專利名稱：磁性納米材料的新功能及新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料學(xué)、納米生物學(xué)和納米醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及磁性納米材料作為過(guò)氧化物酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磁性納米材料指具有磁響應(yīng)性的納米材料，在外加磁場(chǎng)的作用下這些納米材料具有強(qiáng)的磁響應(yīng)信號(hào)。常用的磁性納米材料為三氧化二鐵、四氧化三鐵、鐵鈷合金等。磁性材料可通過(guò)不同的方法制備出不同尺度(1-1000nm)和不同形貌的納米結(jié)構(gòu)，如零維的納米顆粒，一維的納米線、納米棒，二維的納米薄膜，三維的納米錐等，還可利用有機(jī)高分子包埋技術(shù)在磁性納米顆粒的基礎(chǔ)上制備微米級(jí)的磁性微球。
磁性納米材料具有較好的磁響應(yīng)性，在生物醫(yī)學(xué)和電子等方面應(yīng)用前景廣泛，尤其是生物醫(yī)藥領(lǐng)域。(1)通過(guò)DNA或蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到磁性納米材料表面，結(jié)合納米材料的磁性可以制備親和層析用于生物樣品的快速分離和高效純化(參見(jiàn)，J.M.Nam，C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，Science301，1884(2003)；Q.A.Pankhurstl，J.Connolly，S.K.Jones，J.Dobson，J.Phys.DAppl.Phys.36，R167(2003)；和I.Safarik，M.Safarikova，BiomagnRes Technol.2，7(2004))；(2)通過(guò)磁性納米材料表面進(jìn)行合適的化學(xué)修飾，使材料表面的電荷發(fā)生改變，或者特定的化學(xué)基團(tuán)，可以將藥物分子或基因結(jié)合在材料表面，利用外加磁場(chǎng)的導(dǎo)向，可以將藥物或外源基因向特定的部位進(jìn)行輸送，從而實(shí)現(xiàn)藥物或基因的靶向運(yùn)輸(參見(jiàn)，J.Panyam，V.Labhasetwar，Adv Drug Del Rev 55，329(2003)；和5.N.Morishita，et al.，Biochem Biophys Res Commun.334，1121(2005))；(3)磁性納米顆?？梢杂糜诨铙w或細(xì)胞水平的磁共振成像，建立高空間分辨率的活體實(shí)時(shí)成像技術(shù)，已經(jīng)進(jìn)入臨床用于活體成像診斷(參見(jiàn)，M.G.Harishingani，et al.，N.Engl.J.Med.348，2491(2003)；A.S.Arbab，et al.，Radiology 229，838(2003)；和I.J.de Vries，et al.，Nat Biotechnol.23，1407(2005))；(4)磁性納米材料可以用于腫瘤的治療，通過(guò)藥物靶向和磁靶向把磁性納米顆粒集中在腫瘤部位，在外加磁場(chǎng)的作用下，磁性納米顆粒可以產(chǎn)生高熱，殺死腫瘤部位的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的目的(參見(jiàn)，A.Ito，et al.，Cancer Lett.212，167(2004)；和F.Sonvico，et al.，Bioconjug Chem.16，1181(2005))。上述磁性納米材料的應(yīng)用都是利用了納米材料的磁性特征。
辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是免疫酶標(biāo)技術(shù)中最為常用的工具酶之一，常用于標(biāo)記抗體，在酶聯(lián)免疫分析、免疫印跡和免疫組化等技術(shù)。這種酶含有正鐵原卟啉(血紅素)，能利用過(guò)氧化氫(H2O2)氧化供氫體(DH2，多為無(wú)色的還原型染料)，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過(guò)程如下
HRP的這種催化功能主要是借助正鐵原卟啉中的鐵實(shí)現(xiàn)其催化功能的(參見(jiàn)洪偉杰等，生命的化學(xué)，25，33(2005))，而磁性納米顆粒中含有豐富的鐵，所以具備過(guò)氧化物酶催化功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明突破了磁性納米材料的磁性物理特征，首次發(fā)現(xiàn)這種磁性納米材料具有蛋白酶的催化活性，能夠催化過(guò)氧化氫或其它過(guò)氧化物，從而產(chǎn)生與過(guò)氧化物酶相類似的催化功能，這種催化機(jī)理遵循的是Fenton反應(yīng)機(jī)理(參見(jiàn)V.Kavitha，et al.Chemosphere 55，1235(2004))，即在鐵離子存在下，可以催化H2O2產(chǎn)生自由基。通過(guò)對(duì)磁性納米材料酶學(xué)行為的研究以及與過(guò)氧化物酶的比較，確定磁性納米材料具有過(guò)氧化物酶的酶學(xué)活性。
因此，本發(fā)明提供以下(1)磁性納米材料作為過(guò)氧化物酶的應(yīng)用。
(2)根據(jù)上面(1)所述的應(yīng)用，其中將磁性納米材料用于直接分離和鑒定細(xì)胞、核酸和蛋白質(zhì)；工業(yè)催化和發(fā)酵；監(jiān)測(cè)環(huán)境中有害物質(zhì)；凈化污水；或預(yù)防和控制與自由基相關(guān)的疾病。
(3)根據(jù)上面(2)所述的應(yīng)用，包括以下步驟在H2O2水溶液的存在下，磁性納米材料催化過(guò)氧化物酶的底物，生成相應(yīng)的產(chǎn)物，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產(chǎn)生的自由基，所述的自由基與氫供體底物反應(yīng)，導(dǎo)致氫供體生成有色或發(fā)光產(chǎn)物。
(4)根據(jù)上面(1)-(3)中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述的磁性納米材料為Fe3O4磁性納米顆粒。
(5)根據(jù)上面(3)所述的應(yīng)用，其中H2O2在反應(yīng)混合物中的濃度為0.2μM至1.3μM，并且磁性納米材料催化過(guò)氧化物酶的底物的反應(yīng)是在pH3-6、25-55℃的溫度下進(jìn)行的。
(6)根據(jù)上面(1)所述的應(yīng)用，其中所述的磁性納米材料的粒徑為1-3000nm。
(7)根據(jù)上面(1)所述的應(yīng)用，其中所述的磁性納米材料是被聚乙二醇、葡聚糖、二氧化硅、羥基和氨基修飾的。
(8)根據(jù)上面(1)所述的應(yīng)用，其中所述的過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化物酶。
(9)一種將磁性納米材料用于檢測(cè)和分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標(biāo)記蛋白；標(biāo)記蛋白后的磁性納米材料與其它蛋白結(jié)合；在H2O2水溶液的存在下，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產(chǎn)生自由基與過(guò)氧化物酶底物反應(yīng)，導(dǎo)致顯色反應(yīng)，從而檢測(cè)蛋白的結(jié)合。
(10)一種將磁性納米材料用于檢測(cè)和分離核酸的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標(biāo)記抗生物素蛋白；和標(biāo)記抗生物素蛋白后的磁性納米材料在H2O2水溶液的存在下，與生物素化的DNA探針?lè)肿咏Y(jié)合，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產(chǎn)生自由基與底物反應(yīng)，導(dǎo)致顯色，從而檢測(cè)核酸的結(jié)合。
通過(guò)對(duì)磁性納米材料酶學(xué)行為的研究以及與過(guò)氧化物酶的比較，確定磁性納米材料具有過(guò)氧化物酶的酶學(xué)活性。這一新功能的發(fā)現(xiàn)，使磁性納米材料集磁性和催化活性為一體，豐富了磁性納米材料的新用途，將推動(dòng)磁性納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。例如(1)利用磁性納米材料的磁性和催化活性，直接分離和鑒定細(xì)胞、核酸和蛋白質(zhì)等生物樣品；(2)利用磁性納米材料的催化活性，應(yīng)用于過(guò)氧化物酶所應(yīng)用的工業(yè)催化和發(fā)酵；(3)利用磁性納米材料的酶催化活性，監(jiān)測(cè)環(huán)境中有害物質(zhì)，應(yīng)用于污水凈化等；(4)磁性納米材料應(yīng)用于與自由基相關(guān)的疾病預(yù)防和控制。


圖1.磁性納米顆粒催化底物TMB反應(yīng)產(chǎn)生顏色產(chǎn)物，其中A.不同尺度和形貌的磁性納米材料；B.磁性磁性納米顆粒在H2O2存在的條件下，催化TMB產(chǎn)生顏色反應(yīng)；C.磁性磁性納米顆粒催化反應(yīng)原理。
圖2.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB的表觀酶促動(dòng)力學(xué)曲線，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過(guò)氧化物酶作對(duì)照。
圖3.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB隨H2O2的變化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過(guò)氧化物酶作對(duì)照。
圖4.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB在不同pH體系中的變化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過(guò)氧化物酶作對(duì)照。
圖5.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB隨溫度的變化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過(guò)氧化物酶作對(duì)照。
圖6.不同尺度的磁性納米材料都具有過(guò)氧化物酶活性，但磁性納米顆粒尺度與酶活性成反比，尺度越小，酶活性越高。
圖7.不同基團(tuán)修飾的Fe3O4磁性納米顆粒均具有過(guò)氧化物酶催化活性，然而不同基團(tuán)修飾后的磁性納米顆粒顯示出不同的酶活性。
圖8.磁性納米顆粒作為標(biāo)記物可直接用于探測(cè)蛋白質(zhì)分子相互識(shí)別。
圖9.protein A標(biāo)記的磁性納米顆粒在ELISA中的應(yīng)用。NP-proteinA/BSA作陰性對(duì)照，NP-protein A/mIgG指利用Fe3O4磁性納米顆粒探測(cè)protein A與mIgG的識(shí)別，HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作為陽(yáng)性對(duì)照。
圖10.磁性納米顆粒作為標(biāo)記物可直接用于探測(cè)核酸分子相互識(shí)別。
圖11.avidin標(biāo)記的磁性納米顆粒用于核酸的檢測(cè)，其中NP-avidin指avidin偶聯(lián)的Fe3O4磁性納米顆粒，NP-avidin/biotin-DNA指Fe3O4磁性納米顆粒直接用于檢測(cè)核酸分子，HRP-avidin/biotin-DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。
圖12示意Fe3O4磁性納米顆粒用于分離和檢測(cè)mIgG。
圖13.Fe3O4磁性納米顆粒分離和檢測(cè)mIgG，其中NP-protein A/BSA作陰性對(duì)照，NP-protein A-biotin-mIgG指Fe3O4磁性納米顆粒先分離biotin-mIgG然后再檢測(cè)，HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作為陽(yáng)性對(duì)照。
圖14.Fe3O4磁性納米顆粒分離和檢測(cè)核酸。
圖15.Fe3O4磁性納米顆粒分離和檢測(cè)核酸分子，其中NP-avidin作陰性對(duì)照，NP-avidin-biotin-probe指Fe3O4磁性納米顆粒先分離biotin-DNA然后再檢測(cè)，HRP-avidin/biotin-DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一、磁性納米材料具有催化活性試劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。使用的磁性納米材料是由水熱法合成(參見(jiàn)，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))。
方法取20μg Fe3O4磁性納米材料(25nm，150nm，300nm，2300nm)，溶于500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μlTMB(10mg/ml，溶于二甲亞砜)，觀察顏色反應(yīng)。
結(jié)果在Fe3O4磁性納米材料、H2O2和TMB三者都存在時(shí)，溶液出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)(圖1B)，只有Fe3O4磁性納米材料和H2O2時(shí)沒(méi)有顏色反應(yīng)，只有Fe3O4磁性納米材料和TMB時(shí)沒(méi)有顏色反應(yīng)，只有H2O2和TMB時(shí)沒(méi)有顏色反應(yīng)。磁性納米材料包括不同尺度大小，也包括不同形貌(圖1A)，表明磁性納米材料在H2O2存在下催化TMB產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，遵循Fenton催化反應(yīng)機(jī)理(圖1C)。
實(shí)施例二、磁性納米材料具有過(guò)氧化物酶的催化活性試劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米材料合成材料均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。使用的磁性納米材料是Fe3O4磁性納米顆粒由水熱法合成(參見(jiàn)，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))，納米粒子直徑300nm。
方法在每個(gè)反應(yīng)體系中，取20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶于500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)，加入32μl的30％H2O2，分別加入不同容量(0，0.5，1，2，4，6，8，10μl)的TMB溶液(10mg/ml，溶于DMSO)，日立UV2010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)652nm下的光吸收值，時(shí)間掃描600s，反應(yīng)溫度25℃。辣根過(guò)氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監(jiān)測(cè)催化TMB的過(guò)程。
結(jié)果以反應(yīng)最初20秒內(nèi)652nm光吸收值的變化作圖，計(jì)算其斜率，即可得到反應(yīng)初速度v，然后以TMB摩爾濃度為橫坐標(biāo)，以v為縱坐標(biāo)作圖，經(jīng)origin處理得到酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。米氏方程
v＝Vmax×[S]/(Km+[S])分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4磁性磁性納米顆粒表觀酶促催化動(dòng)力學(xué)曲線與HRP酶促動(dòng)力學(xué)一致，計(jì)算得到的表觀米氏常數(shù)Km(111.3±0.154μM)要小于HRP的Km(492.8±3.91μM)，表明底物與Fe3O4磁性納米顆粒的結(jié)合要優(yōu)于HRP(圖2)。表明Fe3O4磁性納米顆粒具有與HRP相似的活性，表明Fe3O4磁性納米顆粒具有過(guò)氧化物酶活性，分析表明一個(gè)Fe3O4磁性納米顆粒的催化能力相當(dāng)于約45個(gè)HRP分子。
實(shí)施例三、H2O2調(diào)節(jié)Fe3O4磁性納米顆粒催化酶學(xué)反應(yīng)試劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。Fe3O4磁性納米顆粒大小直徑為300nm。
方法取20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶于500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入適量的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亞砜)，日立UV2010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)652nm下的光吸收值，時(shí)間掃描600s，反應(yīng)溫度25℃。Fe3O4磁性納米顆粒催化，加入30％H2O2(μl)濃度梯度0，2，4，8，16，32，64，128。辣根過(guò)氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監(jiān)測(cè)催化TMB的過(guò)程，加入30％H2O2(μl)濃度梯度0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4。
結(jié)果以反應(yīng)最初20秒內(nèi)652nm光吸收值的變化作圖，計(jì)算其斜率，即可得到反應(yīng)初速度v，然后加入H2O2量換算成的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，以v為縱坐標(biāo)作圖，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒對(duì)H2O2的最適濃度在0.2-1.3μM之間，在H2O2低于0.2μM時(shí)催化反應(yīng)速度較低，當(dāng)H2O2高于1.3μM時(shí)催化反應(yīng)受到抑制。而對(duì)于HRP，對(duì)H2O2的最適濃度在2.0-9.0nM之間。Fe3O4磁性納米顆粒與HRP在催化反應(yīng)中對(duì)H2O2的反應(yīng)基本一致，但前者在催化反應(yīng)中需要的H2O2要遠(yuǎn)高于后者(圖3)，同時(shí)表明Fe3O4磁性納米顆粒清除H2O2的能力要高于HRP。
實(shí)施例四、反應(yīng)溶液pH調(diào)節(jié)Fe3O4磁性納米顆粒催化酶學(xué)反應(yīng)試劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。Fe3O4磁性納米顆粒大小直徑為300nm。
方法取20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶于500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液，加入0.5μl的30％H2O2，然后加入的10μl的10mg/ml的TMB(溶于DMSO)，日立UV2010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)652nm下的光吸收值，時(shí)間掃描600s，反應(yīng)溫度25℃。0.2M醋酸鈉緩沖液(pH)1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5。辣根過(guò)氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監(jiān)測(cè)催化TMB的過(guò)程。
結(jié)果以反應(yīng)最初20秒內(nèi)652nm光吸收值的變化作圖，計(jì)算其斜率，即可得到反應(yīng)初速度v，然后以pH為橫坐標(biāo)，以v為縱坐標(biāo)作圖，發(fā)現(xiàn)Fe3O4磁性納米顆粒催化反應(yīng)緩沖液最適pH在3.5-5.5之間，當(dāng)pH低于3或高于6時(shí)，反應(yīng)受到抑制，HRP催化反應(yīng)緩沖液最適pH在3.5-5.5之間。這表明Fe3O4磁性納米顆粒與HRP的最適pH值范圍一致(圖4)，進(jìn)一步表明Fe3O4磁性納米顆粒具有過(guò)氧化物酶活性。
實(shí)施例五、溫度調(diào)節(jié)Fe3O4磁性納米顆粒催化酶學(xué)反應(yīng)試劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。Fe3O4磁性納米顆粒大小直徑為300nm。
方法取20μgFe3O4磁性納米顆粒，溶于500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB，日立UV2010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)652nm下的光吸收值，時(shí)間掃描600s。溫度處理(℃)25，30，35，40，45，50，55。辣根過(guò)氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監(jiān)測(cè)催化TMB的過(guò)程。
結(jié)果以反應(yīng)最初20秒內(nèi)652nm光吸收值的變化作圖，計(jì)算其斜率，即可得到反應(yīng)初速度v，然后以溫度濃度為橫坐標(biāo)，以v為縱坐標(biāo)作圖，發(fā)現(xiàn)Fe3O4磁性納米顆粒和HRP對(duì)反應(yīng)溫度的敏感性一致，其最適溫度基本一致(圖5)，進(jìn)一步表明Fe3O4磁性納米顆粒具有過(guò)氧化物酶活性。
實(shí)施例六、不同尺度的磁性納米材料具有過(guò)氧化物酶的催化活性試劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。
使用的磁性納米材料150nm和300nm的Fe3O4磁性納米顆粒由水熱法合成，25nm的Fe3O4磁性納米顆粒由共沉淀法合成(參見(jiàn)，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))。
方法取300nm大小的20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶于500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)，加入32μl的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亞砜)，日立UV2010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)652nm下的光吸收值，時(shí)間掃描400s，反應(yīng)溫度25℃。150nm和25nm的Fe3O4磁性納米顆粒進(jìn)行相同的操作結(jié)果25nm、150nm和300nm的Fe3O4磁性納米顆粒均具有過(guò)氧化物酶催化活性，在相同質(zhì)量時(shí)，催化活力25nm＞150nm＞300nm(圖6)實(shí)施例七、不同修飾的磁性納米材料具有過(guò)氧化物酶活性試劑葡聚糖(Dextran-40)，聚乙二醇(polyethylene glycol 8000，PEG-8000)，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料及修飾均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。
方法Fe3O4磁性納米顆粒PEG和Dextran修飾參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]，SiO2和NH2修飾參見(jiàn)文獻(xiàn)(P.Tartaj，T.Gonzalez-Carreno，C.J.Serna，Adv Mater 13，1620(2001))。取不同修飾的Fe3O4磁性納米顆粒各20μg，分別溶于500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亞砜)，日立UV2010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)652nm下的光吸收值，時(shí)間掃描400s，反應(yīng)溫度25℃。
結(jié)果不同基團(tuán)修飾的Fe3O4磁性納米顆粒均具有過(guò)氧化物酶催化活性(圖7)。然而，不同的修飾材料影響其酶活性。無(wú)修飾的Fe3O4磁性納米顆粒酶活性最高，其次是葡聚糖修飾高于聚乙二醇修飾，二氧化硅和氨基修飾的磁性納米顆粒酶活力最低。
實(shí)施例八、磁性納米顆粒標(biāo)記用于蛋白檢測(cè)由于Fe3O4磁性納米顆粒具備了HRP的酶催化功能，所以可以應(yīng)用于HRP所應(yīng)用的領(lǐng)域，取代HRP用來(lái)標(biāo)記生物分子，實(shí)現(xiàn)放大信號(hào)的檢測(cè)功能。如圖8示意。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，金黃色葡萄球菌蛋白A(protein A)，生物素(NHS-biotin)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(HRP labeled goatanti-mouse IgG，HRP-GAmIgG)，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見(jiàn)參考文獻(xiàn)(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然后加入protein A使活化的羥基與蛋白中的氨基反應(yīng)，通過(guò)這種共價(jià)偶聯(lián)使protein A固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，形成復(fù)合物NP-protein A。后者與酶標(biāo)二抗類似，能夠通過(guò)與一抗的結(jié)合，直接發(fā)生顯色反應(yīng)。這種protein A修飾的磁性納米顆?？蓱?yīng)用于ELISA、western blot和免疫組織化學(xué)等免疫反應(yīng)。例如，在ELISA實(shí)驗(yàn)中，將鼠IgG(mIgG)包被在ELISA免疫96孔中，經(jīng)3％BSA封閉1小時(shí)，加入NP-protein A在37℃作用1小時(shí)，然后加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min，加入50μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，450nm下檢測(cè)光吸收值。HRP標(biāo)記的羊抗鼠(HRP-GAmIgG)在本實(shí)驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照。牛血清白蛋白(BSA)包被的孔作陰性對(duì)照。
結(jié)果Fe3O4磁性納米顆粒標(biāo)記protein A(NP-protein A)后，能夠與鼠抗體結(jié)合并發(fā)生顯色反應(yīng)，其OD450吸收值與HRP-羊抗鼠二抗顯色的光吸收值相當(dāng)(圖9)，表明Fe3O4磁性納米顆粒可以用于的HRP所應(yīng)用的ELISA等各種免疫檢測(cè)和臨床診斷。
實(shí)施例九、Fe3O4磁性納米顆粒標(biāo)記用于核酸檢測(cè)由于Fe3O4磁性納米顆粒具備HRP的酶催化功能，所以可以應(yīng)用于HRP所應(yīng)用的領(lǐng)域，取代HRP用來(lái)標(biāo)記生物分子，實(shí)現(xiàn)放大信號(hào)的檢測(cè)功能。圖10示意磁性納米顆粒標(biāo)記用于核酸檢測(cè)。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，親和素(avidin)，生物素(NHS-biotin)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素(HRP-avidin)，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購(gòu)自Sigma-Aldrich(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5’-ATCCTTATCAATATT-3’)由賽泰克公司(中國(guó))合成。
方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見(jiàn)參考文獻(xiàn)(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然后加入親和素avidin使活化的羥基與avdin中的氨基反應(yīng)，通過(guò)這種共價(jià)偶聯(lián)使avidin固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，得到NP-avidin復(fù)合物。在ELISA實(shí)驗(yàn)中，將生物素化的DNA探針?lè)肿?biotin-DNA)包被在ELISA免疫96孔中，經(jīng)3％BSA封閉1小時(shí)，加入NP-avidin在37℃作用1小時(shí)，然后加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min，加入50μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，450nm下檢測(cè)光吸收值。HRP-avidin在本實(shí)驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照。BSA包被的孔作陰性對(duì)照。
結(jié)果Fe3O4磁性納米顆粒標(biāo)記avidin后，能夠與生物素化的DNA探針?lè)肿?biotin-DNA)結(jié)合并產(chǎn)生顯色反應(yīng)，其OD450吸收值與HRP-avidin顯色的光吸收值相當(dāng)(圖11)，表明Fe3O4磁性納米顆?？梢杂糜诤怂岬臋z測(cè)。
實(shí)施例十、Fe3O4磁性納米顆粒分離—檢測(cè)蛋白由于Fe3O4磁性納米顆粒具備磁性和催化雙重功能，而磁性使它具備了分離DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等功能，所以將磁性與酶催化活性相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)分離與檢測(cè)的一體化，即分離—檢測(cè)“separation-detection”。如圖12示意Fe3O4磁性納米顆粒用于分離和檢測(cè)mIgG。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，protein A，生物素(NHS-biotin)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(HRP labeled goat anti-mouse IgG，HRP-GAmIgG)，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA)方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見(jiàn)參考文獻(xiàn)(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然后加入protein A使活化的羥基與蛋白中的氨基反應(yīng)，通過(guò)這種共價(jià)偶聯(lián)使protein A固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，形成復(fù)合物NP-protein A。將biotin-mIgG與BSA混合，加入NP-protein A，37℃作用1小時(shí)，然后收集Fe3O4磁性納米顆粒，PBS洗滌三次，得到NP-protein A-biotin-mIgG復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到avidin包被的免疫96孔中，在37℃作用1小時(shí)，然后加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min。加入50μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，450nm下檢測(cè)光吸收值。NP-protein A與BSA混合的樣品作陰性對(duì)照。HRP-GAmIgG作陽(yáng)性對(duì)照，操作是先加入同樣量的biotin-mIgG然后加入HRP-GAmIgG檢測(cè)。
結(jié)果同時(shí)將Fe3O4磁性納米顆粒的分離(separation)與檢測(cè)(detection)功能相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了Fe3O4磁性納米顆粒分離物質(zhì)的直接檢測(cè)，結(jié)果顯示Fe3O4磁性納米顆?！皊eparation-detection”得到的光吸收值與在直接顯色的實(shí)驗(yàn)相當(dāng)(圖13)，表明Fe3O4磁性納米顆粒的分離和檢測(cè)功能可以同時(shí)得到應(yīng)用。
實(shí)施例十一、Fe3O4磁性納米顆粒的分離—檢測(cè)核酸由于Fe3O4磁性納米顆粒還具備獨(dú)特的磁學(xué)性能，而磁性使它具備了分離提出DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等功能，所以將磁性與酶催化相結(jié)合可以實(shí)驗(yàn)分離與檢測(cè)的一體化，即“separation-detection”。如圖14示意。下述實(shí)施例給出了Fe3O4磁性納米顆粒用于分離和檢測(cè)核酸識(shí)別的例證。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，親和素(avidin)，生物素(NHS-biotin)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素(HRP-avidin)，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5’-ATCCTTATCAATATT-3’)and target DNA(5’-GGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3’)由賽泰克公司(中國(guó))合成。
方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見(jiàn)參考文獻(xiàn)(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然后加入親和素avidin(圖14)使活化的羥基與avidin中的氨基反應(yīng)，通過(guò)這種共價(jià)偶聯(lián)使avidin固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，得到NP-avidin復(fù)合物。將生物素化DNA探針(biotin-DNA)與無(wú)關(guān)DNA混合，加入NP-avidin，37℃作用1小時(shí)，然后收集Fe3O4磁性納米顆粒，PBS洗滌三次，得到NP-avidin-biotin-DNA復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到目標(biāo)DNA(target DNA，可以與biotin-DNA配對(duì)識(shí)別雜交)包被的ELISA免疫96孔中(圖14)，在37℃作用1小時(shí)，然后加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min。加入50μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，450nm下檢測(cè)光吸收值。NP-avidin與無(wú)關(guān)DNA混合檢測(cè)作陰性對(duì)照。HRP-avidin作陽(yáng)性對(duì)照，操作是先加入同樣量的biotin-DNA然后加入HRP-avidin檢測(cè)。
結(jié)果同時(shí)將Fe3O4磁性納米顆粒的分離(separation)與檢測(cè)(detection)功能相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了Fe3O4磁性納米顆粒分離物質(zhì)的直接檢測(cè)，結(jié)果顯示Fe3O4磁性納米顆?！皊eparation-detection”得到的光吸收值與在直接顯色的實(shí)驗(yàn)相當(dāng)(圖15)，表明Fe3O4磁性納米顆粒的分離和檢測(cè)功能可以同時(shí)得到應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.磁性納米材料作為過(guò)氧化物酶的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中將磁性納米材料用于直接分離和鑒定細(xì)胞、核酸和蛋白質(zhì)；工業(yè)催化和發(fā)酵；監(jiān)測(cè)環(huán)境中有害物質(zhì)；凈化污水；或預(yù)防和控制與自由基相關(guān)的疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，包括以下步驟在H2O2水溶液的存在下，磁性納米材料催化過(guò)氧化物酶的底物，生成相應(yīng)的產(chǎn)物，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產(chǎn)生的自由基，所述的自由基與氫供體底物反應(yīng)，導(dǎo)致氫供體生成有色或發(fā)光產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述的磁性納米材料為Fe3O4磁性納米顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中H2O2在反應(yīng)混合物中的濃度為0.2μM至1.3μM，并且磁性納米材料催化過(guò)氧化物酶的底物的反應(yīng)是在pH 3-6、25-55℃的溫度下進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的磁性納米材料的粒徑為1-3000nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的磁性納米材料是被聚乙二醇、葡聚糖、二氧化硅、羥基和氨基修飾的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化物酶。
9.一種將磁性納米材料用于檢測(cè)和分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標(biāo)記蛋白；標(biāo)記蛋白后的磁性納米材料與其它蛋白結(jié)合；在H2O2水溶液的存在下，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產(chǎn)生自由基與過(guò)氧化物酶底物反應(yīng)，導(dǎo)致顯色反應(yīng)，從而檢測(cè)蛋白的結(jié)合。
10.一種將磁性納米材料用于檢測(cè)和分離核酸的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標(biāo)記抗生物素蛋白；和標(biāo)記抗生物素蛋白后的磁性納米材料在H2O2水溶液的存在下，與生物素化的DNA探針?lè)肿咏Y(jié)合，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產(chǎn)生自由基與底物反應(yīng)，導(dǎo)致顯色，從而檢測(cè)核酸的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)磁性納米材料具有蛋白酶的催化活性。磁性納米材料在H
文檔編號(hào)C12N9/02GK101037676SQ20061005741
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者閻錫蘊(yùn), 高利增, 聶棱, 王太宏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所