專利名稱：：基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別是涉及一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：癌胚抗原(CEA)是胎兒腸、肝、胰等組織中的一種糖蛋白，分子量1502000kb，正常人血清中很低，發(fā)生癌變后量升高。目前已知在結(jié)腸癌、直腸癌以及內(nèi)胚層來源的其他惡性腫瘤，如食管、胃、肝、胰腺等，在癌變時(shí)也升高了。正常人CEA的指標(biāo)是小于5ng/ml，但抽煙者或部分人的CEA被檢測(cè)出高于5ng/ml也是屬于正常水平。所以CEA不是癌的特異性抗原，而應(yīng)該認(rèn)為是一種癌的相關(guān)抗原。測(cè)定血液中CEA水平可用作癌癥病人的監(jiān)測(cè)、確定治療效果好壞。腫瘤術(shù)后或者藥療之后，血液中CEA水平將下降，手術(shù)成功，CEA將持續(xù)下降直至正常水平。如果手術(shù)失敗，或癌癥復(fù)發(fā)CEA水平將回升到不正常水平。傳統(tǒng)檢測(cè)CEA的方法有化學(xué)發(fā)光免疫定量分析、放射免疫和免疫放射法、酶標(biāo)法等。這些檢測(cè)技術(shù)是用異硫氰酸熒光黃(FITC)、羅丹明(RB2。。)標(biāo)記特異抗體(Ab)，然后作固相熒光染色，最后用酶標(biāo)儀測(cè)其熒光強(qiáng)度從而確定抗原含量。但是，它們?cè)诠鈱W(xué)性能和光化學(xué)穩(wěn)定性方面存在很多局限性，如發(fā)光時(shí)間短、光穩(wěn)定性不好、激發(fā)光譜短和發(fā)射光譜長(zhǎng)。Fe304是一種重要的鐵的氧化物，是應(yīng)用最為廣泛的軟磁性材料之一。以磁流體形式存在的Fe304納米粒子在液體中具有一般的液體屬性和順磁性，在外加磁場(chǎng)的情況下，能發(fā)生定向移動(dòng)。并且？6304納米粒子經(jīng)過表面修飾能夠和多種生物分子相連接，在外加磁場(chǎng)的作用下，能夠?qū)崿F(xiàn)這些生物分子的固定化或者純化。CdTe量子點(diǎn)是一種熒光半導(dǎo)體納米晶，量子點(diǎn)具有強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好、能夠用一種波長(zhǎng)的光源激發(fā)多種波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)隨著粒徑的增大而有規(guī)律地紅移等熒光特性。水相合成的CdTe量子點(diǎn)親水性好，經(jīng)過表面修飾以后，能夠和多種生物分子相互作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，可以讓很多癌癥初期的病人較簡(jiǎn)易地檢測(cè)到病情。本發(fā)明的一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原的檢測(cè)方法，包括(l)Fe304/Si02核殼-第一抗體復(fù)合物的制備(a)共沉淀方法制備Fe304顆粒取超純水，抽真空20min后充氮?dú)?0min，將Fe3+鹽和Fe2+鹽溶于超純水中，再向其中加入過量的濃氨水得到黑色的沉淀，結(jié)合磁分離用去離子水洗滌沉淀3-5次；(b)溶膠-凝膠法制備Fe304/Si02核殼結(jié)構(gòu)將2.3ml無水乙醇、2.5mL去離子水和0.7mg油酸鈉充分混合，加入7mg四氧化三鐵納米顆粒，攪拌后加入10yL交聯(lián)劑Y-縮水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷(GMPS)，超聲15min后加入100iiL正硅酸乙酯(TE0S)，攪拌lh之后逐滴加入濃氨水，攪拌20h即得到Fe304/Si02核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒；(c)Fe304/Si02核殼納米顆粒與第一抗體的結(jié)合將上述Fe304/Si02溶于10ml含5%y_縮水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷(GPMS)的甲苯溶液中，磁力攪拌反應(yīng)12-24h，然后用甲苯和乙醇的混合物洗滌沒有偶聯(lián)的y-縮水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷(GPMS)，之后溶于10mlPBS緩沖液中，然后加入抗人癌胚抗體，在4t:條件下，反應(yīng)12-24h，再用PBS緩沖液結(jié)合磁分離洗3遍，即制得Fe304/Si02-抗體復(fù)合物；(2)CdTe-第二抗體復(fù)合物的制備(a)水熱法制備CdTe量子點(diǎn)在飽含N2的硼酸-檸檬酸鈉的緩沖溶液中，分別加入0.04MCdCl22.5H20、0.01MNa2Te03、0.12M巰基乙酸(TGA)、20mgNaBH4，在95IO(TC下煮沸l(wèi)h;(b)CdTe-第二抗體復(fù)合物的制備在上述CdTe量子點(diǎn)中加入O.05MN_羥基丁二酰亞胺(NHS)，在37°C下活化10min，再加入抗人癌胚抗體和0.05M碳二亞胺(EDC)，在37°C條件下反應(yīng)0.5h，加入1M甘氨酸終止反應(yīng)，最后用PBS緩沖液定容到lml，4t:放置12-24h;之后裝入分子截留量為10-12kD的透析袋中，在濃度為0.02%的巰基乙酸(TGA)的PBS緩沖液中透析12h，每4h換一次緩沖液，將沒有結(jié)合的CdTe、NHS、甘氨酸和沒有反應(yīng)的EDC透析掉；(3)"熒光強(qiáng)度-CEA濃度"標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和計(jì)算工作方程(a)分別取100ii1的上述'卞6304/5102-第一抗體"與1.0ng/ml、2.ng/ml、4.Ong/ml、10.0ng/ml、15.0ng/ml、20.0ng/ml、30.0ng/ml、40.Ong/ml的抗原混合，在室溫下反應(yīng)30min;(b)結(jié)合磁分離，將步驟(a)中物質(zhì)分別用pH7.4的PBS緩沖溶液洗滌2次，定容到1.Oml，然后分別加入上述"CdTe-第二抗體"復(fù)合物200iU，室溫下反應(yīng)30min;(c)結(jié)合磁分離，用pH7.4的PBS緩沖溶液洗滌2次，然后用同樣的緩沖溶液定容到lml，測(cè)熒光；(d)根據(jù)抗原濃度和熒光強(qiáng)度關(guān)系，繪制"熒光強(qiáng)度-CEA濃度"標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；(e)根據(jù)上述工作曲線，算出工作方程Y二A(X-B)，式中Y為CEA的濃度，單位為ng/ml，X為三明治復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，單位為a.u.;(4)測(cè)定所得熒光強(qiáng)度數(shù)值通過工作方程得到病人CEA的含量。所述步驟(1)(a)中的Fe3+鹽為水合FeCl3，F(xiàn)e2+鹽為水合FeS04或FeCl2，F(xiàn)e3+鹽與Fe"鹽摩爾比為2:1，氨水濃度為28%。所述步驟(1)(a)中的Fe3+鹽為FeCl36H20，F(xiàn)e2+鹽為FeS047H20。所述步驟(1)(c)或步驟(2)(b)中的抗人癌胚抗體為鼠抗人癌胚抗體、兔抗人癌胚抗體，其量為100iiL，PBS緩沖液的pH為7.4。所述(2)(a)中的CdCl2與Na2Te03的摩爾比為6.0:1。所述步驟(2)(a)中的硼酸的濃度為15mM，檸檬酸鈉的濃度為15mM。本發(fā)明通過使用處理的半導(dǎo)體量子點(diǎn)來代替FITC、RB，標(biāo)記特異抗體和使用磁分離純化，來解決該免疫分析法的一系列問題，并且用共價(jià)結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)熒光和磁性納米材料與抗體的結(jié)合，與靜電結(jié)合相比，共價(jià)結(jié)合更穩(wěn)定，更有利于富集目標(biāo)物，從而顯著簡(jiǎn)化癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)過程。*^效果本發(fā)明通過使用磁分離純化和處理的半導(dǎo)體量子點(diǎn)來代替用FITC、RB2。。標(biāo)記特異抗體方法，解決該免疫分析法的背景光干擾、選擇性不好等問題，從而富集目標(biāo)物，可以顯著簡(jiǎn)化癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)手段，這種檢測(cè)手段簡(jiǎn)單，并且靈敏度高，可以讓很多癌癥初期的病人較簡(jiǎn)易地檢測(cè)到病情，并及時(shí)采取治療手段，為胃腸道癌癥的臨床檢測(cè)開辟了一條嶄新的道路。圖1為實(shí)施實(shí)例1所制得的Fe304/Si02核殼納米顆粒的透射電鏡圖(TEM);圖2為實(shí)施實(shí)例3所得Fe304/Si02與抗體結(jié)合前后的紅外圖譜變化情況；圖3為實(shí)施實(shí)例4所制得的抗體與量子點(diǎn)結(jié)合前后熒光光譜變化圖4為實(shí)施實(shí)例5所繪制的"熒光強(qiáng)度-CEA濃度"關(guān)系曲線圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(—)Fe304/Si02核殼納米顆粒的制備1.稱取1.08g的FeCl3*6H20和0.555g的FeS047H20，溶解于20ml超純水中，抽真空20min，N2飽和20min;在其加入過量氨水得到黑色沉淀，結(jié)合磁分離，用超純水清洗數(shù)次。2.去步驟1產(chǎn)物7mg與2.3mL無水乙醇、2.5mL去離子水和0.7mg油酸鈉充分混合，磁子攪拌并加入10iiL的GMPS。3.將步驟2混合物超聲15min后加入TEOS100yL，攪拌lh之后逐滴加入28%的氨水10.2mL，攪拌20h即得到Fe304/Si02核殼納米顆粒，結(jié)合磁分離，用超純水清洗數(shù)次。(二)CdTe量子點(diǎn)制備1.將40ml包含15mM硼酸和15mM檸檬酸鈉的緩沖溶液中先抽真空20min再充入氮?dú)?0min。2.在磁力攪拌下，依次加入0.04MCdCl22.5H20溶液，0.01MNa2Te03溶液，1.2MTGA禾P20mgNaBH4。3.磁力攪拌反應(yīng)5min形成清亮的綠色溶液。在95IO(TC沸水浴中回流lh，即制備出CdTe量子點(diǎn)。(三)"Fe304/Si02-第一抗體"復(fù)合物的制備1.將制得的Fe304/Si02溶于10ml含5%GPMS的甲苯溶液中，磁力攪拌過夜反應(yīng)，然后用甲苯和乙醇的混合物洗滌沒有偶聯(lián)的GPMS。2.將上述制備的Fe304/Si02-GPMS溶于10mlPBS緩沖液中，加入100iiL抗體，在4t:條件下，過夜反應(yīng)，再用PBS緩沖液結(jié)合磁分離洗3遍，即制得Fe304/Si02-GPMS-IgG復(fù)合物。再加入200111、5%的BSA，在4t:條件下過夜，沒有參加反應(yīng)的基團(tuán)就被封閉了；(四)"CdTe-第二抗體"復(fù)合物的制備1.500ii1CdTe中加入N_羥基丁二酰亞胺(NHS)，在37。C下活化10min，再加入100ill抗體和碳二亞胺(EDC)，在37t:條件下反應(yīng)0.5h，加入甘氨酸終止反應(yīng)，最后用PBS緩沖液定容到1ml。2.將上述樣品放4t:冰箱過夜。然后裝入分子截留量為10-12kD的透析袋中，在巰基乙酸(TGA)的PBS緩沖液中透析12h，每4h換一次緩沖液。這樣就可以將沒有結(jié)合的CdTe、NHS、甘氨酸和沒有反應(yīng)的EDC透析掉。[OO55](五)"熒光強(qiáng)度-CEA濃度"曲線的制備1.分別取100ii1^'Fe304/Si02-第一抗體"與1.0、2.0、4.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0ng/ml的抗原混合，在室溫下反應(yīng)30min;2.結(jié)合磁分離，將步驟1中的各個(gè)微型離心管樣品用pH7.4的PBS緩沖溶液洗滌2次，然后定溶到1.Oml，然后分別加入"CdTe-第二抗體"復(fù)合物200iU，室溫下反應(yīng)30min;3.結(jié)合磁分離，用pH7.4的PBS緩沖溶液小心洗滌2次，然后用同樣的緩沖溶液定容到lml，測(cè)熒光；4.根據(jù)抗原濃度和熒光強(qiáng)度關(guān)系，繪制"熒光強(qiáng)度-CEA濃度"標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；5.根據(jù)步驟4的工作曲線，算出工作方程Y=A(X-B)，式中Y為CEA的濃度，單位為ng/ml，X為三明治復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度。實(shí)施例2檢測(cè)病人血清中CEA的含量1.取血清1ml，與100ii1的"Fe304/Si02-第一抗體"混合，在室溫下反應(yīng)30min;2.結(jié)合磁分離，將步驟1中的各個(gè)微型離心管樣品用pH7.4的PBS緩沖溶液洗滌2次，然后定溶到1.Oml，然后分別加入"CdTe-第二抗體"復(fù)合物200iU，室溫下反應(yīng)30min;3.結(jié)合磁分離，用pH7.4的PBS緩沖溶液小心洗滌2次，使用該緩沖溶液定容到0.5ml，測(cè)熒光；4.將所得到的結(jié)果帶入工作方程Y=A(X-B)中，計(jì)算出血清中CEA的含量，并將結(jié)果與免疫熒光檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，見表1。表1本發(fā)明的檢測(cè)方法與免疫熒光檢測(cè)結(jié)果對(duì)比7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原CEA的檢測(cè)方法，包括(1)Fe3O4/SiO2核殼一第一抗體復(fù)合物的制備(a)取超純水，抽真空20min后充氮?dú)?0min，將Fe3+鹽和Fe2+鹽溶于超純水中，再向其中加入過量的濃氨水得到黑色的沉淀，結(jié)合磁分離用去離子水洗滌沉淀3-5次，得Fe3O4顆粒；(b)將2.3ml無水乙醇、2.5mL去離子水和0.7mg油酸鈉充分混合，加入7mg四氧化三鐵納米顆粒，攪拌后加入10μL交聯(lián)劑γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷GMPS，超聲15min后加入100μL正硅酸乙酯TEOS，攪拌1h之后逐滴加入濃氨水，攪拌20h，即得Fe3O4/SiO2核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒；(c)將上述Fe3O4/SiO2核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒溶于10ml含5％γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷GPMS的甲苯溶液中，磁力攪拌反應(yīng)12-24h，然后用甲苯和乙醇的混合物洗滌沒有偶聯(lián)的γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷GPMS，之后溶于10mlPBS緩沖液中，然后加入抗人癌胚抗體，在4℃條件下，反應(yīng)12-24h，再用PBS緩沖液結(jié)合磁分離洗3遍，即得Fe3O4/SiO2-抗體復(fù)合物；(2)CdTe-第二抗體復(fù)合物的制備(a)在飽含N2的硼酸-檸檬酸鈉的緩沖溶液中，分別加入0.04MCdCl2·2.5H2O、0.01MNa2TeO3、0.12M巰基乙酸TGA、20mgNaBH4，在95～100℃下煮沸1h，即得CdTe量子點(diǎn)；(b)在上述CdTe量子點(diǎn)中加入0.05MN-羥基丁二酰亞胺NHS，在37℃下活化10min，再加入抗人癌胚抗體和0.05M碳二亞胺EDC，在37℃條件下反應(yīng)0.5h，加入1M甘氨酸終止反應(yīng)，最后用PBS緩沖液定容到1ml，4℃放置12-24h；之后裝入分子截留量為10-12kD的透析袋中，在濃度為0.02％的巰基乙酸TGA的PBS緩沖液中透析12h，每4h換一次緩沖液，即得CdTe-第二抗體復(fù)合物；(3)“熒光強(qiáng)度-CEA濃度”標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和計(jì)算工作方程(a)分別取100μl的上述“Fe3O4/SiO2-第一抗體”與1.0ng/ml、2.ng/ml、4.0ng/ml、10.0ng/ml、15.0ng/ml、20.0ng/ml、30.0ng/ml、40.0ng/ml的抗原混合，在室溫下反應(yīng)30min；(b)結(jié)合磁分離，將步驟(a)中物質(zhì)分別用pH7.4的PBS緩沖溶液洗滌2次，定容到1.0ml，然后分別加入上述“CdTe-第二抗體”復(fù)合物200μl，室溫下反應(yīng)30min；(c)結(jié)合磁分離，用pH7.4的PBS緩沖溶液洗滌2次，然后用同樣的緩沖溶液定容到1ml，測(cè)熒光；(d)根據(jù)抗原濃度和熒光強(qiáng)度關(guān)系，繪制“熒光強(qiáng)度-CEA濃度”標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；(e)根據(jù)上述工作曲線，算出工作方程Y＝A(X-B)，式中Y為CEA的濃度，單位為ng/ml，X為三明治復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，單位為a.u.；(4)測(cè)定所得熒光強(qiáng)度數(shù)值通過工作方程得到病人CEA的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原CEA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(1)(a)中的Fe3+鹽為水合FeCl3，F(xiàn)e2+鹽為水合FeS04或FeCl2，F(xiàn)e3+鹽與Fe2+鹽摩爾比為2:1，氨水濃度為28%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原CEA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(1)(a)中的Fe3+鹽為FeCl36H20，F(xiàn)e2+鹽為FeS047H20。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原CEA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(1)(c)或步驟(2)(b)中的抗人癌胚抗體為鼠抗人癌胚抗體、兔抗人癌胚抗體，其量為100iiL，PBS緩沖液的pH為7.4。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原CEA的檢測(cè)方法，其特征在于所述(2)(a)中的CdCl2與Na2Te03的摩爾比為6.0:1。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原CEA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(2)(a)中的硼酸的濃度為15mM，檸檬酸鈉的濃度為15rnM。全文摘要本發(fā)明涉及一種基于熒光納米發(fā)光和磁性納米材料的癌胚抗原(CEA)的檢測(cè)方法，包括(1)Fe3O4/SiO2核殼-第一抗體復(fù)合物的制備；(2)CdTe-第二抗體復(fù)合物的制備；(3)“熒光強(qiáng)度-CEA濃度”標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和計(jì)算工作方程；(4)測(cè)定所得熒光強(qiáng)度數(shù)值通過工作方程得到病人CEA的含量。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，可以讓很多癌癥初期的病人較簡(jiǎn)易地檢測(cè)到病情。文檔編號(hào)G01N21/64GK101776683SQ20101002245公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年1月6日優(yōu)先權(quán)日2010年1月6日發(fā)明者周興平,李靖申請(qǐng)人:東華大學(xué)