I、量子點II和量子點III在相同的激發(fā)波長下具有不同的特征發(fā)射波長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫試劑盒，其特征在于所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III為對人體或動物體有危害的小分子物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫試劑盒，其特征在于所述免疫試劑盒中包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣品稀釋液；
所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血藍蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的免疫試劑盒，其特征在于所述對人體或動物體有危害的小分子物質(zhì)為磺胺藥物、喹諾酮藥物、聚醚類藥物、阿維菌素類藥物、氯霉素類藥物、四環(huán)素類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、氨基糖苷類藥物、青霉素類藥物、鏈霉素藥物、蘇丹紅、孔雀石綠或三聚氰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述聚醚類藥物為鹽霉素；所述磺胺藥物為磺胺喹噁啉；所述阿維菌素類藥物為阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素；
所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III選自如下a)、b)和c)中的任意一種且不相同a)鹽霉素，b)磺胺喹噁啉，c)阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素；
所述抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗小分子物質(zhì)II的抗體和抗小分子物質(zhì)III的抗體選自如下任意一種且不相同由保藏編號為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3分泌得到的單克隆抗體、由保藏編號為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細胞株A-1-4分泌得到的單克隆抗體和由保藏編號為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細胞株A-4-1分泌得到的單克隆抗體；
所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下1)、2)和3)所示
1)如下各濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；
2)如下各濃度的鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；
3)如下各濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述量子點為具有如下發(fā)射波長的量子點525nm、585nm或655nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述不透明微孔板中，所述三種小分子物質(zhì)包被原的量分別為(48-50)ng/孔、(38-42)ng/孔和(28-32)ng/孔。
9.一種檢測樣品中對人體或動物體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法，是用權(quán)利要求1-8中任一所述免疫試劑盒對待測樣品進行檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟
1)制作權(quán)利要求1-8中任一所述免疫試劑盒中的每種小分子物質(zhì)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值、所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的對數(shù)值或所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的半對數(shù)值，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為各所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度；
2)向權(quán)利要求1-8中任一所述免疫試劑盒中的不透明微孔板的孔中加入待測樣品的溶液，再加入所述免疫試劑盒中的三種發(fā)光復(fù)合物，孵育；檢測孔中各種所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度；
3)將步驟2)中得到的小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對熒光強度與步驟1)中的小分子物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相對熒光強度進行比較，得出所測樣品中小分子物質(zhì)的濃度值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測對人體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法及其專用試劑盒。該免疫試劑盒，包括同一孔中同時包被三種小分子物質(zhì)包被原的不透明微孔板和發(fā)光復(fù)合物。本發(fā)明充分利用了QDs的多色標(biāo)記功能，建立簡捷、迅速的新型多殘留檢測試劑盒及方法，將具有不同粒徑的QDs，通過其表面特定的官能團(如氨基)與靶標(biāo)偶聯(lián)，進而間接標(biāo)記獸藥的多抗或單抗，實現(xiàn)多色標(biāo)記。通過分離純化獲得不同熒光特性的量子點-抗體多色標(biāo)記物，并以此為熒光探針，根據(jù)其熒光強度的變化建立同步分析不同類多種抗原成分反應(yīng)體系，實現(xiàn)動物性食品中獸藥等多殘留的同步檢測。且此方法更具有操作簡單，熒光強度高，穩(wěn)定時間長的優(yōu)點。
文檔編號G01N21/64GK101762706SQ20101003361
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者丁雙陽, 肖希龍, 沈建忠, 江海洋, 李建成, 夏曦, 王戰(zhàn)輝, 陳軍霞, 徐飛, 饒欽雄, 李金貴, 朱奎, 李存, 張啟迪 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)