專利名稱：表征，特別是定量，由從組織再循環(huán)到血液循環(huán)系統(tǒng)中的血液巨噬細(xì)胞從組織中攝取到細(xì) ...的制作方法
表征，特別是定量，由從組織再循環(huán)到血液循環(huán)系統(tǒng)中的血 液巨噬細(xì)胞從組織中攝取到細(xì)胞內(nèi)的分子標(biāo)志物的方法， 以及用于實(shí)施所述方法的分析設(shè)備本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1的前述部分的用于表征，特別是定量血液的單核白細(xì) 胞(特別是血液巨噬細(xì)胞)的被吞噬的細(xì)胞內(nèi)分子標(biāo)志物的方法；以及根據(jù)權(quán)利要求13的 前述部分的用于實(shí)施所述方法的分析設(shè)備。在全血中，在其表面上表達(dá)蛋白⑶14及⑶16(FcyRIII)的細(xì)胞是可檢測的。 CD14是通常由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白。細(xì)胞表面蛋白CD16使得細(xì)胞 能夠結(jié)合IgG抗體的恒定(Fe)區(qū)，所述CD16以兩種同種型存在在NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞 和所謂的激活的單核細(xì)胞的表面上，作為CDiea(FcYRIIIA)；和在嗜中性粒細(xì)胞上，作為 CD16b (Fe yRIIIB)。根據(jù)傳統(tǒng)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，只有在組織中的巨噬細(xì)胞和血液的所謂的“激活的單核 細(xì)胞”各自既表達(dá)⑶14又表達(dá)⑶16。迄今為止的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)將血液的⑶14/⑶16-陽性 (CD14+CD16+)細(xì)胞絕對地視為“激活的單核細(xì)胞”，其(仍)未遷移到組織中，例如到發(fā)炎、 感染或腫瘤位置處(Ziegler-Heitbrock，L. ,2007. The CD14+CD16+ bloodmonocytes =Their role in infection and inflammation. J. Leukocyte Biol.81,584-592)。然而更新的發(fā)現(xiàn)表明，激活的單核細(xì)胞為從組織再循環(huán)到血液循環(huán)系統(tǒng)中的 巨噬細(xì)胞，其在其細(xì)胞內(nèi)吞噬體中包含組織部分，例如上皮蛋白質(zhì)，所述組織部分例如 源自發(fā)炎或腫瘤位置(Herwig，R.，Horninger, W.，Rehder，P.等人，2005. Ability of PSA-positivecirculating macrophages to detect prostatecaneer. Prostate 62, 290-298 ；Leers, M. P. G. ， Nap, M. ， Herwig, R.等 A, 2008. Circulating PSA-containing macrophages as a possible target forthe detection of prostate cancer :A three-colour/five-parameter flow cytometric study on peripheral blood samples. Am. J. Clin. Pathol. 129,649-656)。與天然的 CD 14-陽性、CD 16-陰性(CD14+CD16)單核 細(xì)胞群體不同，這些細(xì)胞具有完全分化的組織巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，并且由其所包含 的(吞噬的)分子未在單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)(Leers, Μ. P. G.，Nap, Μ.，Herwig, R.等人，2008. Circulating PSA-containing macrophages as a possible target forthe detection of prostate cancer :A three-colour/five-parameter flow cytometric study on peripheral blood samples. Am. J. Clin. Pathol. 129，649—656)。因此，在方法上，不僅為了分析性地檢測，而且還為了分離和富集血液的 CD14+CD16+細(xì)胞，可設(shè)想研究作為所有CD14+細(xì)胞的亞群的CD16+細(xì)胞以及研究作為所有 ⑶16+細(xì)胞的子集的⑶14+細(xì)胞。此外，還已知，激活的單核細(xì)胞或血液巨噬細(xì)胞具有部分地弱的⑶14表 達(dá)(Ziegler-Heitbrock, L. ,2007. The CD14+CD16+ bloodmonocytes :Their role in infection and inflammation. J. Leukocyte Biol. 81，584-592)或者遭受CD14 的完全喪失 (Bazil 禾口 Strominger，1991 Shedding as a mechanism of down-modulationof CD14 on stimulated human monocytes. J. Immunol. 147,1567—1574)。
在其吞噬體中細(xì)胞內(nèi)地包含例如標(biāo)志物蛋白PSA (前列腺特異性抗原)(其因而稱 為imPSA(細(xì)胞內(nèi)巨噬細(xì)胞PSA))的血液巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測可以極其特異地和靈 敏地追蹤前列腺疾病的狀態(tài)，并且在這方面優(yōu)于傳統(tǒng)的對于血清中的PSA的測定(Herwig， R.，Mitteregger，D·，Djavan，B·等人，2008· Detecting prostatecancer by intracellular macrophage prostate-specific antigen (PSA) :A more specific and sensitive marker than conventionalserum total PSA.Eur. J. Clin. Invest· 38，430-437)。細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)表征的基礎(chǔ)是用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體來標(biāo)記待檢測的目標(biāo) 分子(“抗原”)。為了進(jìn)行分析，通過流體動(dòng)力學(xué)聚焦(hydrodynamische Fokussierung) 將處于懸浮中的細(xì)胞引導(dǎo)經(jīng)過具有適當(dāng)波長的集束激光束。由此，熒光染料被激發(fā)從而以 光子的形式發(fā)射出能量，所述光子由檢測儀來記錄。然而，此方法的缺點(diǎn)在于缺乏對于所結(jié)合的抗體的量的定量能力，并因此在于缺 乏關(guān)于所檢測的抗原的量的信息。另一個(gè)缺點(diǎn)為流式細(xì)胞儀的運(yùn)行所引起的可觀的儀器上 和經(jīng)濟(jì)上的花費(fèi)。本發(fā)明的任務(wù)在于提出經(jīng)改進(jìn)的、簡化的和成本低的方法以及分析設(shè)備，在其幫 助下可能定量地表征血液的單核白細(xì)胞，特別是血液巨噬細(xì)胞，包括其的被吞噬的來自組 織的分子標(biāo)志物，這特別地通過表示為“質(zhì)量單位/細(xì)胞數(shù)目”。根據(jù)本發(fā)明，通過根據(jù)權(quán)利要求1的方法以及通過根據(jù)權(quán)利要求13的設(shè)備解決了
這一任務(wù)。特別地，該任務(wù)通過下述方法而得到解決，即表征，特別是定量，由從組織再循環(huán) 到血液循環(huán)系統(tǒng)中的血液巨噬細(xì)胞從組織中攝取到細(xì)胞內(nèi)的分子標(biāo)志物的方法，其中進(jìn)行 下列步驟-向全血施加試劑，所述試劑抑制全血的凝集和/或凝結(jié)；-從全血中選擇和/或富集和/或分離出血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白 細(xì)胞群體；-進(jìn)行所選擇出的血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體的滲透化和/ 或穿孔和/或裂解；-在事先對血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體進(jìn)行穿孔和/或裂解 之后，定性和定量地測定非-血液巨噬細(xì)胞自身的標(biāo)志物，即源自組織的分子標(biāo)志物。一個(gè)根據(jù)本發(fā)明而言原則上的考慮在于，檢測在血液循環(huán)系統(tǒng)的吞噬性單核細(xì)胞 中(即在血液巨噬細(xì)胞中)的分子標(biāo)志物(例如上皮蛋白質(zhì))，其中按照根據(jù)本發(fā)明的方法 有利地可能進(jìn)行直接的和特異性的以及定量的檢測。因此，為了使得能夠檢測血液巨噬細(xì)胞中的分子標(biāo)志物，根據(jù)本發(fā)明設(shè)定，首先從 全血中選擇和/或富集和/或分離出血液巨噬細(xì)胞，其中此后術(shù)語“激活的單核細(xì)胞”和“巨 噬細(xì)胞”理解為與“血液巨噬細(xì)胞”相同。進(jìn)一步地，應(yīng)當(dāng)指出，依照上述的對于imPSA的定 義，所有在本發(fā)明范圍內(nèi)所論述的、分別待檢測的標(biāo)志物和標(biāo)志物片段是被組織中的巨噬 細(xì)胞攝取的并且至少部分地被吞噬的分子，其在血液巨噬細(xì)胞中在細(xì)胞內(nèi)被檢測到。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，借助于使用針對表面標(biāo)志物CD16的抗體的 正選擇來進(jìn)行血液巨噬細(xì)胞的選擇和/或富集和/或分離。因此，根據(jù)本發(fā)明，研究所有表達(dá)CD16的細(xì)胞，以便確保檢測所有激活的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。如果希望，根據(jù)本發(fā)明還設(shè)定，優(yōu)選地在使用針對表面標(biāo)志物CD16的抗體進(jìn)行正 選擇之后，或者根據(jù)一個(gè)備選方案還在使用針對表面標(biāo)志物CD16的抗體進(jìn)行正選擇之前， 使用針對表面標(biāo)志物CD14的抗體進(jìn)行正選擇。在-CD14+選擇之前布置使用針對表面標(biāo) 志物CD16的抗體進(jìn)行正-CD16+選擇提供了下述根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在第一步就已經(jīng)排除 了相對于CD16+群體而言大的未分化單核細(xì)胞的CD14+群體，所述未分化單核細(xì)胞不具有 CD16-表面標(biāo)志物，并且不是用于表征(特別是定量)由從組織再循環(huán)到血液循環(huán)系統(tǒng)中的 血液巨噬細(xì)胞從組織中攝取到細(xì)胞內(nèi)的分子標(biāo)志物的根據(jù)本發(fā)明的方法的目標(biāo)。以這種方式，有利地確保了，僅選擇出⑶14+CD16+細(xì)胞，其中應(yīng)當(dāng)提及，根據(jù)本發(fā) 明，在-⑶14+選擇之后進(jìn)行衛(wèi)-⑶16+選擇也是可能的。如果認(rèn)為其他具有細(xì)胞表面蛋白CD16的細(xì)胞群體(特別是NK細(xì)胞)在隨后對于 包含在細(xì)胞內(nèi)吞噬體中的源自組織的分子標(biāo)志物所進(jìn)行的分析中是干擾性的，那么可以接 著基于在⑶16+單核細(xì)胞中僅由NK細(xì)胞表達(dá)的表面蛋白⑶56或⑶57或⑶161來進(jìn)行負(fù) 選擇。因此，根據(jù)本發(fā)明可以有利地使用針對表面標(biāo)志物⑶56和/或⑶57和/或⑶161 的抗體進(jìn)行負(fù)選擇，以便排除具有表面標(biāo)志物CD56和/或CD57和/或CD161的細(xì)胞。這 樣的負(fù)選擇可以作為分開的選擇步驟來進(jìn)行實(shí)施，或者根據(jù)其他有利的實(shí)施方式，也可以 與CD16+細(xì)胞的正選擇同時(shí)實(shí)施，如下文中所示例性地說明的。此外，根據(jù)本發(fā)明還設(shè)定，使用可偶聯(lián)的，優(yōu)選可逆地可偶聯(lián)的磁珠來進(jìn)行正或負(fù) 選擇，以便借助于合適的磁體以極其簡單的方式分離各自選擇出的細(xì)胞。備選地或者在上游或下游的選擇步驟中，根據(jù)本發(fā)明提出，使用偶聯(lián)在ELISA平 板上的抗體來進(jìn)行正或負(fù)選擇，以便根據(jù)本發(fā)明有利地，一方面提高樣品通量，和另一方面 避免待檢查的液體從一個(gè)容器到另一個(gè)容器中的不必要的轉(zhuǎn)移，并避免與之相伴出現(xiàn)的待 檢查的細(xì)胞的物質(zhì)損失。此外，依照另一個(gè)優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式設(shè)定，在ELISA平板中定量地測 定單核白細(xì)胞群體，優(yōu)選地通過借助于ELISA平板閱讀器測量乳酸脫氫酶活性來進(jìn)行測 定，特別優(yōu)選地在其中進(jìn)行分子標(biāo)志物，特別是非-血液巨噬細(xì)胞自身的抗原的定性和定 量測定的同一 ELISA平板之中進(jìn)行。此外，借助于ELISA平板閱讀器和/或化學(xué)發(fā)光測量儀器來定量地測定非_血 液巨噬細(xì)胞自身的、源自組織的分子標(biāo)志物的存在量，其中根據(jù)本發(fā)明，作為分子標(biāo)志物， 特別是組織標(biāo)志物和/或血清學(xué)標(biāo)志物，使用下列標(biāo)志物及其組合異常的DNA甲基化， AFP ( α -1-胎蛋白)，AHCY (S-腺苷高半胱氨酸水解酶)，ΑΜΥ2 (胰淀粉酶)，CA 15_3 (同義 詞MUC1、EMA、CD227)，CA 19-9, CA 50, CA 72-4 (同義詞TAG72)，CA 125 (同義詞MUC16)， 降鈣素，鈣防衛(wèi)蛋白，CCSA-2 (結(jié)腸癌特異性抗原-2~)，CCSP-2 (結(jié)腸癌分泌蛋白_2~)，CEA (癌 胚抗原)，CYP24A1，細(xì)胞角蛋白(CK) 8及其片段，CK18及其片段，CK19及其片段，CRP (C反應(yīng) 蛋白)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑B，DDH (二氫二醇脫氫酶)，DKK-I (Dikkopf-I)，GP73 (高爾基 體蛋白-73)(同義詞:G0LPH2)，HE4(人附睪蛋白4)，HER2/neu，HSP (熱激蛋白)_27，Mac_2 BP(Mac-2結(jié)合蛋白)，乳腺珠蛋白A，乳腺珠蛋白B，MIA(黑素瘤抑制活性)，MnSOD (錳超氧 化物歧化酶)，PARK7 (同義詞DJ-1)，ProGRP (前胃泌素釋放肽)，NSE (神經(jīng)元特異性烯醇化酶)，泛細(xì)胞角蛋白，ftx)-MMP (基質(zhì)金屬蛋白酶原)_7，PSA (前列腺特異性抗原)，S100A8， S100A9, S-100 β，SCCAl (鱗狀細(xì)胞癌抗原1)，SCCA2 (鱗狀細(xì)胞癌抗原2)，甲狀腺球蛋白， UHRFl (具有/包含PHD和環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的遍在蛋白樣蛋白1)，URG4(上調(diào)的基因4)，和 YKL-40 (同義詞CHI3-L1)。根據(jù)本發(fā)明，為了實(shí)施所述方法，首先向全血摻以抵抗凝集和/或凝結(jié)的試劑，例 如肝素或其他合適的抗凝劑，例如檸檬酸鹽溶液。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步地，對巨噬細(xì)胞或包含巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體進(jìn)行穿孔或裂 解，例如借助于皂苷處理或用Triton溶液進(jìn)行的處理。此外，根據(jù)本發(fā)明，為了測定非-血液巨噬細(xì)胞自身的抗原，使用任選地與生物 素、HRP (辣根過氧化物酶)、AP (堿性磷酸酶)或發(fā)光染料相綴合的抗體，特別是免疫球 蛋白類別G(IgG)的抗體，和Fab或？(油)2片段，和/或適配體，其特別地選自抗-小鼠 IgG(多克隆的)，抗-兔IgG(多克隆的)，抗-山羊IgG(多克隆的)，抗-大鼠IgG(多 克隆的)，抗-驢IgG(多克隆的)，抗_AFP(克隆AFP-01)，抗_AFP(克隆AFP-11)， 抗-AFP (克隆 4A3)，抗-AFP (克隆 5H7)，抗-AFP (克隆 M803209)，抗-AFP (克隆 M0151611)， 抗-AFP (克隆 M0151608)，抗-AFP (多克隆的)，抗-AHCY (克隆 1E11-1A7)，抗-AHCY (克隆 2F11-1D10)，抗-AHCY (克隆 4H2)，抗-AHCY (克隆 Ml)，抗-AHCY (克隆 M2)，抗-AHCY (多克 隆的)，抗-AMY2 (克隆 6A9/1)，抗-AMY2 (克隆 501)，抗-AMY2 (克隆 503)，抗-AMY2 (克隆 10-102. 5)，抗-AMY2(多克隆的)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M2C5)，抗-CA 15-3/MUC1 (克 隆 M9E7)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M4H2)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M8C9)，抗-CA 15-3/ MUCl (克隆 M10G4)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M10H6)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M3A106)， 抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 C595 (NCRC48))，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 E29)，抗-CA 15-3/ MUCl (多克隆的)，抗-CA 19-9(克隆121SLE)，抗-CA 19-9 (多克隆的)，抗-CA 50(克隆 M991149)，抗-CA 50 (克隆 93)，抗-CA 50 (多克隆的)，抗-CA 72-4/TAG72 (克隆 SPM148)， 抗-CA 72-4/TAG72 (多克隆的)，抗-CA 125/MUC16 (克隆 2F1)，抗-CA 125/MUC16 (克 隆 10G12)，抗-CA 125/MUC16 (克隆 X75)，抗-CA 125/MUC16 (克隆 X325)，抗-CA 125/ MUC16(多克隆的)，抗-降鈣素(克隆SP17)，抗-降鈣素(克隆13B9)，抗-降鈣素(克 隆13f2)，抗-降鈣素(克隆MB2)，抗-降鈣素(多克隆的)，抗-鈣防衛(wèi)蛋白(克隆 27E10)，抗-鈣防衛(wèi)蛋白(多克隆的)，抗-CCSA-2(多克隆的)，抗-CCSP-2(多克隆的)， 抗-CEA (克隆 Col-I)，抗-CEA (克隆 1C7)，抗-CEA (克隆 1C10)，抗-CEA (克隆 1C11)， 抗-CEA (多克隆的)，抗-CYP24A1 (克隆 1E1)，抗-CYP24A1 (克隆 1F8)，抗-CYP24A1 (多 克隆的)，抗_CK8(克隆24)，抗-CK8(克隆LP;3K)，抗-CK8(多克隆的)，抗-CK18(克隆 DC-10)，抗-CK18 (克隆 DA-7)，抗-CK18 (克隆 LDK18)，抗-CK18 (多克隆的)，抗-CK19 (克 隆 A53-B/A2)，抗-CK19 (克隆 BA17)，抗-CK19 (克隆 236-11221)，抗-CK19 (多克隆的)， 抗-CRP (克隆 232007)，抗-CRP (克隆 2320 )，抗-CRP (克隆 C2)，抗-CRP (克隆 C4)， 抗-CRP (克隆C5)，抗-CRP (克隆C6)，抗-CRP (克隆C7)，抗-CRP (多克隆的)，抗-半胱氨 酸蛋白酶抑制劑B (克隆2F1)，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑B (克隆池27幻，抗-半胱氨酸 蛋白酶抑制劑B (克隆，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑B (克隆RJMW-2E7)，抗-半胱氨 酸蛋白酶抑制劑B(多克隆的)，抗-DDH(克隆T101)，抗-DDH(多克隆的)，抗-DKK-I (克 隆 141135)，抗-DKK-I (多克隆的)，抗-GP73/G0LPH2 (克隆 YA-14)，抗-GP73/G0LPH2 (克隆5B10)，抗-GP73/G0LPH2 (多克隆的)，抗-HE4 (克隆 C-12)，抗-HE4 (多克隆的)，抗-HER2/ neu (克隆 IOC7)，抗-HER2/neu (克隆 I9I9M)，抗-HER2/neu (克隆 NVD10)，抗-HER2/ neu (多克隆的)，抗-HSP-27 (克隆 G3. 1)，抗-HSP-27 (克隆 AF5E5)，抗-HSP-27 (克隆 F-4)，抗-HSP-27 (克隆 2AQ，抗-HSP-27 (多克隆的)，抗 _Mac_2BP (克隆 SP-2)，抗 _Mac_2 BP (多克隆的)，抗-乳腺珠蛋白A(克隆1G8D6，同義詞2E7G9)，抗-乳腺珠蛋白A(克隆 304-1A5)，抗-乳腺珠蛋白A (多克隆的)，抗-乳腺珠蛋白B (克隆E-17)，抗-乳腺珠蛋白 B (多克隆的)，抗-MIA (克隆3A6)，抗-MIA (多克隆的)，抗-MMP-7(克隆6A4)，抗-MMP-7(克 隆 176-5F12)，抗-MMP-7 (克隆 141-7B2)，抗-MMP-7 (克隆 377313)，抗-MMP-7 (多克隆 的)，抗-MnSOD (克隆 1AE)，抗-MnSOD (克隆 2A1)，抗-MnSOD (克隆 4F10)，抗-MnSOD (克 隆 23G5)，抗-MnSOD (克隆 37CT127. 5. 11. 6)，抗-MnSOD (多克隆的)，抗-PARK7/DJ-1 (克 隆 IBl 1)，抗-PARKVDJ-l (克隆 1D7)，抗-PARKVDJ-I (克隆 6A65)，抗-PARKVDJ-I (克 隆 3055)，抗-PARK7/DJ-1 (克隆 A-9)，抗-PARK7/DJ-1 (克隆 D-4)，抗-PARK7/DJ-1 (克 隆 E2)，抗-PARK7/DJ-1 (多克隆的)，抗-proGRP (克隆 pGRP5)，抗-proGRP (克隆 E146)， 抗-proGRP (克隆 E172)，抗-GRP (克隆 76-E6)，抗-proGRP (多克隆的)，抗-GRP (多 克隆的)，抗_NSE(克隆1C1)，抗-NSE(克隆5A4)，抗_NSE(克隆5E2)，抗_NSE(克隆 5G10)，抗-NSE(多克隆的)，抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆7H8C4)，抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆 B311. 1)，抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆C11)，抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆D-12)，抗-泛細(xì)胞角 蛋白(多克隆的)，抗_PSA(克隆ER-PR8)，抗-PSA(克隆181823)，抗_PSA(多克隆的)， 抗-S100A8 (克隆 1B3)，抗-S100A8 (克隆 2C5/4)，抗-S100A8 (克隆 2H2)，抗-S100A8 (克 隆 2Q396A)，抗-S100A8 (克隆 6A614)，抗-S100A8 (克隆 8L627)，抗-S100A8 (克隆 8-5C2)， 抗-S100A8 (克隆 CF-145)，抗-S100A8 (克隆 MRP8 7C12/4)，抗-S100A8 (克隆 S13. 67)， 抗-S100A8 (多克隆的)，抗-S100A9 (克隆 1C10)，抗-S100A9 (克隆 2Q396B)，抗-S100A9 (克 隆4G39)，抗-S100A9 (克隆編號(hào)19)，抗-S100A9 (克隆編號(hào)134)，抗-S100A9 (克隆 S32. 2)，抗-S100A9 (克隆 S36. 48)，抗-S100A9 (多克隆的)，抗-S-100 β (克隆 SB6)， 抗-S-100 β (克隆 SH-B1)，抗-S-100 β (克隆 SH-B4)，抗-S-100 β (多克隆的)， 抗-SCCAl (克隆 8Η11)，抗-SCCAl (多克隆的)，抗-SCCA2 (克隆 10C12)，抗-SCCA2 (多克 隆的)，抗-SCCA1/2 (克隆Β-9)，抗-SCCA1/2 (多克隆的)，抗-甲狀腺球蛋白(克隆5Ε6)， 抗-甲狀腺球蛋白(克隆5F9)，抗-甲狀腺球蛋白(克隆5G4)，抗-甲狀腺球蛋白(克隆 11Α16)，抗-甲狀腺球蛋白(克隆ΡΒ2)，抗-甲狀腺球蛋白(克隆ΡΒ3)，抗-甲狀腺球蛋 白(多克隆的)，抗-UHRFl (克隆1RC1C-10)，抗-UHRFl (克隆3Α11)，抗-UHRFl (多克隆 的)，抗-URG4(多克隆的)，抗-YKL-40/CHI3-L1 (克隆 2011)，抗-YKL-40/CHI3-L1 (克隆 321806)，抗-YKL-40/CHI3-L1 (多克隆的)。因此，總之可以規(guī)定，首先通過密度梯度離心來獲得所有單核細(xì)胞，由此排除 CD16-陽性嗜中性粒細(xì)胞。隨后，接著進(jìn)行具有表面蛋白CD14的細(xì)胞或者具有表面蛋白 ⑶16的細(xì)胞的正選擇和富集。備選地，作為替代，可以進(jìn)行具有表面蛋白⑶56或⑶57或 CD161的細(xì)胞的負(fù)選擇。根據(jù)本發(fā)明，借助于偶聯(lián)在磁珠上的、針對細(xì)胞表面蛋白⑶14或⑶16或⑶56或 CD57或CD161的抗體，不僅進(jìn)行具有表面蛋白CD14或CD16的單核細(xì)胞的正選擇和富集，而 且還進(jìn)行具有表面蛋白⑶56或⑶57或⑶161的單核細(xì)胞的負(fù)選擇。
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在針對CD14+細(xì)胞的正選擇或者負(fù)選擇的情況下，隨后為使用針對細(xì)胞表面蛋白 CD16的抗體來進(jìn)行的以細(xì)胞正選擇為特征的進(jìn)一步的分離步驟，所述抗體偶聯(lián)在磁珠上或 者包被在ELISA平板上。在首先針對CD16+細(xì)胞的正選擇的情況下，隨后借助于偶聯(lián)在磁珠 上或者包被在ELISA平板上的抗體來進(jìn)行進(jìn)一步的針對CD14+細(xì)胞的細(xì)胞正選擇，或者隨 后使用針對細(xì)胞表面蛋白⑶56或⑶57或⑶161的磁性抗體來進(jìn)行針對⑶56+或⑶57+或 ⑶161+ NK細(xì)胞的負(fù)選擇。備選地，可以在一個(gè)方法步驟中同時(shí)進(jìn)行針對⑶16+細(xì)胞的正選 擇以及針對⑶56+或⑶57+或⑶161+ NK細(xì)胞的負(fù)選擇。在針對⑶16+細(xì)胞的正選擇的情況 下，備選地可以不進(jìn)行進(jìn)一步的選擇步驟。隨后，通過用穿孔溶液和/或細(xì)胞裂解試劑進(jìn)行處理來破壞現(xiàn)在分離的且富集的 單核白細(xì)胞。根據(jù)上述方法的一個(gè)變化形式，可以事先，更確切地說，緊在細(xì)胞裂解之前或 者緊在密度梯度離心之后，在對細(xì)胞進(jìn)行滲透化的情形下添加針對待檢測的分子標(biāo)志物的 抗體。因此，在細(xì)胞裂解之后的步驟之一之中，可能定量包含在細(xì)胞中的分子標(biāo)志物。此外，在ELISA平板中，為了弄清所放入的細(xì)胞數(shù)目，測定裂解物中乳酸脫氫酶 (LDH)的活性，其中可以通過標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算出所存在的單核白細(xì)胞的量。通過添加指示物質(zhì)， 可以借助于ELISA閱讀器讀出由所述酶活性引起的顯色反應(yīng)，并因此進(jìn)行定量。最后，借助于特異地針對各分子標(biāo)志物的抗體和/或借助于針對各分子抗體的抗 體，優(yōu)選地在其中通過測量LDH活性來進(jìn)行細(xì)胞定量的同一 ELISA平板之中，與所檢查的標(biāo) 志物的量成比例地引發(fā)酶促顯色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光信號(hào)?？梢越柚贓LISA平板閱讀器或化 學(xué)發(fā)光檢測器，通過標(biāo)準(zhǔn)來定量各分子標(biāo)志物。最后將結(jié)果表示為“細(xì)胞內(nèi)分子標(biāo)志物的量 或質(zhì)量單位/細(xì)胞數(shù)目”。進(jìn)一步地，通過根據(jù)權(quán)利要求13的用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法的分析設(shè)備解決 了根據(jù)本發(fā)明的任務(wù)。根據(jù)本發(fā)明，用于實(shí)施所述方法的分析設(shè)備包含-用于添加試劑的裝置，所述試劑抑制全血的凝集和/或凝結(jié)(例如，肝素、檸檬酸 鹽溶液或其他合適的抗凝劑)；-用于借助于密度梯度離心，對所有在血液樣品中存在的單核白細(xì)胞進(jìn)行預(yù)選擇 或選擇和富集的裝置；-用于通過使用針對⑶14的抗體來選擇和富集⑶14+細(xì)胞的裝置，所述針對⑶14 的抗體偶聯(lián)在磁珠或ELISA平板上，任選可逆地偶聯(lián)在磁性珠或ELISA平板上；-用于通過使用針對⑶16的抗體來選擇和富集⑶16+細(xì)胞的裝置，所述針對⑶16 的抗體偶聯(lián)在磁珠或ELISA平板上，任選可逆地偶聯(lián)在磁性珠或ELISA平板上；-任選的用于通過使用偶聯(lián)在磁珠上的、針對⑶56或⑶57或⑶161的抗體，從單 核白細(xì)胞或單核CD16+細(xì)胞的集合中排除具有細(xì)胞表面標(biāo)志物CD56或CD57或CD161的NK 細(xì)胞的裝置；-用于對單核白細(xì)胞群體進(jìn)行穿孔和/或裂解的裝置；-用于定量測定單核白細(xì)胞群體的裝置，所述定量測定在ELISA平板中進(jìn)行(例 如，借助于ELISA平板閱讀器來測量乳酸脫氫酶活性)，更確切地在其中進(jìn)行分子標(biāo)志物的 定性和定量測定的同一 ELISA平板之中進(jìn)行；-用于在先前對血細(xì)胞進(jìn)行穿孔或裂解之后，定性和定量地測定被血液巨噬細(xì)胞吞噬的細(xì)胞內(nèi)分子標(biāo)志物(例如，借助于ELISA平板閱讀器、化學(xué)發(fā)光測量儀器等)的裝置。此外，根據(jù)本發(fā)明，還可以設(shè)定，用于在裂解單核白細(xì)胞之前(優(yōu)選地，在選擇和/ 或富集和/或分離出血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體之前或任選地在這 之后)對其進(jìn)行固定和滲透化的裝置，以便有利地在細(xì)胞裂解之前已經(jīng)進(jìn)行了針對被吞噬 到細(xì)胞內(nèi)的、待定量的分子標(biāo)志物的抗體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。下面借助于數(shù)個(gè)實(shí)施例來更詳細(xì)地闡述本發(fā)明實(shí)施例1 借助于磁珠來進(jìn)行⑶14+單核細(xì)胞的正選擇；在ELISA平板中，進(jìn)行⑶14+CD16+群 體的正選擇、細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣并保存于2-8°C。向該懸浮液摻以適宜 量的直接在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD14的抗體的磁珠，例如在250μ 1中IO8個(gè) 珠。備選地，可以將該懸浮液與10 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗 原⑶14的抗體一起在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后將該懸浮液離心(350 X g，8 分鐘)，在棄去上清液后將細(xì)胞重懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+ 或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中。添加適宜量的在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的 磁珠，例如在300 μ 1中IO8個(gè)珠。在將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘之后，借助于合適的 磁體來分離現(xiàn)在結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含0. 1% BSA的PBS溶液(pH 7.4)洗滌所述珠數(shù)次。在使用在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD14的抗體的磁珠的情 況下，將所述珠懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS 溶液(pH 7.4)中。備選地，在使用與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原 CD14的抗體和在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠的情況下，可以將所述珠重懸浮在 包含經(jīng)修飾的生物素的細(xì)胞釋放緩沖液中。將該懸浮液在室溫下?lián)u動(dòng)或擺動(dòng)10分鐘，隨后 進(jìn)行珠與上清液的磁力分離。取上清液，進(jìn)行離心(350Xg，8分鐘)，并懸浮在0.5ml的包 含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中。將確定體積的均質(zhì)化的懸浮液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的 每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板不僅用針對細(xì)胞表面抗原CD16的小鼠抗體(例如， 5 μ g/ml的克隆3G8)而且用針對PSA的小鼠抗體(例如，1 μ g/ml的克隆ER-PR8)進(jìn)行包 被，并進(jìn)行封閉(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)?？梢灾苽渌鰬腋∫旱南♂屜盗小?應(yīng)將該懸浮液的等分試樣留存于2-8°C。密封所述平板(例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在 室溫下溫育1小時(shí)或者于2-8°C在冰箱中溫育過夜。所述平板用包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌5次。隨后，將50 μ 1的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液移液到每個(gè)孔中。此外，將所留存的所有單核白細(xì)胞的懸浮液的等分試樣，或者具 有所有在其表面攜帶抗原CD14的細(xì)胞的珠的等分試樣移液到任意數(shù)目的(例如各2個(gè)) 孔中，并且向其摻以離50 μ 1所相差的體積的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰 氟)的細(xì)胞裂解溶液。此外，作為標(biāo)準(zhǔn)，制備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ ml之間，在此將50μ 1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中?，F(xiàn)在將所述平板 于2-8°C放置5分鐘，隨后在超聲波浴中處理5分鐘(只將平板的底部浸在水浴中，安置在 緊靠水面之下的筐作為支撐物)。在將平板進(jìn)行密封并在室溫(1小時(shí))或2_8°C (過夜)下進(jìn)行溫育之后，作為標(biāo) 準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀釋度開 始，在此將50μ 1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng) 溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封成不透光的，并在室溫下放置 30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH),用針刺破所有大 的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光吸收。所測量的吸收的強(qiáng) 度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS中0. 5μ g/ml的濃 度)一起在室溫下溫育1小時(shí)?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1 % Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pg imPSA/細(xì)胞數(shù)目(⑶14+⑶16+細(xì)胞，或者⑶14+細(xì)胞，或者單 核白細(xì)胞)。實(shí)施例2 借助于磁珠來進(jìn)行⑶16+單核細(xì)胞的正選擇；在ELISA平板中，進(jìn)行⑶14+CD16+群 體的正選擇、細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣并保存于2-8°C。向該懸浮液摻以適宜 量的直接在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體的磁珠，例如在250μ 1中IO8個(gè) 珠。備選地，可以將該懸浮液與10 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗 原⑶16的抗體一起在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后將該懸浮液離心(350 X g，8分鐘)，在棄去上清液后將細(xì)胞重懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+ 或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中。添加適宜量的在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的 磁珠，例如在300 μ 1中IO8個(gè)珠。在將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘之后，借助于合適的 磁體來分離現(xiàn)在結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含0. 1% BSA的PBS溶液(pH 7.4)洗滌所述珠數(shù)次。在使用在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體的磁珠的情 況下，將所述珠懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS 溶液(pH 7.4)中。備選地，在使用與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原 CD16的抗體和在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠的情況下，可以將所述珠重懸浮在 包含經(jīng)修飾的生物素的細(xì)胞釋放緩沖液中。將該懸浮液在室溫下?lián)u動(dòng)或擺動(dòng)10分鐘，隨后 進(jìn)行珠與上清液的磁力分離。取上清液，進(jìn)行離心(350Xg，8分鐘)，并懸浮在0.5ml的包 含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中。將確定體積的均質(zhì)化的懸浮液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的 每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板不僅用針對細(xì)胞表面抗原CD14的小鼠抗體(例如， 5 μ g/ml的克隆ΜφΡ9 )而且用針對PSA的小鼠抗體(例如，1 μ g/ml的克隆ER-PR8)進(jìn)行 包被，并進(jìn)行封閉(例如，用5%FCS(胎牛血清)溶液)。可以制備所述懸浮液的稀釋系列。 應(yīng)將該懸浮液的等分試樣留存于2-8°C。密封所述平板(例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在 室溫下溫育1小時(shí)或者于2-8°C在冰箱中溫育過夜。所述平板用包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌5次。隨后，將50 μ 1的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞 裂解溶液移液到每個(gè)孔中。此外，將所留存的所有單核白細(xì)胞的懸浮液的等分試樣，或者具 有所有在其表面攜帶抗原CD16的細(xì)胞的珠的等分試樣移液到任意數(shù)目的(例如各2個(gè)) 孔中，并且向其摻以離50 μ 1所相差的體積的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰 氟)的細(xì)胞裂解溶液。此外，作為標(biāo)準(zhǔn)，制備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ ml之間，在此將50μ 1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。現(xiàn)在將所述平板 于2-8°C放置5分鐘，隨后在超聲波浴中處理5分鐘(只將平板的底部浸在水浴中，安置在 緊靠水面之下的筐作為支撐物)。在將平板進(jìn)行密封并在室溫(1小時(shí))或2_8°C (過夜)下進(jìn)行溫育之后，作為標(biāo) 準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀釋度開 始，在此將50μ 1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng) 溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封成不透光的，并在室溫下放置 30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3C00H)，用針刺破所有大 的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光吸收。所測量的吸收的強(qiáng) 度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS中0. 5 μ g/ml的濃 度)一起在室溫下溫育1小時(shí)。現(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1 % Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pg imPSA/細(xì)胞數(shù)目(⑶14+⑶16+細(xì)胞，或者⑶16+細(xì)胞，或者單 核白細(xì)胞)。實(shí)施例3 借助于磁珠，首先進(jìn)行⑶14+單核細(xì)胞的正選擇，隨后進(jìn)行⑶14+⑶16+群體的正選 擇；在ELISA平板中，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。將該懸浮液與10 μ g 與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD14的抗體一起在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于 2_8°C溫育10分鐘。將所述細(xì)胞離心(350 X g，8分鐘)，并且在棄去上清液后重懸浮在0. 5ml的包含 0. 1% BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中。添加適宜量的在 其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在300μ 1中IO8個(gè)珠。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，用鏈霉抗 生物素蛋白標(biāo)記的珠與綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，而所述抗體結(jié)合在具有表面抗 原⑶14的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，并 隨后重懸浮在包含經(jīng)修飾的生物素的細(xì)胞釋放緩沖液中。將該懸浮液在室溫下?lián)u動(dòng)或擺動(dòng) 10分鐘，隨后進(jìn)行珠與上清液的磁力分離。取上清液，進(jìn)行離心(350 X g，8分鐘)，并懸浮在 0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中。取 所述懸浮液的等分試樣并進(jìn)行離心，將粒狀沉淀溶解在確定體積的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并留存于2-8°C?，F(xiàn)在向該細(xì)胞懸浮液摻以適宜量的在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原⑶16的抗 體的磁珠，例如在100μ 1中4Χ107個(gè)珠，并且于2-8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。隨后，借助 于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。在添加確定體積的包含 Triton和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液之前，用包含0. 1% BSA和2mMEDTA 但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)洗滌具有細(xì)胞的珠數(shù)次。將裂解物于2_8°C 放置至少5分鐘。
現(xiàn)在將所有的細(xì)胞裂解物在超聲波浴中處理5分鐘，使用合適的磁體從相應(yīng)的 裂解物中去除珠，并再一次進(jìn)行離心(14000Xg，10分鐘)。將確定體積的上清液(最多 100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用針對PSA 的小鼠抗體(例如lug/ml的克隆ER-PR8)進(jìn)行包被，并進(jìn)行封閉(例如，用5% FCS(胎 牛血清)溶液)。作為PSA-標(biāo)準(zhǔn)，制備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之 間，在此將確定體積的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。此外，作為細(xì)胞數(shù) 目-標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀 釋度開始，在此將50μ1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。密封所述平板 (例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫下溫育1小時(shí)。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng)溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封 成不透光的，并在室溫下放置30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH)，用針刺破所有大的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光 吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的濃度)一起在室溫下溫育1小時(shí)。現(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1 % Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pg imPSA/細(xì)胞數(shù)目(⑶14+⑶16+細(xì)胞，或者⑶14+細(xì)胞，或者單 核白細(xì)胞)。實(shí)施例4:借助于磁珠，首先進(jìn)行⑶16+群體的正選擇，隨后進(jìn)行⑶14+⑶16+群體的正選擇； 在ELISA平板中，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。將該懸浮液與5 μ g 與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體一起在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于 2_8°C溫育10分鐘。將所述細(xì)胞離心(350 X g，8分鐘)，并且在棄去上清液后重懸浮在0. 5ml的包含
200. 1% BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中。添加適宜量的在 其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ 1中2Χ107個(gè)珠。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，用鏈霉抗 生物素蛋白標(biāo)記的珠與綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，而所述抗體結(jié)合在具有表面抗 原⑶16的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，并 隨后重懸浮在包含經(jīng)修飾的生物素的細(xì)胞釋放緩沖液中。將該懸浮液在室溫下?lián)u動(dòng)或擺動(dòng) 10分鐘，隨后進(jìn)行珠與上清液的磁力分離。取上清液，進(jìn)行離心(350Xg，8分鐘)，并懸浮 在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中。 從中取確定體積的該懸浮液并進(jìn)行離心，將粒狀沉淀溶解在確定體積的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并留存于2_8°C。現(xiàn)在向該細(xì)胞懸浮液摻以適宜量的在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原⑶14的抗 體的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7個(gè)珠，并且于2-8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。隨后，借助于合適 的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。在添加確定體積的包含Triton 和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液之前，用包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不 含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)洗滌具有細(xì)胞的珠數(shù)次。將裂解物于2_8°C放置 至少5分鐘?，F(xiàn)在將所有的細(xì)胞裂解物在超聲波浴中處理5分鐘，使用合適的磁體從相應(yīng)的 裂解物中去除珠，并再一次進(jìn)行離心(14000Xg，10分鐘)。將確定體積的上清液(最多 100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用針對PSA 的小鼠抗體(例如ι μ g/ml的克隆ER-PR8)進(jìn)行包被，并進(jìn)行封閉(例如，用5% FCS (胎 牛血清)溶液)。作為PSA-標(biāo)準(zhǔn)，制備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之 間，在此將確定體積的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。此外，作為細(xì)胞數(shù) 目-標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀 釋度開始，在此將50μ 1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。密封所述平板 (例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫下溫育1小時(shí)。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng)溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封 成不透光的，并在室溫下放置30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH)，用針刺破所有大的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光 吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)來確定。現(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的濃度)一起在室溫下溫育1小時(shí)?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15
21分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pg imPSA/細(xì)胞數(shù)目(⑶14+⑶16+細(xì)胞，或者⑶16+細(xì)胞，或者單 核白細(xì)胞)。實(shí)施例5:借助于磁珠進(jìn)行CD16+群體的正選擇；在ELISA平板中，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目測定以及分 子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。向該懸浮液摻以適宜 量的、在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7個(gè)珠。 備選地，可以將5 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體在 搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后添加適宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋 白的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7個(gè)珠。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2-8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，與抗體 相偶聯(lián)的珠或者用鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的珠與在其表面上攜帶抗原CD16的細(xì)胞或者與 綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，所述綴合有DSB-X生物素的抗體結(jié)合在具有表面抗原 ⑶16的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，并 且隨后溶解在確定體積的包含If^jTriton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液 中，并留存于2-8°C。現(xiàn)在將所有的細(xì)胞裂解物在超聲波浴中處理5分鐘，使用合適的磁體從相應(yīng)的 裂解物中去除珠，并再一次進(jìn)行離心(14000Xg，10分鐘)。將確定體積的上清液(最多 100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用針對PSA 的小鼠抗體(例如lug/ml的克隆ER-PR8)進(jìn)行包被，并進(jìn)行封閉(例如，用5% FCS(胎 牛血清)溶液)。作為PSA-標(biāo)準(zhǔn)，制備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之 間，在此將確定體積的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。此外，作為細(xì)胞數(shù) 目-標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀 釋度開始，在此將50μ1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。密封所述平板 (例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫下溫育1小時(shí)。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng)溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封 成不透光的，并在室溫下放置30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH)，用針刺破所有大的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的濃度)一起在室溫下溫育1小時(shí)。現(xiàn)在，將所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0.05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pg imPSA/細(xì)胞數(shù)目(⑶16+細(xì)胞，或者單核白細(xì)胞)。實(shí)施例6:借助于磁珠，進(jìn)行⑶16+群體的正選擇，隨后進(jìn)行⑶16+⑶56—或⑶16+⑶57—或 ⑶16+CD161_群體的負(fù)選擇；在ELISA平板中，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此處為 imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。向該懸浮液摻以適宜 量的、在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7個(gè)珠。 備選地，可以將5 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體在 搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后添加適宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋 白的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7個(gè)珠。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，與抗體 相偶聯(lián)的珠或者用鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的珠與在其表面上攜帶抗原CD16的細(xì)胞或者與 綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，所述綴合有DSB-X生物素的抗體結(jié)合在具有表面抗原 ⑶16的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，并 隨后重懸浮在包含經(jīng)修飾的生物素的細(xì)胞釋放緩沖液中。將該懸浮液在室溫下?lián)u動(dòng)或擺動(dòng) 10分鐘，隨后進(jìn)行珠與上清液的磁力分離。取上清液，進(jìn)行離心(350Xg，8分鐘)，并懸浮 在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中。 從中取確定體積的該懸浮液并進(jìn)行離心，將粒狀沉淀溶解在確定體積的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并留存于2_8°C。
現(xiàn)在向該細(xì)胞懸浮液摻以適宜量的在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原⑶56或 ⑶57或⑶161的抗體的磁珠，例如在50 μ 1中2X IO7個(gè)珠。備選地，可以將5 μ g與經(jīng)修飾 的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗體在搖動(dòng)或擺動(dòng) 下于2-8°C溫育10分鐘，隨后添加適宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠，例 如在50μ 1中2X IO7個(gè)珠。在于2_8°C進(jìn)行20分鐘的搖動(dòng)或擺動(dòng)后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上 的細(xì)胞，其中留存上清液。用包含0.1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶 液(PH 7.4)洗滌具有細(xì)胞的珠數(shù)次，將洗滌溶液添加至上清液并且也留存，棄去所述珠。 離心所述上清液溶液(350Xg，8分鐘)，向細(xì)胞粒狀沉淀添加確定體積的包含Triton 和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液。將裂解物于2_8°C放置至少5分鐘?，F(xiàn)在將所有的細(xì)胞裂解物在超聲波浴中處理5分鐘，并再一次進(jìn)行離心 (14000Xg, 10分鐘)。將確定體積的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平 板的每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用針對PSA的小鼠抗體(例如1 μ g/ml的克隆 ER-PR8)進(jìn)行包被，并進(jìn)行封閉(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作為PSA-標(biāo)準(zhǔn)，制 備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之間，在此將確定體積的各濃度稀釋液 移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。此外，作為細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校 準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀釋度開始，在此將50 μ 1的各濃度稀釋 液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。密封所述平板(例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫 下溫育1小時(shí)。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng)溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封 成不透光的，并在室溫下放置30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH)，用針刺破所有大的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光 吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)來確定。現(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的濃度)一起在室溫下溫育1小時(shí)?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pgimPSA/細(xì)胞數(shù)目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r細(xì) 胞，或者CD16+細(xì)胞，或者單核白細(xì)胞)。實(shí)施例7:借助于磁珠，進(jìn)行⑶56—或⑶57—或⑶16Γ群體的負(fù)選擇，隨后進(jìn)行⑶16+⑶56—或 ⑶16+CD57—或⑶16+⑶16Γ群體的正選擇；在ELISA平板中，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+ 或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton 和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并且保存于2-8°C。向該懸浮液摻以 適宜量的、在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗體的磁珠，例如在 50 μ 1中2X IO7個(gè)珠。備選地，可以將5 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞 表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的抗體在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后添加適 宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2Χ107個(gè)珠。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，與抗體相 偶聯(lián)的珠或者用鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的珠與在其表面上攜帶抗原CD56或CD57或CD161 的細(xì)胞或者與綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，所述綴合有DSB-X生物素的抗體結(jié)合在 具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中留存上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，將 洗滌溶液添加至上清液并且也留存，棄去所述珠。離心所述上清液溶液(350Xg，8分鐘)， 將粒狀沉淀懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶 液(pH 7.4)中。從中取確定體積的該懸浮液并進(jìn)行離心，將粒狀沉淀溶解在確定體積的包 含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并留存于2_8°C。現(xiàn)在向該細(xì)胞懸浮液摻以適宜量的在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原⑶16的抗 體的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7個(gè)珠。備選地，可以將5 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相 綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后添加適 宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2Χ107個(gè)珠。在于2_8°C進(jìn)行20分鐘的搖動(dòng)或擺動(dòng)后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上 的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶 液(pH 7.4)洗滌具有細(xì)胞的珠數(shù)次，并且隨后溶解在確定體積的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并于2-8°C放置至少5分鐘?，F(xiàn)在將所有的細(xì)胞裂解物在超聲波浴中處理5分鐘，并再一次進(jìn)行離心 (14000Xg, 10分鐘)。將確定體積的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平 板的每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用針對PSA的小鼠抗體(例如1 μ g/ml的克隆 ER-PR8)進(jìn)行包被，并進(jìn)行封閉(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作為PSA-標(biāo)準(zhǔn)，制 備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之間，在此將確定體積的各濃度稀釋液 移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。此外，作為細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校 準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀釋度開始，在此將50 μ 1的各濃度稀釋 液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。密封所述平板(例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫 下溫育1小時(shí)。
隨后，向平板的每個(gè)經(jīng)溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封 成不透光的，并在室溫下放置30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH)，用針刺破所有大的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光 吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的濃度)一起在室溫下溫育1小時(shí)?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pgimPSA/細(xì)胞數(shù)目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r細(xì) 胞，或者CD56_或CD57_或CD161_細(xì)胞，或者單核白細(xì)胞)。實(shí)施例8:借助于磁珠來進(jìn)行⑶56_或⑶57_或⑶161_群體的負(fù)選擇；在ELISA平板中，進(jìn)行 ⑶16+CD56_或⑶16+⑶57_或⑶16+CD161_群體的正選擇、細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此 處為imPSA)的定量。從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+ 或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton 和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并且保存于2-8°C。向該懸浮液摻以 適宜量的、在其表面上攜帶針對細(xì)胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗體的磁珠，例如在 50 μ 1中2X IO7個(gè)珠。備選地，可以將5 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞 表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的抗體在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后添加適 宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2Χ107個(gè)珠。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，與抗體相 偶聯(lián)的珠或者用鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的珠與在其表面上攜帶抗原CD56或CD57或CD161 的細(xì)胞或者與綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，所述綴合有DSB-X生物素的抗體結(jié)合在 具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中留存上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，將 洗滌溶液添加至上清液并且也留存，棄去所述珠。離心所述上清液溶液(350Xg，8分鐘)，將粒狀沉淀懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶 液(pH 7.4)中。將確定體積的細(xì)胞懸浮液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每個(gè)孔 中，所述96-孔Maxi-Sorp平板不僅用針對細(xì)胞表面抗原CD16的小鼠抗體(例如，5 μ g/ml 的克隆3G8)而且用針對PSA的小鼠抗體(例如，1 μ g/ml的克隆ER-PR8)進(jìn)行包被，并進(jìn)行 封閉(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。可以制備所述懸浮液的稀釋系列。應(yīng)將該懸 浮液的剩余體積留存，但暫時(shí)不冷凍。密封所述平板(例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫 下溫育1小時(shí)或者于2-8°C在冰箱中溫育過夜。所述平板用包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌5次。隨后，將50μ 1的包含1Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì) 胞裂解溶液移液到每個(gè)孔中。此外，將25 μ 1所留存的所有在其表面上不攜帶抗原CD56或 CD57或CD161的細(xì)胞的懸浮液移液到任意數(shù)目的(例如2個(gè))孔中，并且向其摻以相同體 積的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液。此外，作為標(biāo)準(zhǔn)， 制備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之間，在此將50 μ 1的各濃度稀釋液 移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中?，F(xiàn)在將所述平板于2-8°C放置5分鐘，隨后在超聲波浴中 處理5分鐘(只將平板的底部浸在水浴中，安置在緊靠水面之下的筐作為支撐物)。在將平板進(jìn)行密封并在室溫(1小時(shí))或2_8°C (過夜)下進(jìn)行溫育之后，作為標(biāo) 準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀釋度開 始，在此將50μ 1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng) 溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封成不透光的，并在室溫下放置 30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH),用針刺破所有大 的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光吸收。所測量的吸收的強(qiáng) 度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的濃度)一起在室溫下溫育1小時(shí)?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0.05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pgimPSA/細(xì)胞數(shù)目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r細(xì) 胞，或者CD56_或CD57_或CD161_細(xì)胞，或者單核白細(xì)胞)。實(shí)施例9:借助于一次使用磁珠來進(jìn)行⑶16+⑶56—或⑶16+⑶57—或⑶16+CD161—群體的正選 擇；在ELISA平板中，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目測定以及分子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。
從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton和 ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。向該懸浮液摻以5yg 與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體以及摻以等量的(5yg) 與生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗體。將該懸浮液在搖動(dòng) 或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘，隨后添加適宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的 磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7個(gè)珠。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，用鏈霉抗 生物素蛋白標(biāo)記的珠與綴合有生物素以及綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，而所述抗體 結(jié)合在具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161或者具有表面抗原⑶16的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，棄 去洗滌溶液，隨后將所述珠重懸浮在包含經(jīng)修飾的生物素的細(xì)胞釋放緩沖液中。將該懸浮 液在室溫下?lián)u動(dòng)或擺動(dòng)10分鐘，隨后進(jìn)行珠與上清液的磁力分離。取僅包含0016+0056_或 ⑶16+CD57—或⑶16+CD161—細(xì)胞的上清液，進(jìn)行離心(350Xg,8分鐘)，將粒狀沉淀溶解在確 定體積的包含Triton和ImMPMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并于2_8°C放 置至少5分鐘。現(xiàn)在將所有的細(xì)胞裂解物在超聲波浴中處理5分鐘，并再一次進(jìn)行離心 (14000Xg, 10分鐘)。將確定體積的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平 板的每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用針對PSA的小鼠抗體(例如1 μ g/ml的克隆 ER-PR8)進(jìn)行包被，并進(jìn)行封閉(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作為PSA-標(biāo)準(zhǔn)，制 備重組PSA的稀釋系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之間，在此將確定體積的各濃度稀釋液 移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。此外，作為細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校 準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的稀釋度開始，在此將50 μ 1的各濃度稀釋 液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。密封所述平板(例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫 下溫育1小時(shí)。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng)溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封 成不透光的，并在室溫下放置30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH)，用針刺破所有大的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光 吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。接著， 將所述孔與來自山羊的、多克隆的、針對PSA的檢測抗體(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的濃度)一起在室溫下溫育1小時(shí)?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗滌5次。添加 針對所述檢測抗體的、與HRP(辣根過氧化物酶)相綴合的二抗(例如來自小鼠或兔)，例如
28以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的濃度。在室溫下的溫育時(shí)間再次為1小時(shí)。在將所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗滌5次之后，向每 個(gè)孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯胺)的底物溶液。在室溫下的溫育時(shí)間為15 分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀 器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度 與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pgimPSA/細(xì)胞數(shù)目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r細(xì) 胞，或者單核白細(xì)胞)。實(shí)施例10 如在實(shí)施例3、4、5、6、7和9中所描述的，借助于磁珠來分離CD14+CD16+或者CD16+ 或者⑶16+⑶56-或⑶16+⑶57-或⑶16+CD16r群體；在此之前或在此之后添加針對分子標(biāo) 志物(此處為imPSA)的抗體，在對細(xì)胞進(jìn)行透透化的情形下；在ELISA平板中，進(jìn)行細(xì)胞數(shù) 目測定以及分子標(biāo)志物(此處為imPSA)的定量。對于根據(jù)實(shí)施例9來分離⑶16+⑶56-或⑶16+⑶57—或⑶16+CD16r群體所描述的 實(shí)施過程從6ml全血開始，其置于包含聚酯凝膠和0. IM檸檬酸鈉溶液的小管中。通過離心 血液(例如，1800Xg, 20分鐘)，所有的單核白細(xì)胞與血小板一起在凝膠上方分離出來。分離出的細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)溶液(pH 7. 4)洗滌兩次以去除血小板， 所述PBS溶液另外還可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸鹽)。將分離出的單核白細(xì)胞懸浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)中，并向其摻以5 μ g與經(jīng)修飾的DSB-X生物素相綴合的、針 對細(xì)胞表面抗原CD16的抗體以及摻以等量的(5yg)與生物素相綴合的、針對細(xì)胞表面抗 原⑶56或⑶57或⑶161的抗體。將該懸浮液在搖動(dòng)或擺動(dòng)下于2-8°C溫育10分鐘。在 用PBS溶液(pH 7. 4)進(jìn)行的洗滌步驟后，將所述細(xì)胞懸浮在0. 5ml固定試劑(例如的 福爾馬林溶液)中，在10分鐘后用PBS溶液(pH 7.4)進(jìn)行洗滌，然后接納在100 μ 1滲透 化介質(zhì)中，并且與針對PSA的、綴合有HRP (辣根過氧化物酶)或生物素的小鼠抗體(例如
1μ g/ml的克隆ER-PR8) —起溫育大約20分鐘。然后，所述細(xì)胞用PBS溶液(pH 7. 4)進(jìn) 行洗滌，并懸浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液 (pH 7.4)中；可以取等分試樣，溶解在確定體積的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基 磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并保存于2-8°C。隨后，添加適宜量的、在其表面上攜帶鏈霉 抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2X IO7個(gè)珠。備選地，在這一方案的該位置處可以 不進(jìn)行用固定試劑和滲透化介質(zhì)處理細(xì)胞，其中在獲取等分試樣(其溶解在確定體積的包 含Triton和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并保存于2_8°C )之后， 立即將所述細(xì)胞與適宜量的、在其表面上攜帶鏈霉抗生物素蛋白的磁珠(例如在50μ 1中
2X IO7個(gè)珠)一起進(jìn)行溫育。然后，將單核白細(xì)胞和磁珠的懸浮液于2_8°C搖動(dòng)或擺動(dòng)20分鐘。在此，用鏈霉抗 生物素蛋白標(biāo)記的珠與綴合有生物素以及綴合有DSB-X生物素的抗體相結(jié)合，而所述抗體 結(jié)合在具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161或者具有表面抗原⑶16的細(xì)胞上。隨后，借助于合適的磁體來分離結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，其中棄去上清液。用包含
290. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+離子的PBS溶液(pH 7. 4)洗滌所述珠數(shù)次，棄 去洗滌溶液，隨后將所述珠重懸浮在包含經(jīng)修飾的生物素的細(xì)胞釋放緩沖液中。將該懸浮 液在室溫下?lián)u動(dòng)或擺動(dòng)10分鐘，隨后進(jìn)行珠與上清液的磁力分離。取僅包含0016+0056_或 ⑶16+CD57—或⑶16+^161—細(xì)胞的上清液，并進(jìn)行離心(350 X g，8分鐘)。假如已經(jīng)在對細(xì) 胞進(jìn)行滲透化的情形下添加了針對imPSA的抗體，在棄去上清液后將粒狀沉淀溶解在確定 體積的包含Triton和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中，并于2_8°C放 置至少5分鐘。否則，在棄去上清液后將粒狀沉淀懸浮在0. 5ml固定試劑(例如1 %的福爾 馬林溶液)中，在10分鐘后用PBS溶液(pH7. 4)進(jìn)行洗滌，然后接納在100 μ 1滲透化介質(zhì) 中，并且與針對PSA的、綴合有HRP (辣根過氧化物酶)或生物素的小鼠抗體(例如lyg/ml 的克隆ER-PR8) —起溫育大約20分鐘。然后，所述細(xì)胞用PBS溶液(pH 7.4)進(jìn)行洗滌，并 且溶解在確定體積的包含Triton和ImMPMSF (苯基甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解溶液中， 并于2-8°C放置至少5分鐘?，F(xiàn)在將所有的細(xì)胞裂解物在超聲波浴中處理5分鐘，并再一次進(jìn)行離心 (14000 Xg, 10分鐘)。將確定體積的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板 的每個(gè)孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用多克隆的針對小鼠免疫球蛋白的抗體(在使用 綴合有HRP的、針對PSA的抗體的情況下)，例如以2 μ g/ml的濃度，或者用抗生物素蛋白或 鏈霉抗生物素蛋白(在使用綴合有生物素的、針對PSA的抗體的情況下)進(jìn)行包被，并進(jìn)行 封閉(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作為標(biāo)準(zhǔn)，制備與HRP(辣根過氧化物酶)或 生物素相綴合的小鼠抗體克隆ER-PR8的稀釋系列，在此將確定體積的各濃度稀釋液移液 到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。由此，可以反向計(jì)算出所結(jié)合的imPSA的量。此外，作為細(xì)胞 數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞裂解溶液中制備經(jīng)校準(zhǔn)的LDH-陽性對照的稀釋系列，例如從1/2500的 稀釋度開始，在此將50μ1的各濃度稀釋液移液到各自至少兩個(gè)空閑的孔中。密封所述平 板(例如，用保鮮膜或鋁箔)，并且在室溫下溫育1小時(shí)。隨后，向平板的每個(gè)經(jīng)溫育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用鋁箔密封 成不透光的，并在室溫下放置30分鐘。然后，給所有經(jīng)溫育的孔各摻以50 μ 1終止溶液(1Μ CH3COOH)，用針刺破所有大的氣泡，并且在ELISA平板閱讀器中在492nm處測量所有孔的光 吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目成比例，所述細(xì)胞數(shù)目基于細(xì)胞數(shù)目-標(biāo)準(zhǔn)來確定?，F(xiàn)在，將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次，并且在 使用與HRP相綴合的、針對PSA的抗體的情況下，向其摻以100 μ 1的包含TMB (四甲基聯(lián)苯 胺)的底物溶液。在使用與生物素相綴合的、針對PSA的抗體的情況下，首先與綴合有HRP 的、多克隆的、針對小鼠免疫球蛋白的抗體(例如以0.5 μ g/ml的濃度)一起溫育1小時(shí)，然 后將所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗滌5次。使用包含TMB的底 物溶液的溫育時(shí)間在室溫下為15分鐘，然后將50 μ 1終止溶液(例如IM H2SO4)移液到各 個(gè)孔中。最后，在ELISA平板閱讀器中在450nm波長處測量所述孔的光吸收，減去在570nm 處的吸收。所測量的吸收的強(qiáng)度與imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于標(biāo)準(zhǔn)來確定。結(jié)果表示為，例如pgimPSA/細(xì)胞數(shù)目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r細(xì) 胞，或者單核白細(xì)胞)。在此處需要提及，所有上述示例性地說明了 imPSA的定量的實(shí)施例，還可明確地 用于表征所有其他上述的(特別是在權(quán)利要求9中所述及的)分子標(biāo)志物，并且對于這些標(biāo)志物的定量與imPSA的定量類似地進(jìn)行。此外，需要指出，為了測定各分子標(biāo)志物或者其 各表位，使用分別與這些標(biāo)志物和/或表位相關(guān)的抗體。 在此處需要指出，從本身單獨(dú)來看或以各組合形式，所有上面所描述的部分，特別 是在附圖
中所描繪的細(xì)節(jié)，被聲明對于本發(fā)明來說是實(shí)質(zhì)性的。由此進(jìn)行的變動(dòng)是本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟悉的。
權(quán)利要求
1.表征，特別是定量，由從組織再循環(huán)到血液循環(huán)系統(tǒng)中的血液巨噬細(xì)胞從組織中攝 取到細(xì)胞內(nèi)的分子標(biāo)志物的方法，其特征在于下列步驟-向全血施加試劑，所述試劑抑制全血的凝集和/或凝結(jié)；-從全血中選擇和/或富集和/或分離出血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞 群體；-進(jìn)行所選擇出的血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體的穿孔和/或裂 解，任選地，在事先對所選擇出的血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體進(jìn)行可 選的滲透化之后；-在事先對血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體進(jìn)行穿孔和/或裂解之 后，定性和定量地測定被吞噬的、非-血液巨噬細(xì)胞自身的標(biāo)志物，即源自組織的分子標(biāo)志 物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，借助于使用針對表面標(biāo)志物CD16的抗體的正 選擇來進(jìn)行血液巨噬細(xì)胞的選擇和/或富集和/或分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，優(yōu)選地，在使用針對表面標(biāo)志物CD16的抗體進(jìn) 行正選擇之后或任選地在這之前，使用針對表面標(biāo)志物CD14的抗體進(jìn)行正選擇。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用針對表面標(biāo)志物CD56和/或CD57 和/或CD161的抗體進(jìn)行負(fù)選擇，以便排除具有表面標(biāo)志物CD56和/或CD57和/或CD161 的細(xì)胞。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用可偶聯(lián)的，優(yōu)選可逆地可偶聯(lián)的磁 珠來進(jìn)行正或負(fù)選擇。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求1-4之一的方法，其特征在于，使用偶聯(lián)在ELISA平板上的抗體來 進(jìn)行正或負(fù)選擇。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，在ELISA平板中定量地測定單核白細(xì) 胞群體，優(yōu)選地通過借助于ELISA平板閱讀器測量乳酸脫氫酶活性來進(jìn)行測定，特別優(yōu)選 地在其中進(jìn)行分子標(biāo)志物，特別是非-血液巨噬細(xì)胞自身的抗原的定性和定量測定的同一 ELISA平板之中進(jìn)行。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，借助于ELISA平板閱讀器和/或化學(xué)發(fā) 光測量儀器來定量地測定被吞噬的、非-血液巨噬細(xì)胞自身的、源自組織的分子標(biāo)志物的存在量。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，作為分子標(biāo)志物，特別是組織標(biāo)志物和 /或血清學(xué)標(biāo)志物，使用下列標(biāo)志物及其組合-異常的DNA甲基化；-八？？…-！-胎蛋白)；-AHCY (S-腺苷高半胱氨酸水解酶)；-AMY2 (胰淀粉酶)；-CA 15-3(同義詞MUC1、EMA、CD227)；-CA 19-9 ；-CA 50 ；-CA 72-4(同義詞TAG72)；-CA 125(同義詞MUC16)； -降鈣素； -鈣防衛(wèi)蛋白；-CCSA-2 (結(jié)腸癌特異性抗原-2)； -CCSP-2(結(jié)腸癌分泌蛋白-2)； -CEA (癌胚抗原)； -CYP24A1 ；-細(xì)胞角蛋白(CK)S及其片段； -CK18及其片段； -CK19及其片段； -CRP(C反應(yīng)蛋白)； -半胱氨酸蛋白酶抑制劑B; -DDH (二氫二醇脫氫酶)； -DKK-I(Dikkopf-I)；-GP73(高爾基體蛋白-73)(同義詞G0LPH2)；-HE4(人附睪蛋白4);-HER2/neu ；-HSP (熱激蛋白)-27 ；-Mac-2 BP (Mac-2 結(jié)合蛋白)；-乳腺珠蛋白A ；-乳腺珠蛋白B;-MIA (黑素瘤抑制活性)；-MnSOD (錳超氧化物歧化酶)；-PARK7(同義詞DJ-1)；-ftx)GRP (前胃泌素釋放肽)；-NSE (神經(jīng)元特異性烯醇化酶)；-泛細(xì)胞角蛋白；-Pro-MMP (基質(zhì)金屬蛋白酶原)-7 ；-PSA (前列腺特異性抗原)；-S100A8 ；-S100A9 ；-S-100 β ；-SCCAl (鱗狀細(xì)胞癌抗原1)； -SCCA2 (鱗狀細(xì)胞癌抗原2)； -甲狀腺球蛋白；-UHRFl (具有/包含PHD和環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的遍在蛋白樣蛋白1)； -URG4(上調(diào)的基因4)；和 -YKL-40 (同義詞CHI3-L1)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用肝素或其他合適的抗凝劑作為抵抗凝集和/或凝結(jié)的試劑。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，借助于皂苷處理或用Triton溶液進(jìn) 行的處理來對巨噬細(xì)胞或包含巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體進(jìn)行穿孔或裂解。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，為了測定非-血液巨噬細(xì)胞自身的抗 原，使用任選地與生物素、HRP (辣根過氧化物酶)、AP (堿性磷酸酶)或發(fā)光染料相綴合的 抗體，特別是免疫球蛋白類別G(IgG)的抗體，和Fab或F(ab)2片段，和/或適配體，其特別 地選自-抗-小鼠IgG(多克隆的)； -抗-兔IgG(多克隆的)； -抗-山羊IgG(多克隆的)； -抗-大鼠IgG(多克隆的)； -抗-驢IgG(多克隆的)； -抗-AFP (克隆 AFP-01)； -抗-AFP (克隆 AFP-11)； -抗-AFP (克隆 4A3)； -抗-AFP (克隆 5H7)； -抗-AFP (克隆 M803209)； -抗-AFP(克隆 MOl5I6Il)； -抗-AFP (克隆 MOl5I6O8)； -抗-AFP (多克隆的)； -抗-AHCY (克隆 1E11-1A7)； -抗-AHCY (克隆 2F11-1D10)； -抗-AHCY (克隆 4H2)； -抗-AHCY (克隆 Ml)； -抗-AHCY (克隆 M2)； -抗-AHCY(多克隆的)； -抗 _AMY2(克隆 6A9/1)； -抗 _AMY2(克隆 501)； -抗 _AMY2(克隆 503)； -抗 _AMY2(克隆 10-102.5)； -抗_AMY2(多克隆的)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M2C5)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M9E7)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M4H2)；抗-CA15--3//MUCl (克隆 M8C9)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M10G4)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M10H6)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M3A106)；抗-CA15--3//MUCl (克隆 C595 (NCRC48))-抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 E^)； -抗-CA 15-3/MUC1 (多克隆的)； -抗-CA 19-9(克隆 121SLE)； -抗-CA 19-9(多克隆的)； -抗-CA 50(克隆 M991149)； -抗-CA 50 (克隆 93)； -抗-CA 50(多克隆的)； -抗-CA 72-4/TAG72 (克隆 SPM148)； -抗-CA 72-4/TAG72 (多克隆的)； -抗-CA 125/MUC16 (克隆 2F1)； -抗-CA 125/MUC16(克隆 10G12)； -抗-CA 125/MUC16 (克隆 X75)； -抗-CA 125/MUC16 (克隆 X325)； -抗-CA 125/MUC16 (多克隆的)； -抗-降鈣素(克隆SP17)； -抗-降鈣素(克隆13B9)； -抗-降鈣素(克隆13f2)； -抗-降鈣素(克隆24B2)； -抗-降鈣素(多克隆的)； -抗-鈣防衛(wèi)蛋白(克隆27E10)； -抗-鈣防衛(wèi)蛋白(多克隆的)； -抗-CCSA-2(多克隆的)； -抗-CCSP-2(多克隆的)； -抗-CEA (克隆 Col-I)； -抗-CEA (克隆 1C7)； -抗-CEA (克隆 1C10)； -抗-CEA (克隆 ICl 1)； -抗-CEA(多克隆的)； -抗-CYPMAl (克隆 1E1)； -抗-CYPMAl (克隆 IF8)； -抗-CYP24A1 (多克隆的)； -抗_CK8(克隆M); -抗 _CK8(克隆 LPD ； -抗_CK8(多克隆的)； -抗 _CK18(克隆 DC-10)； -抗 _CK18(克隆 DA-7)； -抗 _CK18(克隆 LDK18)； -抗_CK18(多克隆的)； -抗-CK19 (克隆 A53-B/A2)；抗-CK19(克隆 BA17)；抗-CK19(克隆 236-11221)；抗-CK19(多克隆的)；抗-CRP (克隆 232OO7)；抗-CRP (克隆 232024)；抗-CRP (克隆 C2)；抗-CRP (克隆 C4)；抗-CRP (克隆 C5)；抗-CRP (克隆 C6)；抗-CRP (克隆 C7)；抗-CRP(多克隆的)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑B (克隆2F1)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑B (克隆8k275)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑B (克隆B-02)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑B (克隆RJMW-2E7)抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑B(多克隆的)；抗-DDH(克隆 T101)；抗-DDH(多克隆的)；抗-DKK-I (克隆 141135)；抗-DKK-I (多克隆的)；抗-GP73/G0LPH2 (克隆 YA-14)；抗-GP73/G0LPH2(克隆 5B10)；抗-GP73/G0LPH2(多克隆的)；抗-HE4(克隆 C-12)；抗_HE4(多克隆的)；抗-HER2/neu (克隆 IOC7)；抗-HER2/neu (克隆 191924)；抗-HER2/neu (克隆 N3/D10)；抗-HER2/neu (多克隆的)；抗-HSP-27(克隆 G3. 1)；抗-HSP-27(克隆 AF5E5)；抗-HSP-27(克隆 F-4)；抗-HSP-27(克隆 2A5)；抗-HSP-27(多克隆的)；抗-Mac-2 BP (克隆 SP-2)；抗-Mac-2 BP(多克隆的)；抗-乳腺珠蛋白A (克隆1G8D6，同義詞2E7G9)抗-乳腺珠蛋白A(克隆304-1A5)；抗-乳腺珠蛋白A(多克隆的)；-抗-乳腺珠蛋白B(克隆E-17)； -抗-乳腺珠蛋白B(多克隆的)； -抗-MIA (克隆 3A6)； -抗-MIA(多克隆的)； -抗-MMP_7(克隆 6A4)； -抗-MMP-7 (克隆 I76-5Fl2)； -抗-MMP_7(克隆 141-7B2)； -抗-MMP_7(克隆 377313)； -抗-MMP_7(多克隆的)； -抗-MnSOD (克隆 1AE)； -抗-MnSOD (克隆 2A1)； -抗-MnSOD (克隆 4F10)； -抗-MnSOD (克隆 23G5)； -抗-MnSOD (克隆 37CT127. 5. 11. 6)； -抗-MnSOD (多克隆的)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 IBl 1)； -抗-PARKVDJ-l (克隆 ID7)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 6A65)； -抗-PARKVDJ-l (克隆 3O55)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 A-9)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 D-4)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 E2)； -抗-PARK7/DJ-1 (多克隆的)； -抗-proGRP (克隆 pGRP5)； -抗-proGRP (克隆 E146)； -抗-proGRP (克隆 E172)； -抗-GRP (克隆 76-E6)； -抗-proGRP (多克隆的)； -抗-GRP (多克隆的)； -抗-NSE (克隆 1C1)； -抗-NSE (克隆 5A4)； -抗-NSE (克隆 5E2)； -抗-NSE (克隆 5G10)； -抗-NSE (多克隆的)； -抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆7H8C4)； -抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆B311. 1)； -抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆Cll)； -抗-泛細(xì)胞角蛋白(克隆D-12)； -抗-泛細(xì)胞角蛋白(多克隆的)；-抗-PSA (克隆 ER-PR8)； -抗-PSA (克隆 181823)； -抗-PSA(多克隆的)； -抗 _S100A8(克隆 1B3)； -抗 _S100A8(克隆 2C5/4)； -抗 _S100A8(克隆 2H2)； -抗 _S100A8(克隆 2Q396A)； -抗-SlOOA8 (克隆 6A614)； -抗 _S100A8(克隆 8L627)； -抗 _S100A8(克隆 8-5C2)； -抗 _S100A8(克隆 CF-145)； -抗-S100A8(克隆 MRP8 7C12/4)； -抗 _S100A8(克隆 S13. 67)； -抗_S100A8(多克隆的)； -抗-SlOOA9 (克隆 1C10)； -抗 _S100A9(克隆 2Q396B)； -抗 _S100A9(克隆 4G9)； -抗_S100A9(克隆編號(hào)19)； -抗_S100A9(克隆編號(hào)134)； -抗 _S100A9(克隆 S32. 2)； -抗-S100A9 (克隆 S36. 48)； -抗_S100A9(多克隆的)； -抗-3-100 0(克隆586); -抗-3-100 3(克隆5!1-81); -抗-3-100 3(克隆5!1-84); -抗-S-100 β (多克隆的)； -抗-SCCAl (克隆 8Η11)； -抗-SCCAl (多克隆的)； -抗 _SCCA2(克隆 10C12)； -抗_SCCA2(多克隆的)； -抗 _SCCAl/2(克隆 B-9)； -抗_SCCAl/2(多克隆的)； -抗-甲狀腺球蛋白(克隆5E6)； -抗-甲狀腺球蛋白(克隆5F9)； -抗-甲狀腺球蛋白(克隆5G4)； -抗-甲狀腺球蛋白(克隆11A16)； -抗-甲狀腺球蛋白(克隆PB2)； -抗-甲狀腺球蛋白(克隆PB3)； -抗-甲狀腺球蛋白(多克隆的)；-抗-UHRFl (克隆 1RC1C-10)； -抗-UHRFl (克隆 3A11)； -抗-UHRFl (多克隆的)； -抗_URG4(多克隆的)； -抗-YKL-40/CHI3-L1 (克隆 2011)； -抗-IL-40/CHI3-L1 (克隆 321806)； -抗-YKL-40/CHI3-L1 (多克隆的)。
13.用于分離和表征血液的單核白細(xì)胞，特別是血液巨噬細(xì)胞的設(shè)備，其包含 -用于添加試劑的裝置，所述試劑抑制全血的凝集和/或凝結(jié)；-用于借助于密度梯度離心，從全血中預(yù)選擇和富集單核白細(xì)胞，特別是血液巨噬細(xì)胞 的裝置；-用于通過針對⑶14的抗體來選擇和富集⑶14+細(xì)胞的裝置，所述針對⑶14的抗體偶 聯(lián)在磁珠或ELISA平板上，任選可逆地偶聯(lián)在磁性珠或ELISA平板上；-用于通過針對⑶16的抗體來選擇和富集⑶16+細(xì)胞的裝置，所述針對⑶16的抗體偶 聯(lián)在磁珠或ELISA平板上，任選可逆地偶聯(lián)在磁性珠或ELISA平板上；-用于借助于皂苷溶液或Triton溶液來對單核白細(xì)胞群體，特別是血液巨噬細(xì)胞進(jìn)行 穿孔或裂解的裝置；-用于通過使用用于測定LDH(乳酸脫氫酶)活性的測試來定量地測定單核白細(xì)胞群 體，特別是血液巨噬細(xì)胞的裝置，所述定量測定在ELISA平板中進(jìn)行，更確切地在其中進(jìn)行 分子標(biāo)志物的定性和定量測定的同一 ELISA平板之中進(jìn)行；-用于在先前對血液的單核白細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞進(jìn)行穿孔或裂解之后，借助于 ELISA平板閱讀器和/或化學(xué)發(fā)光測量儀器來定性和定量地測定被血液巨噬細(xì)胞吞噬的細(xì) 胞內(nèi)分子標(biāo)志物的裝置。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的設(shè)備，其特征在于，用于通過使用偶聯(lián)在磁珠上的、針對CD56或 CD57或CD161的抗體，從單核白細(xì)胞特別是CD16+白細(xì)胞的集合中排除具有細(xì)胞表面標(biāo)志 物⑶56或⑶57或⑶161的NK細(xì)胞(天然殺傷細(xì)胞)的裝置。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14之一的設(shè)備，其特征在于，用于在裂解單核白細(xì)胞之前對其 進(jìn)行固定和滲透化的裝置，以便針對細(xì)胞內(nèi)的、被吞噬的分子標(biāo)志物的抗體在細(xì)胞裂解之 前進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，優(yōu)選地，所述固定和滲透化在選擇和/或富集和/或分離出血液巨噬細(xì) 胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體之前或任選地在這之后進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及表征，特別是定量，由從組織再循環(huán)到血液循環(huán)系統(tǒng)中的血液巨噬細(xì)胞從組織中攝取到細(xì)胞內(nèi)的分子標(biāo)志物的方法，其中進(jìn)行下列步驟向全血施加試劑，所述試劑抑制全血的凝集和/或凝結(jié)；從全血中選擇和/或富集和/或分離出血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體；進(jìn)行所選擇出的血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體的穿孔和/或裂解，任選地，在事先進(jìn)行滲透化之后；在事先對血液巨噬細(xì)胞或包含血液巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞群體進(jìn)行穿孔和/或裂解之后，定性和定量地測定非-血液巨噬細(xì)胞自身的標(biāo)志物，即源自組織的分子標(biāo)志物。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述方法的設(shè)備。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102138071SQ200980133748
公開日2011年7月27日 申請日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月4日
發(fā)明者W·布羅澤克 申請人:辛米德研究有限公司