專利名稱：作為心臟疾病標志物的嗜苯胺藍顆粒蛋白酶的制作方法
作為心臟疾病標志物的嗜苯胺藍顆粒蛋白酶本發(fā)明涉及用于檢測和/或測定來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的分析方法，用于患有心臟疾病或病癥的患者的風險分層和/或預后和/或治療控制和/或監(jiān)測。動脈粥樣硬化與血管壁的炎性變化有關(Libby等，Circulation 2005,111, 3481-3488)，包括巨噬細胞和淋巴細胞浸潤。在嗜中性粒細胞計數(shù)與急性冠脈綜合征的未來風險之間存在關聯(lián)(Friedman等，N. Engl. J. Med. 1974 ；290,1275-8) 最近的證據(jù)證實了急性冠脈綜合征中嗜中性粒細胞活性的升高(Naruko等，Circulation 2002，106， 2894-900 ；Buffon 等，N. Engl. J. Med. 2002，347，5-12)。髓過氧化物酶(MPO)是存在于嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒中的一種酶，其可以通過金屬蛋白酶的活化刺激斑塊的去穩(wěn)定作用(Fu等，J Biol Chem 2001，276，41279-87)。 在冠狀動脈疾病中MPO的血漿水平升高Oiang等，JAMA 2001，286，2136-42)，并預測患者出現(xiàn)胸痛(Brennan 等，N Engl J Med 2003，349，1595-604)和急性冠脈綜合征(Baldus 等，Circulation 2003，108，1440-5)的結果。蛋白酶3(冊3)與其他絲氨酸蛋白酶例如彈性蛋白酶和組織蛋白酶G—起，是嗜中性粒細胞嗜苯胺藍顆粒的另一種主要組分(Wmm 等，Nat Rev Immunol 2006,6,541-50) 嗜中性粒細胞對強烈刺激做出響應釋放出嗜苯胺藍顆粒，而刺激較弱時釋放出分泌顆粒(其也含有PR3 (Witko-Sarsat等，Blood 1999， 94,2487-96))。PR3 也可以表達在內皮細胞上(Mayet 等，Blood 1993，82，1221-9)。嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶可以降解細胞外基質；此外PR3具有其他有害效應，其可能與在韋格納(Wegener’ s)肉芽腫中脈管炎的發(fā)病中的作用相關。這些包括通過內皮細胞上的胱天蛋白酶(caspase)樣活性誘導凋亡(Pendergraft 等，Kidney Int. 2004，Jan,65(1), 75-84)，從TNF- α的初生膜結合前體形式釋放活化的TNF- α (Robache-Gallea等，J Biol Chem. 1995，270，23688-92 ；Coeshott 等，PNAS 1999，96，6261-6)，活化前炎性介導物白介素-1β (Coeshott 等，PNAS 1999,96,6261-6)和白介素-18 (Sugawara 等，J Immunol. 2001 Dec 1,167(11) ,6568-75)，以及從血管緊張肽原產(chǎn)生血管緊張肽I和II (Ramaha等，Arch Biochem Biophys. 2002，397，77—83)。PR3通過與α-1-抗胰蛋白酶(絲氨酸蛋白酶抑制劑Al)的不可逆結合而快速失活(Baslund 等，J Immunol Methods 1994，175，215-25 ;Duranton 等，Am J Respir Cell Mol Biol. 2003，29，57-61)，其中絲氨酸蛋白酶與絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)的反應性中心環(huán)反應，產(chǎn)生共價結合的中間體，導致蛋白酶的扭曲和失活(Stratikos等，PNAS, 1997，94，453-8)。因此，血漿中基本上不存在游離冊3，它主要作為冊3_絲氨酸蛋白酶抑制劑 Al 復合物存在(Baslund 等，J Immunol Methods 1994，175，215-25)。循環(huán)中PR3的來源可能部分來自于脫顆粒的活化的嗜中性粒細胞，其存在于嗜苯胺藍顆粒和分泌顆粒兩者中。已知在梗塞形成后，嗜中性粒細胞浸潤心肌?？蛇x地或此外， PR3可以從內皮細胞(Mayet等，Blood 1993，82，1221-9)或肺實質細胞(Brockmann等， Arthritis Res. 2002，4，220-5)分泌。已經(jīng)證實，正常肺中的肺細胞表達PR3 (Brockmann 等，Arthritis Res. 2002，4，220-5)，盡管在韋格納肉芽腫中表達被極大上調?；钚訮R3在
4血漿中被絲氨酸蛋白酶抑制劑Al和α 2-巨球蛋白快速失活(Pham等，Nat Rev Immunol 2006，6，541-50)。在AMI后的情況中，通過釋放活性形式的TNF- α、白介素-1 β、白介素-18 (Robache-Gallea 等，J Biol Chem.1995，270，23688-92 ;Coeshott 等，PNAS 1999， 96，6261-6 ；Sugawara 等，J Immunol. 2001 Dec 1，167 (11)，6568-75)和血管緊張肽 (Ramaha 等，Arch Biochem Biophys. 2002,397,77-83)，已經(jīng)顯示出 PR3 對細胞的破壞性作用，例如其前凋亡活性(Pendergraft等，2004 Jan, 65 (1), 75-84)及其前炎性效應。這些細胞因子可能與盡管使用了腎素_血管緊張肽系統(tǒng)的抑制劑的療法但仍然發(fā)生的AMI后心力衰竭的發(fā)生特別相關。這種絲氨酸蛋白酶在心力衰竭的發(fā)生中的牽連正在討論之中。例如，初步證據(jù)顯示，一種絲氨酸蛋白酶抑制劑elafin能夠在心臟移植的實驗模型中減少血管和心肌損傷(Cowan 等，J Clin Invest. 1996，97，2452-68)。根據(jù)本發(fā)明，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物，可以在心臟疾病或病癥中用作生物標志物。因此，本發(fā)明涉及檢測和/或測定作為心臟疾病中的標志物 的來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平的分析方法。通過該分析方法測量的被分析物水平，可以獨立于已建立的常規(guī)風險因子以及其他生物標志物進行評估。但是，這樣的常規(guī)風險因子和/或其他生物標志物可以與本發(fā)明的分析法或方法或應用組合使用。標志物提供了互補的、獨立的預測，并且這種高風險患者的鑒定可以改進他們的后續(xù)管理。這種分析方法為預測不利后果例如死亡和心力衰竭提供信息，這些信息可以獨立地或與已建立的常規(guī)風險因子例如腎功能和臨床人口統(tǒng)計信息組合應用。這種來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的測量，單獨地或與已承認的預后標志物例如B型利尿鈉肽或其前體(N-末端B型利尿鈉肽原或NTproBNP)、氨基末端ANP原、腎上腺髓質素原或其片段、內皮素原或其片段、血管加壓素原或其片段一起使用，提供了關于AMI后心力衰竭和死亡的預后信息。本發(fā)明的一個實施方案是對患有心臟疾病或病癥的患者進行風險分層和/或預后和/或治療控制和/或監(jiān)測的方法，所述方法包含a)提供來自所述患有心臟疾病或病癥的患者的樣品，b)測定所述樣品中來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平，c)將所述來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平，歸因于所述患者的疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，在步驟b)中測定選自彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、蛋白酶3(Pr3)的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平，并在步驟c)中將其歸因于所述患者的疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，在步驟b)中測定蛋白酶3或蛋白酶3/絲氨酸蛋白酶抑制劑Al復合物的水平，并在步驟c)中將其歸因于所述患者的疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。在本發(fā)明的方法中，更優(yōu)選情況下，在步驟b)中測定蛋白酶3/絲氨酸蛋白酶抑制劑Al復合物的水平，并在步驟c)中將其歸因于所述患者的疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。 在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，心臟疾病或病癥選自急性冠脈綜合征，包括不穩(wěn)定心絞痛(UA)、非ST段升高心肌梗塞(NSTEMI)或ST段升高心肌梗塞 (STEMI)。在本發(fā)明中，心臟疾病或病癥優(yōu)選為急性冠脈綜合征。更優(yōu)選情況下，心臟疾病或病癥是急性心肌梗塞。在本發(fā)明的上下文中使用的診斷分析方法可以是在診斷學領域中應用的任何類型的分析方法，包括但不限于基于酶反應、發(fā)光，特別是熒光或放射化學試劑的分析方法。 優(yōu)選的檢測方法包括床旁檢查(point-of-care-test)、放射免疫分析法、化學發(fā)光和熒光免疫分析法、免疫印跡分析法、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、基于luminex珠子的陣列和蛋白質微陣列分析法。分析方法的類型還可以是基于微量滴定板的、基于芯片的、基于珠子的， 其中生物標志物蛋白可以附著于表面上或在溶液中。分析法可以是均相或非均相分析法、 夾心分析法、競爭和非競爭分析法(《免疫分析法手冊》(The Immunoassay Handbook) ,David Wild 主編，Elsevier LTD, Oxford ；第三版(2005 年 5 月)，ISBN-13 978-0080445267 ； Hultschig C 等，Curr Opin Chem Biol 2006 Feb ； 10(1) :4_10· PMID 16376134)。在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，在步驟b)中使用診斷分析法測定所述樣品中所述蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平。在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，通過使用兩種捕獲分子檢測來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物，其中兩種捕獲分子可以順序或同時添加到樣品中。本發(fā)明的方法的非限制性的實例在步驟b)中，還包含步驟bl)，將所述樣品加入到包含一種或多種針對所述蛋白酶或所述內源抑制劑或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的第一捕獲分子的分析中，以及b2)向所述分析中加入一種或多種針對所述蛋白酶或所述內源抑制劑或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的第二捕獲分子，其中第一捕獲分子和第二捕獲分子可以不都針對抑制劑，其中步驟bl)和b2)可以順序或同時進行。在特別優(yōu)選實施方案中，分析包含作為分散相存在于液體反應混合物中的兩種捕獲分子，在更優(yōu)選為抗體，其中第一標記組分附著于第一捕獲分子上，其中所述第一標記組分是基于熒光或化學發(fā)光_淬滅或擴增的標記系統(tǒng)的一部分，并且所述標記系統(tǒng)的第二標記組分附著于第二捕獲分子上，使得當兩種捕獲分子與所述蛋白酶或所述內源抑制劑或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物結合后，產(chǎn)生可測量的信號，允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心復合物。更優(yōu)選情況下，所述標記系統(tǒng)包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或化學發(fā)光染料、特別是花青素類型的染料的組合。最優(yōu)選情況下，所述標記系統(tǒng)是在BRAHMS AG的Kryptor 技術中應用的系統(tǒng)。在本發(fā)明的方法的另一個更優(yōu)選實施方案中，步驟C)包含cl)測量對應于結合的蛋白酶或結合的其與內源抑制劑的復合物的量的信號，c2)將步驟Cl)的所述信號強度與預先記錄的數(shù)據(jù)進行比較，其中所述預先記錄的數(shù)據(jù)將蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平與疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險相關聯(lián)。在本發(fā)明的方法的另一個更優(yōu)選實施方案中，通過選自下列的方法將蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平與疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險相關聯(lián) 根據(jù)整套預定樣品中蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平的中值進行關聯(lián)；根據(jù)整套預定樣品中蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平的分位數(shù)(例如四分位數(shù)或百分位數(shù))進行關聯(lián)；或使用包含蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的水平的數(shù)學模型、優(yōu)選為 Cox回歸進行關聯(lián)。在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述樣品是血漿樣品、血清樣品、血液樣品或其級份、淋巴液樣品、尿液樣品或任何上面提到的樣品的提取物。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述信號由與所述第二捕獲分子結合的標記物產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，所述信號由與第三捕獲分子結合的標記物產(chǎn)生，其中所述第三捕獲分子特異性針對所述第二捕獲分子，并且其中所述第三捕獲分子在步驟Cl)之前添加到所述分析中。在本發(fā)明的方法中，第三捕獲分子可以在第二捕獲分子之后或與第二捕獲分子同時添加。在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，還附加地測定與患有心臟疾病或病癥的患者的風險分層和/或預后和/或治療控制和/或監(jiān)測相關或有用的一種或多種其他標志物或臨床參數(shù)的水平。在本發(fā)明的方法的另一個更優(yōu)選實施方案中，臨床參數(shù)是選自下列的參數(shù)年齡， 性別，既往病史，特別是心肌梗塞、心絞痛、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、ST上升AMI，體重指數(shù)，遺傳易感性/家族史，種族背景，影響所述傾向的習慣，例如吸煙、飲酒、飲食，或住院治療后的參數(shù)，例如Killip分級高于1或住院后的溶血栓藥物治療。在本發(fā)明的方法的另一個更優(yōu)選實施方案中，其他標志物選自proBNP或其包括 BNP和NT-proBNP的至少12個氨基酸的片段、proANP或其包括NT-proANP和MR-proANP 的至少12個氨基酸的片段、腎上腺髓質素原或其包括腎上腺髓質素、PAMP和MR-proADM 的至少12個氨基酸的片段、內皮素原或其包括內皮素-1、大內皮素-l、CT-proET-l和 NT-proET-Ι的至少12個氨基酸的片段、血管加壓素原或其包括血管加壓素、和肽素和神經(jīng)垂體素2的至少8個氨基酸的片段、髓過氧化物酶、肌鈣蛋白、FABP、C反應蛋白、降鈣素原、 白介素-6、ST-2、⑶F-15、缺血修飾性白蛋白，或其片段。在本發(fā)明的方法的另一個更優(yōu)選實施方案中，其他標志物是NT-proBNP或其至少 12個氨基酸的片段。本發(fā)明的另一個實施方案是使用包含至少一種針對來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶和/或其與內源抑制劑的復合物的捕獲分子的試劑盒，檢測和/或測定所述樣品中所述來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶和/或其與內源抑制劑的復合物的水平，用于患有心臟疾病或病癥的患者的風險分層和/或治療控制和/ 或監(jiān)測和/或預后。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的試劑盒包含一種或多種針對來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或針對所述蛋白酶的內源抑制劑或針對所述蛋白酶與所述內源抑制劑的復合物的第一捕獲分子，并包含一種或多種針對來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍
7顆粒的蛋白酶或針對所述蛋白酶的內源抑制劑或針對所述蛋白酶與所述內源抑制劑的復合物的第二捕獲分子。更優(yōu)選情況下，所述第一捕獲分子和所述第二捕獲分子可以不都針對所述內源抑制劑。更優(yōu)選情況下，本發(fā)明的試劑盒包含分別針對選自彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、蛋白酶3( 的蛋白酶和針對所述蛋白酶的內源抑制劑第一和第二捕獲分子。 更優(yōu)選情況下，本發(fā)明的試劑盒包含分別針對蛋白酶3和絲氨酸蛋白酶抑制劑Al 的捕獲分子。更優(yōu)選情況下，本發(fā)明的試劑盒包含針對蛋白酶3與絲氨酸蛋白酶抑制劑Al的復合物的捕獲分子。在本發(fā)明的試劑盒的應用的另一個具體的優(yōu)選實施方案中，確定疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。在本發(fā)明的方法或試劑盒的應用的具體優(yōu)選實施方案中，所述不利后果是死亡或心力衰竭。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的試劑盒的應用按照上面本發(fā)明方法的實施方案中所述進行。在本發(fā)明的上下文中，捕獲分子可以選自核酸分子、糖類分子、PNA分子、蛋白、抗體、肽或糖蛋白。優(yōu)選情況下，捕獲分子是抗體，包括其對靶具有足夠特異性的片段，并包括重組抗體以及所述抗體的化學和/或生物化學修飾的衍生物或其源自于變體鏈的具有至少12個氨基酸長度的片段。在本發(fā)明的情況中，花青素類型的染料、也稱為花青染料，可以是通用化學結構為Ii2N+ = CH(CH = CH)n-NR2的也稱為開鏈花青素的鏈花青素(str印tocyanine)、通用化學結構為芳基=N+ = CH(CH = CH)n-NR2的半花青素(hemicyanine)或通用化學結構為芳基=N+ = CH (CH = CH)n-N =芳基的閉鏈花青素，其中R獨立地表示可以被一個或多個取代基取代的烷基，并且其中芳基獨立地表示可以被一個或多個取代基取代的芳基或雜芳基。因為這樣的花青染料是公知的，并且許多衍生物可以商購，因此本領域技術人員了解對于給定目的選擇何種公知的染料。因此，在本說明書中將不給出這些染料的詳細描述； 更詳細的描述，包括花青染料的實例，可以在http //en. wikipedia. orR/wiki/Cyanine和 Kirk-Othmer 的《化學技術百禾斗全書》(Encyclopedia of chemical technology)第四版， J. I. Kroschwitz 執(zhí)行主編，Μ. Howe-Grant 主編，John Wiley & Sons, 1993，vol. 7，782-809 頁中發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明中使用的花青染料的具體實例是Cy 3和Cy 5。在本發(fā)明的上下文中，信號是位于用來檢測響應的裝置的靈敏度范圍內的可檢測響應的存在或不存在，其具體來說可歸因于被分析物與捕獲探針或探針之間的復合物的存在。所述信號可歸因于在被分析物檢測方法中常用的各種類型的效應，例如電磁輻射的吸收、發(fā)射或淬滅，其中電磁輻射可以是熒光、發(fā)光、可見光、UV和IR，或歸因于放射活性、磁性或核或電子自旋。在本發(fā)明中，上面提到的被分析物是來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物。在本發(fā)明中，術語風險分層是指為個體經(jīng)歷某些不利事件的概率賦值。在本發(fā)明中，術語預后是指預測對象(例如患者)的醫(yī)學狀況將如何發(fā)展。這可以包括為所述對象估計恢復的機會或不利后果的機會。
在本發(fā)明中，術語監(jiān)測是指通過在各個不同時間點測量對象的醫(yī)學狀況的某個診斷標志物或多種標志物的水平，來觀察所述對象的醫(yī)學狀況的狀態(tài)或發(fā)展。在本發(fā)明中，術語治療控制是指通過在各個不同時間點、優(yōu)選為治療之前和之后測量對象的醫(yī)學狀況的某個診斷標志物或多種標志物的水平，將某種形式的治療例如藥物給藥歸因于所述對象醫(yī)學狀況的狀態(tài)或發(fā)展。通過這種方式，可以確定所述治療是否足以治療所述醫(yī)學狀況，或者療法是否需要做出調整，例如改變藥物的劑量，或是否需要用另一種形式的治療，例如另一種藥物或另一種類型的治療作用來代替。


圖1 顯示了在通過絲氨酸蛋白酶抑制劑Al分層的患者中時間對不利事件 (死亡或心力衰竭)的Kaplan-Meier分析。圖2 顯示了在根據(jù)是否冊3_絲氨酸蛋白酶抑制劑Al和NTproBNP兩者都低于它們相應的中值、任一標志物高于中值或兩種標志物都高于中值進行分層的患者中，時間對不利事件(死亡或心力衰竭)的Kaplan-Meier分析。圖3到7顯示了患者數(shù)據(jù)的邏輯回歸分析的結果圖3a 第4天時NTproBNP和PR3作為死亡的預測因子圖3b 第4天時NTproBNP和PR3作為死亡和心力衰竭的預測因子圖4a =MRproANP與PR3預測死亡終點圖4b =MRproANP與PR3預測死亡和心力衰竭終點圖5a =MRproADM與PR3預測死亡終點圖5b =MRproADM與PR3預測死亡和心力衰竭終點圖6a =C-末端proET與PR3預測死亡終點圖6b =C-末端proET與PR3預測死亡和心力衰竭終點圖7a 和肽素與PR3預測死亡終點圖7b 和肽素與PR3預測死亡和心力衰竭終點圖8到12顯示了患者數(shù)據(jù)的Cox比例風險分析的結果圖8a 第4天時NTproBNP和PR3作為死亡的預測因子圖8b 第4天時NTproBNP和PR3作為死亡和心力衰竭的預測因子圖9a =MRproANP與PR3預測死亡終點圖9b =MRproANP與PR3預測死亡和心力衰竭終點
圖IOa =MRproADM與PR3預測死亡終點圖IOb =MRproADM與PR3預測死亡和心力衰竭終點圖1 la :C-末端proET與PR3預測死亡終點圖lib =C-末端proET與PR3預測死亡和心力衰竭終點圖12a 和肽素與PR3預測死亡終點圖12b 和肽素與PR3預測死亡和心力衰竭終點
實施例
募集了 900位患有急性心肌梗塞的連續(xù)患者。從患者獲得了書面正式知情同意書，研究遵照《赫爾辛基宣言》(Declaration of Helsinki)并得到當?shù)貍惱砦瘑T會的批準。 AMI被定義為出現(xiàn)三個標準判據(jù)中的至少兩個，即適當?shù)陌Y狀、梗塞的急性ECG變化(ST上升或下降，新的左束分支阻塞)以及肌鈣蛋白T升高到超過我們人群的99百分位數(shù)。排除標準判據(jù)包括惡性腫瘤或最近的外科手術(在一個月內)。表1 研究中患者的特征。值是平均值(SD)或數(shù)量(％ )
權利要求
1.一種對患有心臟疾病或病癥的患者進行風險分層和/或預后和/或治療控制和/或監(jiān)測的方法，所述方法包含a)提供來自所述患有心臟疾病或病癥的患者的樣品，b)測定所述樣品中來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平，c)將所述來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平，歸因于所述患者的疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。
2.權利要求1的方法，其中在步驟b)中測定選自彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、蛋白酶 3(Pr3)的蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平，并在步驟c)中將其歸因于所述患者的疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。
3.權利要求1的方法，其中在步驟b)中測定蛋白酶3或蛋白酶3/絲氨酸蛋白酶抑制劑Al復合物的水平，并在步驟c)中將其歸因于所述患者的疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。
4.前述權利要求任一項的方法，其中心臟疾病或病癥選自急性冠脈綜合征，所述急性冠脈綜合征包括不穩(wěn)定心絞痛(UA)、非ST段升高心肌梗塞(NSTEMI)或ST段升高心肌梗塞 (STEMI)。
5.前述權利要求任一項的方法，其中在步驟b)中使用診斷分析法測定所述樣品中所述蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平。
6.前述權利要求任一項的方法，其中通過使用兩種捕獲分子檢測來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物，其中兩種捕獲分子可以順序或同時添加到樣品中。
7.前述權利要求任一項的方法，其中步驟c)包含cl)測量對應于結合的蛋白酶或結合的蛋白酶與內源抑制劑的復合物的量的信號，c2)將步驟cl)的所述信號強度與預先記錄的數(shù)據(jù)進行比較，其中所述預先記錄的數(shù)據(jù)將蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平與疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險相關聯(lián)。
8.權利要求7的方法，其中通過選自下列的方法將蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平與疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險相關聯(lián)根據(jù)整套預定樣品中蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平的中值進行關聯(lián)；根據(jù)整套預定樣品中蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平的分位數(shù)(例如四分位數(shù)或百分位數(shù))進行關聯(lián)；或使用包含蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平的數(shù)學模型、優(yōu)選為Cox回歸進行關聯(lián)。
9.前述權利要求任一項的方法，其中所述樣品是血漿樣品、血清樣品、血液樣品或其級份、淋巴液樣品、尿液樣品或任何上面提到的樣品的提取物。
10.前述權利要求任一項的方法，其中附加地測定與患有心臟疾病或病癥的患者的風險分層和/或預后和/或治療控制和/或監(jiān)測相關或有用的一種或多種其他標志物或臨床參數(shù)的水平。
11.權利要求10的方法，其中臨床參數(shù)是選自下列的參數(shù)年齡，性別，既往病史特別是心肌梗塞、心絞痛、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、ST上升AMI的病史，體重指數(shù)，遺傳易感性/家族史，種族背景，影響所述傾向的習慣例如吸煙、飲酒、飲食，或住院治療后的參數(shù)例如Killip分級> 1或住院后的溶血栓藥物治療。
12.權利要求10或11的方法，其中其他標志物選自proBNP或其包括BNP和NT-proBNP 的至少12個氨基酸的片段、proANP或其包括NT-proANP和MR-proANP的至少12個氨基酸的片段、腎上腺髓質素原或其包括腎上腺髓質素、PAMP和MR-proADM的至少12個氨基酸的片段、內皮素原或其包括內皮素-1、大內皮素-1、CT-proET-Ι和NT-proET-1的至少12個氨基酸的片段、血管加壓素原或其包括血管加壓素、和肽素和神經(jīng)垂體素2的至少8個氨基酸的片段、髓過氧化物酶、肌鈣蛋白、FABP、C反應蛋白、降鈣素原、白介素-6、ST-2、⑶F-15、 缺血修飾性白蛋白，或其片段。
13.權利要求12的方法，其中其他標志物是NT-proBNP或其至少12個氨基酸的片段。
14.試劑盒在患有心臟疾病或病癥的患者的風險分層和/或治療控制和/或監(jiān)測和/ 或預后中的應用，所述試劑盒包含至少一種針對來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶和/或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的捕獲分子，用于檢測和/或測定所述樣品中所述來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶和/或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物的水平。
15.權利要求14的試劑盒的應用，其中確定疾病或病癥的預后或嚴重程度或不利后果的風險。
16.權利要求15的試劑盒的應用或權利要求1到11任一項的方法，其中所述不利后果是死亡或心力衰竭。
17.來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或所述蛋白酶與內源抑制劑的復合物作為心臟疾病或病癥的生物標志物的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測和/或測定來自多形核嗜中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒的蛋白酶或其與內源抑制劑的復合物的分析方法，用于患有心臟疾病或病癥的患者的風險分層和/或預后和/或治療控制和/或監(jiān)測。
文檔編號G01N33/573GK102159953SQ200980137041
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權日2008年7月23日
發(fā)明者安德烈亞斯·貝格曼, 尼爾斯·莫根塔勒, 恩格·梁·洛克, 約阿希姆·斯特魯克 申請人:B.R.A.H.M.S有限公司