專利名稱：遠(yuǎn)程控制的能量轉(zhuǎn)移染料復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1的前言的至少兩種用于配置熒光共振能量轉(zhuǎn)移對 (FRET對)的不同熒光團(tuán)的用途。此外，本發(fā)明涉及一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物(FRET復(fù)合物)，其包括至少一種 作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一種作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)，及連接 熒光團(tuán)(A)和(B)的特定有機(jī)基。
本發(fā)明還涉及一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(FRET系統(tǒng))。此外，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的不同目的的FRET復(fù)合物和FRET系統(tǒng)的用途，尤其 是用于樣品中項(xiàng)目檢測，或用于與靶分子或靶結(jié)構(gòu)的相互作用，和/或用于檢測或鑒定，或 用于靶分子或靶結(jié)構(gòu)的確定。此外，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物和FRET系統(tǒng)的用途的進(jìn)一步應(yīng)用， 例如作為一種染料，尤其是一種熒光染料，或在生物傳感器中，或作為(生物)探針，尤其是 FRET探針。最后，本發(fā)明涉及一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(FRET對)，其包括至少兩種不同熒光 團(tuán)，在FRET對中有至少一種作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一種作為受體熒光團(tuán) 的第二熒光團(tuán)(B)。
背景技術(shù)：
有機(jī)金屬稀土復(fù)合物，特別是β - 二酮化合物(β -diketonates)及其芳香族羧酸 鹽，已應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中，其獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制(或“天線效應(yīng)”)例如在生物傳感器中是有利 的。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的一種物理過程，其中一個(gè)受激發(fā) 的熒光染料(也稱為供體或供體熒光團(tuán))的能量一般能被轉(zhuǎn)移到第二個(gè)熒光染料(同義也稱 為受體或受體熒光團(tuán)或猝滅劑)。能量轉(zhuǎn)移或FRET的強(qiáng)度尤其取決于兩個(gè)熒光團(tuán)的距離。 FRET的基本原理是，在兩個(gè)熒光染料中，受激發(fā)的供體熒光團(tuán)的能量能被轉(zhuǎn)移到受體熒光 團(tuán)，該到熒光受體的能量轉(zhuǎn)移不以熒光的形式發(fā)生，而以非輻射的方式，例如通過偶極/偶 極相互反應(yīng)發(fā)生。為了使這種類型到受體的非輻射能量轉(zhuǎn)移使用FRET，必須滿足各種標(biāo)準(zhǔn)。一方面， 供體的發(fā)射光譜應(yīng)與受體的吸收光譜重疊。另一方面，供體和受體的偏振電子平面應(yīng)該平 行，且最后供體和受體間的距離應(yīng)該只有1納米或幾納米因?yàn)镕RET信號(hào)的強(qiáng)度與兩個(gè)熒光 團(tuán)的距離的6次方成反比。由于FRET的強(qiáng)度尤其取決于兩個(gè)熒光團(tuán)的距離，在一定程度上， FRET的使用已確立在光學(xué)納米級，特別是在生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)，其可檢測蛋白質(zhì)/蛋 白質(zhì)，蛋白質(zhì)/核酸和核酸/核酸的相互作用，尤其是空間結(jié)構(gòu)的變化，例如生物分子中的 構(gòu)象變化。在這方面的相互作用之間，同源和異源二聚作用或蛋白質(zhì)的低聚作用也可依據(jù) FRET現(xiàn)象測定。如果供體和受體熒光團(tuán)耦合到同一分子，也可以測量蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。 同樣，在分子生物學(xué)中，F(xiàn)RET的原理在使用實(shí)時(shí)PCR (實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng))核酸定量中通過特殊的探針的使用在實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)。在這方面，可以利用FRET和“LightCycler ”探針定量核酸，“LightCycler ”探針 是特殊的水解探針，其中每個(gè)不同的核苷酸都標(biāo)記一個(gè)供體或受體，與核酸分子的靶序列 并排連接，從而使供體和受體相互接近，以使FRET當(dāng)成PCR產(chǎn)物定量的探針使用。另一種常用的FRET包含了 “TaqMan ”探針的應(yīng)用，“TaqMan ”探針是特殊的水解 探針，其中，探針的一端標(biāo)記一個(gè)受體或猝滅劑，另一端標(biāo)記一個(gè)供體或報(bào)告熒光染料。受 體熒光與完整的水解探針的連接由于非輻射能量轉(zhuǎn)移(FRET)被猝滅劑抑制。在PCR循環(huán) 中，探針與互補(bǔ)DNA鏈相雜交，而受體熒光仍被抑制。在PCR循環(huán)中，Taq聚合酶形成了探 針的5’末端。供體的熒光團(tuán)不再被猝滅劑猝滅，并且可被測量。將“分子信標(biāo)”作為探針使用是利用FRET進(jìn)行PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)定量的另一個(gè)選擇。 分子信標(biāo)是與供體和猝滅劑或受體均連接的寡核苷酸。由于探針的5’端核苷酸和3’核苷 酸相互補(bǔ)，所以可形成以環(huán)狀二級結(jié)構(gòu)為特征的分子信標(biāo)。在這種狀態(tài)下，被稱為莖環(huán)，供 體由于與受體相接近而不顯示熒光。通過PCR循環(huán)中環(huán)狀區(qū)域與互補(bǔ)DNA序列的結(jié)合，供 體與受體的距離增加，通過這種方式可觀察到供體熒光。分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)和功能原理在Tyagi和Kramen (1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" Nature Biotechnology 14, 303—308 中被 詳細(xì)描述。它們也是美國專利5，925，517的主題，在此其被完全參考用于公開分子信標(biāo)的 結(jié)構(gòu)和功能。5’端的5’-(2_氨乙基)_氨基萘-1-磺酸(EDANS)作為熒光團(tuán)/猝滅劑對，且3’ 端的4’-(4_ 二甲基氨基)偶氮苯甲酸(DABCYL)作為猝滅劑。使用DABCYL在5’端與熒光 素相結(jié)合也是可行的(G. Leone, von Schijndel H. , van Gemen B. , Kramen R. F. and Schon D. (1998) "Molecular Beacon Probes Combined with Amplification by NASBA Enable Homogeneous Real-time Detection of RNA" Nucleic Acids Research 26, 9, 2150-2155)。因此，由于FRET引起的猝滅，分子信標(biāo)不發(fā)出或發(fā)出很少的熒光輻射，或使用兩 個(gè)熒光團(tuán)產(chǎn)生光譜移動(dòng)，從而當(dāng)樣品序列與靶序列未雜交時(shí)去除測量區(qū)域的信號(hào)，最近證 實(shí)分子信標(biāo)在檢測系統(tǒng)中作為探針是極其有效的，在該檢測系統(tǒng)中多余探針的清洗是不 必要的或不可能的。該應(yīng)用尤其適用于實(shí)時(shí)PCR技術(shù)或活細(xì)胞中核酸的檢測(Liu X.， Farmerie W. , Schuster S. , Tan W. (2000) "Molecular beacons for DNA Biosensors with a Micrometer to Submicrometer Dimension，， Analytical Biochemistry 283, 56-63)。即使在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，如活細(xì)胞，例如細(xì)胞成分的非特異性熒光已證明是錯(cuò) 誤的一個(gè)重要系統(tǒng)源，這些錯(cuò)誤一般顯著地降低了檢測方法本身的有效性和特異性，即使 使用已知的分子信標(biāo)或FRET探針。例如，血紅蛋白或芳香烴在被紫外光激發(fā)時(shí)顯示非特異 性熒光，且這種熒光可能負(fù)面地顯示為其自身的背景輻射。因此實(shí)際的測量信號(hào)被疊加。這 種背景輻射也被稱作樣品環(huán)境或樣品介質(zhì)的自發(fā)熒光。在FRET過程的范圍中，尤其是關(guān)于分子生物學(xué)的應(yīng)用，很有必要增加各自的FRET 探針的效率。不僅是這種情況下染料的特異性選擇和調(diào)節(jié)有重要意義，而且鑒于染料之間 空間間距，探針結(jié)構(gòu)也很重要。如上所述，F(xiàn)RET現(xiàn)象只發(fā)生在供體與受體的間距較小時(shí)，且與染料或熒光團(tuán)間距離的六次方成反比。鑒于此，尤其是(并不總是完全)，現(xiàn)有技術(shù)中先前 已成功嘗試提供高效的探針，尤其是分子信標(biāo)?，F(xiàn)有技術(shù)的探針并不總是具有一個(gè)最佳發(fā) 射光譜，其特別影響測量樣品或樣品介質(zhì)的自發(fā)熒光的發(fā)射光譜的分化。另外，在這方面發(fā) 射時(shí)間通常不是最理想的，因?yàn)樗鼈円话阍诩ぐl(fā)后幾納秒減弱，所以FRET探針的發(fā)射必須 在激發(fā)信號(hào)的同時(shí)在時(shí)間分辨測量范圍內(nèi)檢測，其不利于信號(hào)的檢測和評估。另外，現(xiàn)有技 術(shù)的FRET探針通常不產(chǎn)生最佳的FRET，所以供體的猝滅不總是最佳的。德國專利DE 102 59 677 B4，其可追溯到申請人，涉及一種識(shí)別和定量樣品中微 生物的方法，微生物分離后并將分離的微生物轉(zhuǎn)移到PCR管中進(jìn)行靶核苷酸的擴(kuò)增，使用 一種特殊的探針確定靶核苷酸，該探針包括至少兩個(gè)形成FRET對的探針。使用的探針只有 在與靶核苷酸雜交后才發(fā)出識(shí)別信號(hào)，該信號(hào)存在的時(shí)間比樣品環(huán)境的熒光發(fā)射時(shí)間長， 所以該測量信號(hào)可通過時(shí)間分辨熒光測量與樣品環(huán)境的自發(fā)熒光相區(qū)分。在這一點(diǎn)上，關(guān) 于使用的FRET探針，之前應(yīng)用一種基于EuTTAPhen和Cy5的特殊FRET對。這種類型的熒 光染料的結(jié)合在發(fā)射行為方面比現(xiàn)有技術(shù)有相當(dāng)大的改善，但是這方面的屬性并不總是最 佳的。特別是，德國專利描述的探針是一種“單色分析”，這使得可以確立兩個(gè)相應(yīng)的熒光 染料的距離，特別是即使在一個(gè)有限的范圍內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)，其適用于上述應(yīng) 用，并且特別是，避免至少一些現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，或至少減少這些缺點(diǎn)。特別是，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)，其能夠適用 于，例如，用于定性和定量測量如核酸分子的靶分子的分子生物學(xué)分析方法，例如在實(shí)時(shí) PCR的范圍下，用于結(jié)構(gòu)變化的測定，如蛋白質(zhì)。特別是，在該例子中提供一種具有改善的發(fā) 射行為，特別是具有改善的發(fā)射持續(xù)時(shí)間和發(fā)射帶寬的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)，它可能特 定地區(qū)分或辨別樣品的自發(fā)熒光。另外，改進(jìn)的染料復(fù)合物之間的距離的定性確立并從而 使與靶分子或靶結(jié)構(gòu)相互作用成為可能，其基于根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或復(fù)合系統(tǒng)。為了解決上述問題，本發(fā)明(根據(jù)第一方面)根據(jù)權(quán)利要求1提出至少兩種不同的 用于配置熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(FRET對)的熒光團(tuán)的用途。根據(jù)本發(fā)明的該用途的另一個(gè) 有利的結(jié)構(gòu)是相關(guān)從屬權(quán)利要求的主題。本發(fā)明的另一個(gè)主題(根據(jù)第二方面)是根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求39的熒光共振能量 轉(zhuǎn)移復(fù)合物(FRET復(fù)合物)。根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物的另一個(gè)有利的結(jié)構(gòu)是相關(guān)從屬權(quán) 利要求的主題。此外，本發(fā)明的另一個(gè)主題(根據(jù)第三方面)是根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求42的共振能量 轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(FRET系統(tǒng))。本發(fā)明這方面的另一個(gè)有利的結(jié)構(gòu)是相關(guān)從屬權(quán)利要求的主題。本發(fā)明的另外的主題(根據(jù)第四方面)是根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求46的用于檢測樣品 中項(xiàng)目的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明第四方面的應(yīng)用的另一個(gè)有利的結(jié) 構(gòu)是相關(guān)從屬權(quán)利要求的主題。本發(fā)明的另一個(gè)主題(根據(jù)第五方面)是根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求M的與靶分子或靶 結(jié)構(gòu)相互作用的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的這方面的應(yīng)用的另一個(gè)有 利的結(jié)構(gòu)是相關(guān)從屬權(quán)利要求的主題。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)主題(根據(jù)第六方面)是根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求57的作為用于 標(biāo)記或類似目的的染料的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的這方面的應(yīng)用的 另一個(gè)有利的結(jié)構(gòu)是相關(guān)從屬權(quán)利要求的主題。此外，本發(fā)明的另一個(gè)主題(根據(jù)第七和第八方面)是根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求58的作 為生物傳感器或在生物傳感器中，或者作為(生物)探針或在(生物)探針中，特別是FRET探 針的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的這方面的應(yīng)用的另一個(gè)有利的結(jié)構(gòu)是 相關(guān)從屬權(quán)利要求的主題。最后，本發(fā)明的還一主題(根據(jù)第九方面)是根據(jù)權(quán)利要求60的熒光共振能量轉(zhuǎn)移 對(FRET 對)。為了避免重復(fù)，不言而喻的是，下文描述的只關(guān)于本發(fā)明一方面的結(jié)構(gòu)、實(shí)施例和 優(yōu)勢等當(dāng)然也適用于本發(fā)明的其他方面。申請人:驚奇地發(fā)現(xiàn)，上述問題可通過使用至少兩種特殊的、不同的熒光團(tuán)解決，該 熒光團(tuán)定義如下，用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(也同義地稱為FRET對)的結(jié)構(gòu)。該FRET對包 括一作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)。根據(jù)本發(fā)明 的應(yīng)用，其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀土元素 的有機(jī)金屬復(fù)合物為基礎(chǔ)進(jìn)行配置。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，熒光團(tuán)(A)和(B)以這樣的方式選 擇，即它們包括彼此不同的稀土元素。根據(jù)本發(fā)明在應(yīng)用范圍內(nèi)配置的FRET尤其適用于生物化學(xué)或分子生物學(xué)分析 方法的范圍內(nèi)的應(yīng)用，例如特定靶分子或靶結(jié)構(gòu)的檢測，特別是生物分子如樣品中的DNA， RNA，蛋白質(zhì)等，從而有效地作為FRET探針，在這種情況下根據(jù)本發(fā)明在應(yīng)用范圍內(nèi)配置的 FRET對也可能包括能與靶分子或靶結(jié)構(gòu)相互作用的特定部分或組分。另外，在本發(fā)明的范 圍內(nèi)制備的FRET對適用于例如蛋白質(zhì)或核酸的分子構(gòu)象變化的確定或檢測。生物分子的 裂解和連接過程可由根據(jù)本發(fā)明制備的FRET對檢測。另外，還可能用作一種染料。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可通過帶有不同稀土元素的熒光團(tuán)(A)和(B)的特異性選擇 成功制備一高效的系統(tǒng)或復(fù)合物，而且FRET系統(tǒng)的進(jìn)一步特殊的結(jié)構(gòu)(下文描述)，特別是 關(guān)于熒光團(tuán)(A)和(B)相對于彼此的空間排列，所述系統(tǒng)或復(fù)合物尤其適用于FRET分析或 FRET檢測應(yīng)用的范圍，特別是在分子生物學(xué)或生化分析中用于檢測或發(fā)現(xiàn)，和用于特定靶 分子或靶結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的分析。在這種情況下，在本發(fā)明范圍內(nèi)制備的FRET對，其特征是包括一具有很窄發(fā)射帶 的界定的發(fā)射光譜，其產(chǎn)生優(yōu)良的檢測性，特別是由于根據(jù)本發(fā)明制備的FRET對的發(fā)射光 譜與樣品環(huán)境的非特異性熒光發(fā)射有顯著區(qū)別，因此在這種方式下，可實(shí)現(xiàn)所需測量信號(hào) 的自發(fā)熒光和非特異性背景輻射的有效區(qū)分。由于根據(jù)本發(fā)明制備的FRET對具有很長的發(fā)射時(shí)間，所以根據(jù)本發(fā)明的FRET對 或FRET探針的特性及下文描述的本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)還可進(jìn)一步改善，也就 是說，根據(jù)本發(fā)明的FRET對或FRET探針在被合適的激發(fā)信號(hào)激發(fā)后，發(fā)出一暫時(shí)延長的發(fā) 射信號(hào)，該發(fā)射信號(hào)進(jìn)一步改善檢測性。因此，根據(jù)本發(fā)明的FRET對的信號(hào)發(fā)射持續(xù)時(shí)間 為幾毫秒，而例如在終止激發(fā)信號(hào)后基于樣品環(huán)境的自發(fā)熒光的不希望得到的干擾熒光下 降到納秒內(nèi)(例如大約200納秒)。這導(dǎo)致測量信號(hào)和干擾信號(hào)之間的可辨性和區(qū)別的進(jìn)一 步改善。
根據(jù)本發(fā)明的FRET對或FRET系統(tǒng)的另一個(gè)決定性優(yōu)勢是，在這種情況下，由于 包括不同稀土元素的熒光團(tuán)(A)和(B)的特異性選擇導(dǎo)致其是雙色檢測的，所述檢測適用 于相互反應(yīng)或結(jié)構(gòu)變化等的定性或定量分析。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)本發(fā)明的 FRET系統(tǒng)在熒光團(tuán)(A)和(B)距離較短時(shí)，使用熒光團(tuán)(A)和(B)的特異性鋱和銪復(fù)合物發(fā) 紅光，從而產(chǎn)生最大的能量轉(zhuǎn)移，而在較長距離時(shí)熒光團(tuán)發(fā)黃光。在中間狀態(tài)下，即，熒光團(tuán) 間的平均距離，根據(jù)本發(fā)明的FRET對或FRET探針發(fā)光在橙色區(qū)域內(nèi)，更具體的是根據(jù)熒光 團(tuán)間的距離，從紅色到黃色發(fā)生相應(yīng)的顏色變化。這也對根據(jù)本發(fā)明的FRET對作為染料使 用特別有利。鑒于此，在本發(fā)明范圍內(nèi)制備的FRET對或FRET探針和FRET系統(tǒng)或FRET復(fù)合物 尤其適用于生物化學(xué)或分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。在這方面，根據(jù)本發(fā)明制備 的FRET對特別適用于蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)/核酸和核酸/核酸相互作用的測定，生物 分子的構(gòu)象變化和裂解過程的檢測，或生物分子中的構(gòu)象變化和裂解過程的檢測，由于作 為兩色分析的具體結(jié)構(gòu)甚至可能對相關(guān)項(xiàng)目進(jìn)行定量分析。根據(jù)本發(fā)明的FRET系統(tǒng)特別 適用于核酸定量的范圍內(nèi)，例如在實(shí)時(shí)PCR的范圍內(nèi)。根據(jù)第一方面，因此本發(fā)明的主題是至少兩種不同的用于配置熒光共振能量轉(zhuǎn)移 對(FRET對)的熒光團(tuán)的應(yīng)用，在FRET對中存在至少一種作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A) 和至少一種作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)。根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用，其特征在于，第一熒光 團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物為基礎(chǔ)配置， 熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。因此本發(fā)明的基本原理事實(shí)上是，關(guān)于FRET對，第一熒光團(tuán)(A)作為供體，其包括 來自稀土元素組中的中心原子。另外，根據(jù)本發(fā)明使用的第二熒光團(tuán)(B)同樣包含一種稀 土元素作為中心原子，在這種情況下，該稀土元素與第一熒光團(tuán)(A)的元素不同。關(guān)于第一 熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)的稀土元素的選擇性應(yīng)用，規(guī)定該組中的不同元素應(yīng)用于各 自的熒光團(tuán)，完全出乎意料地產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用范圍制備的FRET對關(guān)于其發(fā)射特性的 優(yōu)異性能，如窄發(fā)射帶，長發(fā)射或發(fā)光持續(xù)時(shí)間，定量改變發(fā)射光譜，作為在兩色分析范圍 內(nèi)熒光團(tuán)(A)和(B)的距離函數(shù)，優(yōu)良的FRET具有短距離的熒光團(tuán)，該熒光團(tuán)具有供體信號(hào) 的最佳猝滅。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，已證明如果第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)以下種方式選 擇，即從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能量轉(zhuǎn)移在激發(fā)能量的影響和/或作用和/或 應(yīng)用下發(fā)生是極其有利的，特別是從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能量轉(zhuǎn)移至少以 一種實(shí)質(zhì)上非輻射方式發(fā)生。這種類型的能量轉(zhuǎn)移發(fā)生，特別是，在FRET意義下，熒光團(tuán)間 具有短距離。隨著距離增加，F(xiàn)RET減弱。關(guān)于激發(fā)能量，可使用具有特定波長的電磁輻射， 該波長是供體優(yōu)化或?qū)虻?。這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員本身是已知的。可能發(fā)生從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能量轉(zhuǎn)移，例如，通過偶極/偶極 相互作用。能量轉(zhuǎn)移的存在可尤其通過熒光團(tuán)(A)或供體熒光團(tuán)的熒光減弱和/或第二熒 光團(tuán)(B)或受體熒光團(tuán)的熒光增強(qiáng)檢測。熒光顯微鏡，熒光計(jì)等是檢測和測量單元的非限制性例子。從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能量轉(zhuǎn)移因此可能取決于熒光團(tuán)(A)和(B) 間的距離。在這方面，能量轉(zhuǎn)移，尤其是能量轉(zhuǎn)移的強(qiáng)度和/或效率，可能隨著熒光團(tuán)(A)和(B)空間間距的減小而增加。換言之，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)間距的增加導(dǎo)致能 量轉(zhuǎn)移的減弱，伴隨著發(fā)射光譜的改變。例如，這種類型的熒光團(tuán)(A)和(B)間距的改變可 能發(fā)生在相互反應(yīng)或相互作用，或FRET對與靶分子或靶結(jié)構(gòu)的連接的范圍內(nèi)，這種相互反 應(yīng)或相互作用，或FRET對與靶分子或靶結(jié)構(gòu)的連接引起距離改變，特別是增加兩個(gè)熒光團(tuán) (A)和(B)間的距離。具體結(jié)果可從發(fā)射光譜的變化中看出，隨著間距增加供體信號(hào)增強(qiáng)和 /或受體信號(hào)減弱。如果距離減小，作為受體猝滅效應(yīng)的結(jié)果是供體信號(hào)相應(yīng)地減弱且受體 信號(hào)增強(qiáng)。在這點(diǎn)上，從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能量轉(zhuǎn)移因此能夠?qū)е碌谝粺?光團(tuán)(A)的熒光的減弱和第二熒光團(tuán)(B)的熒光的增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)具有至少基本上平行的偏振電子平面是有 利的，其在熒光團(tuán)(A)固定于一邊且熒光團(tuán)(B)固定于另一邊時(shí)(例如固定于相同蛋白質(zhì)上) 尤其重要。在與蛋白質(zhì)相互作用的范圍內(nèi)伴隨著熒光團(tuán)(A)和(B)相對于彼此位置變化的 FRET信號(hào)的變化或蛋白質(zhì)本身的構(gòu)象變化，因此能夠解釋偏振平面的變化及兩個(gè)熒光團(tuán)相 對于彼此的位置變化。前面已經(jīng)解釋，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)應(yīng)該只間隔很短的距離，以產(chǎn)生能量轉(zhuǎn) 移，尤其是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，間距一般測量為幾個(gè)納米。這是因?yàn)镕RET信號(hào)的強(qiáng)度與熒 光團(tuán)間距離的六次方成反比。在這點(diǎn)上，能量轉(zhuǎn)移的效率取決于熒光團(tuán)對的“轉(zhuǎn)移半徑”。 熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)之間短距離的標(biāo)準(zhǔn)使根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用范圍制備的FRET對，在 一定程度上，可能充當(dāng)“光學(xué)納米尺度”，因此適用于，例如，在分子生物學(xué)或生物化學(xué)方法 的范圍內(nèi)熒光團(tuán)間間距的定性和定量檢測，以得出關(guān)于根本的主要的項(xiàng)目的定性和定量結(jié) 論，如與靶分子或靶結(jié)構(gòu)的相互作用和構(gòu)象變化。關(guān)于能量轉(zhuǎn)移，特別是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，特別是熒光團(tuán)(A)和(B)間距較短時(shí)， 也可能第一熒光團(tuán)(A)的狀態(tài)與第二熒光團(tuán)(B)的狀態(tài)重疊，或至少部分重疊。此外，第一熒光團(tuán)(A)和/或第二熒光團(tuán)(B)，相互獨(dú)立，每一個(gè)都應(yīng)該包括一種染 料，尤其是熒光染料。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對于相互獨(dú)立的第一熒光團(tuán)(A)和/或第二熒光團(tuán)(B)，每個(gè) 包括至少一個(gè)核心，優(yōu)選為一個(gè)由一種稀土元素組成形成的核心是有利的。特別優(yōu)選的是， 相互獨(dú)立的第一熒光團(tuán)(A)和/或第二熒光團(tuán)(B)，以配合物或配位化合物或螯合物形式存 在，其中心原子由稀土元素組成。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選的是，(如果使用多核配合 物)基于相同稀土元素的核心用于復(fù)合物中，從而用于熒光團(tuán)中。如果稀土元素從鈧、釔、鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥組中 選擇，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用范圍制備的FRET對的上述性質(zhì)可達(dá)到極好的效果。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，特別可能從鑭系元素中提供稀土元素，尤其是選自由鈰、鐠、 釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥組成的組中。鑭系元素是銀色的，有光澤的，相對較軟的，當(dāng)暴露在空氣中迅速氧化且變?yōu)闊o光 澤的活性金屬。在水中，它們或多或少地與釋放的氫氣快速反應(yīng)。鑭系元素是元素周期表 中來自于第六周期的14個(gè)元素的總和，也被看作第三副族的一個(gè)亞類。由于價(jià)電子層相似 的結(jié)構(gòu)，鑭系元素在化學(xué)上以與元素周期表第三組中的元素，即鈧和釔相同的方式作用。鑭 系元素與它們一起構(gòu)成了稀土元素組。
如果稀土元素從銪和鋱組中選擇，在本發(fā)明范圍內(nèi)制備的FRET對獲得極好的效果。在這方面，申請人完全出乎意料地發(fā)現(xiàn)，如果熒光團(tuán)(A)含有鋱作為稀土金屬，特 別是以鋱(III)的形式，F(xiàn)RET對能具有優(yōu)異特性。在這點(diǎn)上，也同樣證明，如果熒光團(tuán)(B)含有銪作為稀土金屬，特別是以銪(III) 的形式，是極其有利的。因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)極其優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明使用范圍制備的FRET對包括一 熒光團(tuán)(A)和一熒光團(tuán)(B)，熒光團(tuán)(A)含有鋱作為稀土金屬，特別是以鋱(III)的形式，且 熒光團(tuán)(B)含有銪作為稀土金屬，特別是以銪(III)的形式存在。這種類型的FRET對在能 量轉(zhuǎn)移的猝滅中具有優(yōu)異特性，尤其是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光團(tuán)(A)和(B)間距較短，具 有窄發(fā)射帶的限定發(fā)射行為和延長的發(fā)射時(shí)間，以這種方式，基于鋱和銪的FRET在一定程 度上適用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的分析應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用范圍制備的FRET對的熒光團(tuán)的配置，優(yōu)選為，熒光團(tuán)(A)和(B)每 個(gè)都與稀土元素結(jié)合，特別是至少與一個(gè)配體結(jié)合，特別是絡(luò)合劑和/或螯合劑，特別是多 個(gè)配體，優(yōu)選為四配體，和/或相互獨(dú)立的熒光團(tuán)(A)和(B)中的稀土元素以離子鍵，配位鍵 和/或共價(jià)鍵，特別是共價(jià)鍵，連接到至少一個(gè)配體，尤其是多個(gè)配體，優(yōu)選為四配體。在這點(diǎn)上，配體尤其是絡(luò)合劑和/或螯合劑，應(yīng)該以多齒方式，尤其是雙齒方式形 成。在這方面，該配體可與基于一種稀土金屬的核心或中心原子采取多元化的配位鍵，離子 鍵或共價(jià)鍵方式連接。原則上，在本發(fā)明范圍內(nèi)，熒光團(tuán)(A)和(B)可能使用相同或不同的 配體。該相同或不同的配體還可用于各自的熒光團(tuán)(A)或(B)本身。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例，配體特別是絡(luò)合劑和/或螯合劑，是甲基吡啶酸、吡 啶甲酸和/或其衍生物，尤其是取代型衍生物，優(yōu)選為羥基衍生物。為了使熒光團(tuán)與至少一個(gè)其他分子或有機(jī)基間的結(jié)合鍵存在，配體，尤其是絡(luò)合 劑和/或螯合劑，尤其是甲基吡啶酸、吡啶甲酸和/或其衍生物，應(yīng)該包括特別的取代基和/ 或官能團(tuán)更好地與優(yōu)選有機(jī)分子共價(jià)結(jié)合和/或耦合。在這方面，該取代基和/或官能團(tuán) 應(yīng)該選自氨基、羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧樹脂、巰基和羥基。對于其他分子或至 少一個(gè)有機(jī)基的“連接點(diǎn)”因此由各自的熒光團(tuán)(A)或(B)提供。例如，如下所述，有機(jī)分子 可能是一與靶分子或靶結(jié)構(gòu)互補(bǔ)或相互作用的單元。根據(jù)一特別的優(yōu)選實(shí)施例，取代基或官能團(tuán)應(yīng)該是羥基。此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，配體，尤其是絡(luò)合劑和/或螯合劑是羥基甲基吡啶酸和 /或羥基吡啶甲酸是極其有利的。在這方面，至少一個(gè)配體應(yīng)該由上述化合物形成，尤其是 優(yōu)選有機(jī)分子與熒光團(tuán)(A)和/或(B)間的共價(jià)鍵或耦合存在時(shí)。此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，熒光團(tuán)(A)尤其優(yōu)選為根據(jù)圖5所示的有機(jī)金屬配合 物。另外，根據(jù)本發(fā)明提供的熒光團(tuán)(A)可從以下組中選擇四(4-羥基吡啶-2-羧酸) 鋱(III)、三(吡啶-2 -羧酸)-(4-羥基吡啶-2-羧酸)鋱(III)、二 (吡啶-2 -羧酸)-二 (4-羥基吡啶-2-羧酸)鋱(III)、(吡啶-2 -羧酸)-三(4-羥基吡啶-2-羧酸)鋱(III) 和/或其衍生物。關(guān)于用于熒光團(tuán)(A)的化合物，相應(yīng)的鹽類，尤其是鈉鹽，也可被特殊應(yīng)用。
另外，熒光團(tuán)(A)可以是一通式為[Tbx (Pic)y (Pic-Y) J (4_3!￡)_的化合物，在這個(gè)通 式中，
Tb 是鋱(III)， Pic是吡啶，
Y是一個(gè)官能團(tuán)，特別地選自氨基、羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧樹脂、巰基和羥 基，優(yōu)選為羥基，
χ是1到4的整數(shù)，特別為1或2，優(yōu)選為1，且 y和ζ都是0到4的整數(shù)，其中y+z=4。關(guān)于熒光團(tuán)(B)，其可為根據(jù)圖4所示的有機(jī)金屬配合物。在這點(diǎn)上，根據(jù)本發(fā)明，熒光團(tuán)(A)尤其優(yōu)選為根據(jù)圖5所示的有機(jī)金屬配合物， 且熒光團(tuán)(B)尤其優(yōu)選為根據(jù)圖4所示的有機(jī)金屬配合物。此外，熒光團(tuán)(B)可從以下組中選擇四(4-羥基吡啶-2-羧酸)銪(III)、三(吡 啶-2 -羧酸)-(4-羥基吡啶-2-羧酸)銪(III)、二 (吡啶-2 -羧酸)-二(4-羥基吡 啶-2-羧酸)銪(III)、(吡啶-2 -羧酸)_三(4-羥基吡啶-2-羧酸)銪(III)和/或其衍 生物。關(guān)于有關(guān)熒光團(tuán)(B)的化合物，例如相應(yīng)的鹽類，尤其是鈉鹽，也可被應(yīng)用。關(guān)于熒光團(tuán)(B)，可提供通式為[Eux，(Pic’)y，(Pic’ -Y’)z，] (4_3x’)_的化合物，在這 個(gè)通式中，
Eu 是銪(III)， Pic’是吡啶，
Y’是一個(gè)官能團(tuán)，特別地選自氨基、羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧樹脂、巰基和 羥基，優(yōu)選為羥基，
χ’是1到4的整數(shù)，尤其為1或2，優(yōu)選為1，且 y’和ζ’都是0到4的整數(shù)，f +ζ’ =4。例如，F(xiàn)RET對或FRET探針的熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)可通過熒光團(tuán)與一個(gè)分子耦 合或連接而配置，尤其是與一個(gè)生物分子耦合或連接，例如蛋白質(zhì)或其類似物，發(fā)生熒光共 振能量轉(zhuǎn)移，如前所述，產(chǎn)生短的空間距離，且隨著熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)間距的增加發(fā) 射光譜改變，并減少能量轉(zhuǎn)移，這可用作例如分子構(gòu)象變化的尺度或指標(biāo)。同樣并特別地作為FRET對或FRET探針的配置，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，熒光團(tuán)(A)和 熒光團(tuán)(B)可能通過特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基，尤其是連接子和/或間隔子相互耦合 和/或連接。在這點(diǎn)上，由此產(chǎn)生一分子或分子復(fù)合物，其包括熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)及其自 由基。有機(jī)基的目的性選擇和特定熒光團(tuán)(A)和(B)的調(diào)整可優(yōu)化或調(diào)整FRET對或FRET 探針，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)(A)和(B)間距較短，在供體信號(hào)最大限度猝滅時(shí)發(fā)生最優(yōu)的熒光共振能 量轉(zhuǎn)移，隨著間距增加，獲得具有窄帶和較長發(fā)射持續(xù)時(shí)間的發(fā)射光譜的清晰可辨的變化。在本發(fā)明范圍內(nèi)，有機(jī)基應(yīng)該以這樣一種方式選擇，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在 熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)之間。這尤其適用于當(dāng)熒光團(tuán)(A)和(B)間距短時(shí)，例如靶分子或 靶結(jié)構(gòu)沒有相互反應(yīng)時(shí)。因此，熒光共振能量轉(zhuǎn)移能通過間距的目標(biāo)性選擇而被校正或調(diào) 整，小間距，特別是具有短鏈的分子，導(dǎo)致熒光團(tuán)(A)和(B)間的短間距，伴隨著高熒光共振能量轉(zhuǎn)移。然而，長自由基或間隔子也可能導(dǎo)致(A)和(B)間的短間距，例如通過折疊和/ 或連接或雜交過程，其可以分子信標(biāo)為例。由于有機(jī)基引起的熒光團(tuán)(A)和(B)之間間距的分別調(diào)整，因此發(fā)射光譜可被特 定地調(diào)整，特別是有特定波長或發(fā)射帶的發(fā)射光譜也由FRET產(chǎn)生，其在生產(chǎn)范圍內(nèi)或染料 應(yīng)用中相當(dāng)重要，因?yàn)轭伾珜傩钥筛鶕?jù)熒光團(tuán)(A)和(B)之間間距的選擇性調(diào)整而被各自調(diào)整。總的來說，熒光團(tuán)(A)和(B)的間距和熒光共振能量轉(zhuǎn)移及FRET對的發(fā)射波長因 此可通過有機(jī)基的長度，或結(jié)構(gòu)，空間排列或結(jié)構(gòu)而被調(diào)整。有機(jī)基可能通過這樣一種方式 與熒光團(tuán)連接或耦合，例如，有機(jī)基可與絡(luò)合劑和/或配體的各自的取代基和/或各自的官 能團(tuán)相結(jié)合，尤其是如上所述的方式。在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選為有機(jī)基與熒光團(tuán)(A)和/或熒光團(tuán)(B)共價(jià)結(jié)合，尤其是 有機(jī)基優(yōu)選地與熒光團(tuán)(A)和/或(B)的配體的官能團(tuán)共價(jià)連接和/或耦合，和/或包含官 能團(tuán)的有機(jī)基能夠與配體的官能團(tuán)結(jié)合和/或耦合，優(yōu)選為共價(jià)結(jié)合和/或耦合。有機(jī)基特別以這樣一種方式與官能團(tuán)連接或耦合，即相互獨(dú)立的熒光團(tuán)(A)和 (B),與有機(jī)基結(jié)合或耦合，優(yōu)選為末端結(jié)合或耦合，因此，在一定程度上，與各自的有機(jī)基 末端結(jié)合或耦合。在這方面，有機(jī)基可與熒光團(tuán)(A)和/或熒光團(tuán)(B)共價(jià)連接，例如，末端聚氨酯基 團(tuán)的形成，尤其與有機(jī)基相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明，同樣可能提供相互獨(dú)立的熒光團(tuán)，每個(gè)包括一有機(jī)基，例如，根據(jù)本 發(fā)明范圍內(nèi)制備的FRET對用作雜交探針的一 FRET探針的例子中。在這種情況下，有機(jī)基 可能是，例如一寡核苷酸。優(yōu)選地，有機(jī)基與熒光團(tuán)(A)和(B)末端結(jié)合或耦合是存在的，例 如，如果根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用制備的FRET對提供為或用作雜交探針的一 FRET探針。一般情況下，關(guān)于有機(jī)基，其可能是以一能夠與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)相互反應(yīng)的 自由基。該有機(jī)基可能是這樣的，其是一能與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)相互作用的自由基。在本發(fā)明范圍內(nèi)，可能提供有機(jī)基與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)的相互作用和/或相互 反應(yīng)以引起變化，尤其是熒光團(tuán)(A)到熒光團(tuán)(B)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的減少。這可能尤其這樣完成，由于相互作用或相互反應(yīng)，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán) (B)的間距增加，以這種方式，熒光團(tuán)間的能量轉(zhuǎn)移減少且發(fā)射行為因此改變。因此，可通過 樣品發(fā)射光譜的確定(變化)檢測相互作用或相互反應(yīng)。例如，有機(jī)基可能是，或可能包括一核苷酸序列，特別是一 DNA或RNA序列，優(yōu)選為
一寡核苷酸。例如，實(shí)施例可能是這樣的，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用范圍制備的FRET對用作雜交探針、 水解探針和/或分子信標(biāo)。特別是根據(jù)本發(fā)明制備的FRET對用作分子信標(biāo)時(shí)，它可能由核苷酸序列提供，優(yōu) 選包括5’端和3’端互補(bǔ)的核苷酸序列部分，優(yōu)選以這樣一種方式，即在核苷酸序列與靶分 子和/或靶結(jié)構(gòu)不發(fā)生相互反應(yīng)時(shí)，存在互補(bǔ)核苷酸序列的雜交。在一定程度上，核苷酸序 列末端的自雜交的發(fā)生是上述結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的互補(bǔ)末端部分的結(jié)果，該結(jié)構(gòu)是分子信 標(biāo)的特征，以莖環(huán)的形式存在。在這種狀態(tài)下，熒光團(tuán)(A)由于與熒光團(tuán)(B)的距離很短，其 不顯示熒光或熒光較弱。如果環(huán)狀區(qū)域與作為靶分子或靶結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)DNA序列相結(jié)合，例如在PCR循環(huán)中，熒光團(tuán)(A)與熒光團(tuán)(B)的距離增加，在這種情況下，熒光或由減弱的熒光 共振能量轉(zhuǎn)移引起的熒光的變化產(chǎn)生了熒光團(tuán)(A)，且這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知的 儀器或方法觀察或檢測，發(fā)射光譜的變化伴隨著供體熒光的增加和受體熒光的減少。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用制備的FRET對可能是，例如，一分子信標(biāo)(MB)。在這 點(diǎn)上，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)優(yōu)選通過共價(jià)鍵與具有互補(bǔ)核苷酸序列部分的核苷酸序列 相連接構(gòu)成了分子信標(biāo)(MB)，優(yōu)選在5’端和3’端。同樣，在本發(fā)明范圍內(nèi)，有機(jī)基還可能是或包括肽和/或氨基酸序列，特別是寡 肽。在這種情況下，它可能是，例如，酶或定向于各自的靶結(jié)構(gòu)或靶分子的確定的氨基 酸。此外，它還可能是肽或已確定空間結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，有機(jī)基還可能被提供為或包括飽和或不飽和烴基，優(yōu)選 不飽和的支鏈或直鏈烴基。在這方面，優(yōu)選有利的是烴基的鏈長度含有至少2個(gè)碳原子，尤其是2-20個(gè)碳原 子，優(yōu)選為2-15個(gè)碳原子，更優(yōu)選為2-12個(gè)碳原子。如上所述，在這種情況下，烴基的長度應(yīng)該根據(jù)能量轉(zhuǎn)移而選擇，尤其是發(fā)生在熒 光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明一特別優(yōu)選的實(shí)施例，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)與一有機(jī)基，一起構(gòu)成 了根據(jù)圖3所示的通式的復(fù)合物，其中在這個(gè)通式中，η是從1到20的整數(shù)，尤其是2到15， 優(yōu)選為2到12。根據(jù)圖3到5所示的通式，熒光團(tuán)(A)由帶有4個(gè)羥基吡啶甲酸的鋱復(fù)合物構(gòu)成， 熒光團(tuán)(B)由帶有4個(gè)羥基吡啶甲酸的銪復(fù)合物構(gòu)成。熒光團(tuán)通過烴基末端的氨基甲酸乙 酯鍵互相連接。有機(jī)基還可能是包括核苷酸序列和/或氨基酸序列和/或烴基的混合分子。


將參考附圖，以實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，盡管本發(fā)明不局限于此，其中 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)，其包括作為供體熒光團(tuán)的鋱復(fù)合
物(Tb)和作為受體熒光的銪復(fù)合物(Eu)。這兩個(gè)熒光團(tuán)通過有機(jī)基(間隔子或連接子) 相互連接，在這種情況下，所述有機(jī)基優(yōu)選可能是在其兩端包括互補(bǔ)雜交核苷酸的核苷酸 序列。該核苷酸序列的非雜交部分形成了一環(huán)狀區(qū)域。圖1所示的復(fù)合物優(yōu)選代表一目前 為閉合狀態(tài)的分子信標(biāo)(ΜΒ)，在這種情況下，從鋱復(fù)合物到銪復(fù)合物的特別的非輻射能量 轉(zhuǎn)移(ET)發(fā)生于激發(fā)能量的輻射并伴隨著通過銪復(fù)合物的特異性發(fā)射。圖2示出了圖3所示的根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)的光譜。作為從鋱 復(fù)合物到銪復(fù)合物的有效能量轉(zhuǎn)移的結(jié)果，通過鋱復(fù)合物發(fā)射的能量顯著減少或只有很少 的發(fā)射。圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的基于鋱復(fù)合物作為熒光團(tuán)(A)和銪復(fù)合物作為熒光團(tuán) (B)的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)，復(fù)合物通過氨基甲酸乙酯鍵由直鏈烴基形式的有機(jī)基連 接。圖4示出了在本發(fā)明范圍內(nèi)用作熒光團(tuán)(B)的銪復(fù)合物，并且其包括4個(gè)羥基吡啶甲酸作為配體。圖5示出了在本發(fā)明范圍內(nèi)用作熒光團(tuán)(A)的鋱復(fù)合物，并且其包括4個(gè)羥基吡 啶甲酸作為配體。本發(fā)明還涉及(根據(jù)第二方面)一熒光共振能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物(FRET復(fù)合物)，其包 括至少一個(gè)作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一個(gè)作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán) (B)，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)通過特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基，尤其是連接子和/或間 隔子相互耦合和/或連接。根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物的特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和第二 熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物為基礎(chǔ)配置，熒光團(tuán)(A)和 (B)包括彼此不同的稀土元素。根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物可對應(yīng)于通式 DF-S-AF
其中，在這個(gè)通式中，
DF是一供體熒光團(tuán)，優(yōu)選為熒光團(tuán)(A)，
AF為一受體熒光團(tuán)，優(yōu)選為熒光團(tuán)(B)，
S是一特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基，優(yōu)選是連接子和/或間隔子。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)，可參考上述本發(fā)明的應(yīng)用的相關(guān) 結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)同樣適用于根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物。例如，關(guān)于分析方法，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物可以例如雜交探針、水解探針或 分子信標(biāo)的形式配置。而且，本發(fā)明還涉及(根據(jù)第^方面)熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(FRET系統(tǒng))，其包 括至少一個(gè)作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一個(gè)作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán) (B)0根據(jù)本發(fā)明的FRET系統(tǒng)，其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每 個(gè)都以一種稀土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物為基礎(chǔ)配置，熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀 土元素。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，F(xiàn)RET系統(tǒng)可以例如各自的復(fù)合物DF，-M和AF’ _M’的形 式存在，DF'是一供體熒光團(tuán)，優(yōu)選熒光團(tuán)(A)，AF'是一受體熒光團(tuán)，優(yōu)選熒光團(tuán)(B)，M和 M，相互獨(dú)立，其是有機(jī)基，各自的自由基M和M’與供體熒光團(tuán)或受體熒光團(tuán)相結(jié)合，優(yōu)選共 價(jià)結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)每個(gè)都包括一適用的有機(jī)基， 例如，其適用于與靶結(jié)構(gòu)或靶分子(例如核苷酸序列或氨基酸序列)的相互作用和/或相互 反應(yīng)和/或結(jié)合。在這點(diǎn)上，可參考上述有機(jī)基的定義。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例，根據(jù)本 發(fā)明的FRET系統(tǒng)可以是，例如雜交探針。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，因此可能提供為熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè) 含有一有機(jī)基，特別是如上所定義的?？蛇x地，還可能提供熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)通過特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基， 尤其是連接子和/或間隔子相互耦合和/或連接，特別是其如上所定義的。例如，根據(jù)這個(gè)實(shí)施例，相應(yīng)地，可包含分子信標(biāo)?？偟貋碚f，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)可以是如上所述的雜交探針、水 解探針和分子信標(biāo)。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)的能量轉(zhuǎn)移性質(zhì)或參數(shù)可由熒光團(tuán)(A)和(B)及有機(jī)基的特異性選擇而調(diào)整。因此，調(diào)整后的能量轉(zhuǎn)移性質(zhì)可 用于校準(zhǔn)雜交核苷酸分子的分子間距離或間隔，尤其是以分子信標(biāo)的形式，各自的末端配 置有特異性熒光團(tuán)(A)和(B)，從而寡核苷酸形式的有機(jī)基作為間隔子或連接子。使用合適 的靶序列或靶結(jié)構(gòu)的生化感應(yīng)打開環(huán)狀閉合核苷酸序列，以這種方式，當(dāng)環(huán)的末端分開或 分離時(shí)，產(chǎn)生了由改進(jìn)的能量轉(zhuǎn)移引起的改進(jìn)的發(fā)射反應(yīng)。尤其是，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)包括清晰可辨的發(fā)射光譜，發(fā)射 持續(xù)時(shí)間在被合并信號(hào)激發(fā)后的毫秒范圍內(nèi)，因此與非特異性自發(fā)熒光的其他區(qū)別是可能 的。這兩個(gè)因素使免除分析測量信號(hào)的復(fù)雜的激光和評估系統(tǒng)成為可能。此外，熒光團(tuán)間 的小間距提供最佳猝滅，其進(jìn)一步提高了信號(hào)質(zhì)量。此外，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)，可在相應(yīng)地用作生物傳感器的范圍 內(nèi)進(jìn)行一特異性并有意義的實(shí)時(shí)檢測，例如在靶核酸擴(kuò)增時(shí)，降低檢測閾值，特別是在小巧 簡單的溫度循環(huán)器中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)的使用不局限于核酸耦合。因此，根據(jù)本 發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)還可以蛋白質(zhì)的形式存在，作為連接熒光團(tuán)(A)和(B)的 有機(jī)基，在蛋白質(zhì)裂解或其他由于構(gòu)象變化的示例中，例如與配體結(jié)合的示例中，因?yàn)闊晒?團(tuán)(A)和(B)的空間間距的變化而產(chǎn)生發(fā)射光譜的變化。在這種情況下，供體熒光及熒光團(tuán) (A)的發(fā)射熒光也可被確定。因此，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)也可用于蛋白質(zhì) 或肽分析。此外，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)也可用于等溫?cái)U(kuò)增方法，如依賴核酸 序列的擴(kuò)增(NASBA)。根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)還可用于陣列技術(shù)。此外，根 據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)可與固體基質(zhì)結(jié)合或連接，例如用于生物芯片或生物 傳感器。此外，同樣可以考慮將根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)以適配體的形式應(yīng) 用。總之，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)和生物化 學(xué)分析及診斷領(lǐng)域。對于與本發(fā)明第三方面有關(guān)的實(shí)施例，可參考上述關(guān)于本發(fā)明第一和第二方面的 實(shí)施例，其可被相應(yīng)地應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)主題(根據(jù)第四方面)是根據(jù)本發(fā)明上述的FRET復(fù)合物或FRET系 統(tǒng)用于樣品中的項(xiàng)目檢測的應(yīng)用。在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的術(shù)語“項(xiàng)目”，可被解釋為多種含義。例如，該項(xiàng)目可能是 FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)及DNA序列或RNA序列或寡核苷酸之間的相互作用和/或反應(yīng)和 /或雜交，例如在核酸檢測的范圍內(nèi)。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系 統(tǒng)的有機(jī)基優(yōu)選地包括或由核苷酸序列組成。相似地，該術(shù)語“項(xiàng)目”還包括根據(jù)本發(fā)明的 FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)與(多)肽或酶的相互作用和/或相互反應(yīng)和/或結(jié)合。相似地，該 項(xiàng)目也可是肽的裂解或肽與配體的連接。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET 系統(tǒng)的有機(jī)基應(yīng)該優(yōu)選為或包括氨基酸序列或寡肽或多肽。相似地，該項(xiàng)目也可是結(jié)構(gòu)變 化，例如蛋白質(zhì)或類似物的構(gòu)型或構(gòu)象變化。因此，一般地，在一定程度上，該項(xiàng)目是測試樣 品的活性，其尤其導(dǎo)致了熒光團(tuán)(A)與熒光團(tuán)(B)相對彼此間的空間排列或間距的變化，特 別是，由于這種變化，可優(yōu)選地鑒別檢測改變的測量信號(hào)，尤其是，F(xiàn)RET復(fù)合物或FRET系統(tǒng) 的發(fā)射光譜發(fā)生變化，可將這種變化追溯到作為供體的熒光團(tuán)(A)的信號(hào)增強(qiáng)和受體熒光的信號(hào)減弱，是由熒光團(tuán)(A)與(B)的空間間距的增加及熒光共振能量轉(zhuǎn)移的減少引起的。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的應(yīng)用，當(dāng)該項(xiàng)目發(fā)生和/或作為該項(xiàng)目的結(jié)果，F(xiàn)RET復(fù)合 物和/或FRET系統(tǒng)從而可改變其自身的發(fā)射光譜，尤其是在激發(fā)能量的影響和/或作用和 /或應(yīng)用下。此外，當(dāng)該項(xiàng)目發(fā)生和/或作為該項(xiàng)目的結(jié)果，F(xiàn)RET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng) 可發(fā)出可檢測的信號(hào)，尤其是在激發(fā)能量的影響和/或作用和/或應(yīng)用下。根據(jù)本發(fā)明，熒光團(tuán)(A)與(B)的相對排列可由于該項(xiàng)目被改變，尤其是以這樣的 方式，即FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)的發(fā)射光譜被改變和/或發(fā)出可檢測的信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明，相對于該項(xiàng)目改變發(fā)射光譜和/或暫時(shí)延遲檢測信號(hào)，和/或在該項(xiàng) 目發(fā)生后改變發(fā)射光譜和/或產(chǎn)生可檢測的信號(hào)。此外，發(fā)射光譜的改變和/或可檢測的信號(hào)可由時(shí)間分辨熒光測量確定。在這方 面，可以區(qū)別與自發(fā)熒光的發(fā)射光譜的改變或可檢測的信號(hào)。在這點(diǎn)上，有利于將FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)的可檢測的信號(hào)相比較于自發(fā) 熒光延長2倍，尤其是延長5倍，特別是延長10倍，優(yōu)選地延長100倍。最后，如上所述，該項(xiàng)目可能是FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)與靶分子和/或靶結(jié) 構(gòu)，尤其是核苷酸序列，優(yōu)選為DNA或RNA序列，或肽和/或氨基酸序列的相互反應(yīng)和/或 相互作用和/或雜交。此外，該項(xiàng)目可以是空間變化，尤其是FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng) 的構(gòu)型和/或構(gòu)象變化。本發(fā)明的另一個(gè)主題(根據(jù)第五方面)是根據(jù)本發(fā)明上述的FRET復(fù)合物或FRET系 統(tǒng)用于與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)的相互作用及靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)的檢測和/或識(shí)別和/或 測定，尤其通過是FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)的相互作用。因此，靶分子或靶結(jié)構(gòu)可以是核苷酸序列，優(yōu)選為DNA或RNA序列，(多)肽和/或 氨基酸序列，尤其是酶或抗體。相似地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)還可檢測或識(shí)別基于根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或 FRET系統(tǒng)的病毒和微生物(尤其是細(xì)菌)。在這點(diǎn)上，相應(yīng)的根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或 FRET系統(tǒng)的有機(jī)基應(yīng)該以這種方式配置，以使可能存在病毒、微生物(尤其是細(xì)菌)，抗體及 類似物與前述的生物系統(tǒng)的特異性靶結(jié)構(gòu)的相互作用。例如，根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)用作或?qū)嵤┯谖⑸锏淖R(shí)別或量化， 尤其是食品中的微生物的識(shí)別或量化，例如第一次發(fā)生的微生物富集。通過非限制性示例， 還可能發(fā)生的是存在包被有配體的載體，所述配體對待識(shí)別或待定量的微生物具有特異 性。此外，還可能通過抗體包被的微粒發(fā)生富集。在可選的裂解和純化后，相應(yīng)的靶核酸可 使用根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET探針擴(kuò)增。本發(fā)明同樣包括識(shí)別或檢測樣品環(huán)境中靶寡核苷酸的方法，其包括以下步驟首 先使用根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)培養(yǎng)靶核酸，隨后培養(yǎng)物形成放射物并且檢 測熒光發(fā)射，優(yōu)選通過時(shí)間分辨熒光測量檢測。在這點(diǎn)上，例如，實(shí)時(shí)PCR可用于靶核酸的 擴(kuò)增。同樣地，在這方面，靶核酸或根據(jù)本發(fā)明的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)能夠作為FRET 探針與載體相結(jié)合。最后，本發(fā)明涉及(根據(jù)第六方面)根據(jù)本發(fā)明上述的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)用 作染料的用途，尤其是熒光染料，特別是用于標(biāo)記的目的。由于伴隨著基于稀土金屬的特殊熒光的特殊結(jié)構(gòu)的結(jié)果，熒光團(tuán)能以特殊的方式產(chǎn)生特定顏色，作為熒光團(tuán)選擇和熒光團(tuán)之間間距的調(diào)整的結(jié)果，以這種方式根據(jù)本發(fā)明 的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)也特別適合用作染料。關(guān)于染料，作為精確且窄的發(fā)射光譜的結(jié)果，特定的顏色可能在窄譜內(nèi)?？偟膩碚f，本發(fā)明利用鋱復(fù)合物和銪復(fù)合物之間的能量轉(zhuǎn)移或熒光共振能力轉(zhuǎn)移 的基本原理可作為研究結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)發(fā)射及改善生物傳感器或染料復(fù)合物的性質(zhì)的有價(jià)值的 方法。這是本發(fā)明的一明顯優(yōu)勢。此外，本發(fā)明涉及(根據(jù)第七方面)根據(jù)本發(fā)明上述的FRET復(fù)合物或FRET系統(tǒng)用 作生物傳感器或探針，尤其是FRET探針的用途。最后，本發(fā)明涉及(根據(jù)第八方面)一熒光共振能力轉(zhuǎn)移對(FRET對)，其包括至少 兩個(gè)不同的熒光團(tuán)，在FRET中，至少一個(gè)作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一個(gè)作 為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一 種稀土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物為基礎(chǔ)配置，熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。對于其他關(guān)于本發(fā)明第五到第九方面的實(shí)施例，可參考上述與本發(fā)明其他方面相 關(guān)的實(shí)施例，其可被相應(yīng)地應(yīng)用。在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，通過閱讀說明書，本發(fā)明的其他形式、變型和變化 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易辨別并可重現(xiàn)的。將參考下述不限制本發(fā)明的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行解釋說明。
具體實(shí)施例配體改性
將3-氨基吡啶甲酸或3-羥基吡啶甲酸溶解于蒸餾水中，用相應(yīng)數(shù)量的IM NaOH溶液 中和，結(jié)晶出3-氨基吡啶甲酸鈉鹽或3-羥基吡啶甲酸鈉鹽。將0. 3222g的3_氨基吡啶甲酸鈉鹽或3_羥基吡啶甲酸鈉鹽(2 mmol)于真空下 (2 · 10_2毫巴)110°C下干燥3小時(shí)，溶解于大約30mL干燥的二甲基甲酰胺(DMF)，例如， 0. 162mL六亞甲基二異氰酸酯(HDI或OCN-(CH2)6-CNO),或0. U9mL十二亞甲基二異氰酸酯 (DMDI或OCN-(CH2)12-CNO),向惰性氣體中添加(1 mmol)。在惰性氣體存在時(shí)，于90°C下與 3-羥基吡啶甲酸鈉鹽反應(yīng)M小時(shí)或70小時(shí)。90°C在真空下去除DMF。該產(chǎn)品由NaOOC-C5H4N-NH-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-NH-C5H4N-COONa (n = 6 產(chǎn)品為 HDI且η = 12產(chǎn)品為DMDI)與3-氨基吡啶甲酸鈉鹽反應(yīng)，及NaOOC-C5H4N-O-CO-NH-(CH2) n-NH-C0-0-C5H4N-C00Na與3-羥基吡啶甲酸鈉鹽反應(yīng)組成。比較配體與單異氰酸酯(苯異氰酸酯或異氰酸丁酯)及丁基異硫代氰酸酯的改性， 在相同的反應(yīng)中相應(yīng)地制備2 mmol異氰酸酯試劑。絡(luò)合物的合成 四吡啶甲酸復(fù)合物
將0. 4350g吡啶甲酸鈉鹽(3mmol)和0. 1600g 3-氨基吡啶甲酸鈉鹽(或3-羥基吡啶甲 酸鈉鹽)(Immol)溶解于約30mL的DMSO中并加熱(合成只有一種配體類型的復(fù)合物，相應(yīng) 地制備4mmol對應(yīng)的鈉鹽)。0. 3664g EuCl3 · 6H20 (或用于混合復(fù)合物的0. 3730g TbCl3 6H20 或 0. 18324g EuCl3 · 6H20 及 0. 1865g TbCl3 · 6H20) (lmmol)溶解于少量 DMSO 中 并添加配體溶液。該混合物90°C下反應(yīng)2小時(shí)，然后在真空，相同的溫度下蒸餾出DMS0。由此得到的米黃色粉末于四氫呋喃(THF沖煮沸回流1小時(shí)，真空80 ° C下過濾干燥1小 時(shí)。合成具有改性配體的絡(luò)合物，相應(yīng)的制備0.5mmol 二異氰酸酯的改性配體(或 Immol異氰酸酯或異硫氰酸酯的改性配體)，代替Immol 3-氨基吡啶甲酸鈉鹽。由于DMDI-改性配體的溶解性較差，異氰酸酯被稀土復(fù)合物改性將0. 35 mmol復(fù) 合物 NaEuxTb (1-x) (Pic) 3 (Pic-Y) (x = O 到 l,Pic =吡啶甲酸且 Pic-Y = 3-氨基吡啶甲 酸或3-羥基吡啶甲酸)于真空(2 · 10-2毫巴)110°C下干燥3小時(shí)，溶解于約20mL DMSO 中，并在惰性氣體環(huán)境下添加0. 094mL DMDI (0.088 mmol)。該反應(yīng)于氬氣存在時(shí)90 ° C 下進(jìn)行M小時(shí)(或與3-羥基吡啶甲酸反應(yīng)70小時(shí))。真空中相同溫度下蒸餾出DMS0。該 獲得的米黃色粉末于四氫呋喃(THF)中煮沸回流1小時(shí)，真空80°C下過濾干燥1小時(shí)。三吡啶甲酸復(fù)合物
將0. ^OOg吡啶甲酸鈉鹽(2mmol)和0. 1600g 3-氨基吡啶甲酸鈉鹽(或3-羥基吡啶 甲酸鈉鹽)(Immol)溶解于約30mL DMSO中并加熱(合成只有一種配體類型的復(fù)合物，相應(yīng) 地制備3mmol對應(yīng)的鈉鹽)。0. 3664g EuCl3 · 6H20 (或用于混合復(fù)合物的0. 3730g TbCl3 6H20 或 0.1832g EuCl3 · 6H20 及 0. 1865g TbCl3 · 6H20) (lmmol)溶解于少量 DMSO 中并 添加配體溶液。將產(chǎn)生的沉淀過濾，用乙醇清洗并于真空重50°C下干燥1小時(shí)。合成改性配體的絡(luò)合物，相應(yīng)的制備0. 5mmol 二異氰酸酯的改性配體(或Immol 異氰酸酯或異硫氰酸酯的改性配體)，代替Immol 3-氨基吡啶甲酸鈉鹽。合成特定改性配體的絡(luò)合物，例如Eu2[Na00C-C5H4N-0-C0-NH_(CH2) n-NH-C0-0-C5H4N-C00]3，產(chǎn)生的沉淀只在 90-100°C下加熱。標(biāo)記異氰酸酯改性的DNA
將復(fù)合物NaEuXTb(1_x) (Pic)3(Pic-Y)(例如χ = O時(shí)只標(biāo)記為綠色發(fā)光復(fù)合物；χ = 1 時(shí)只標(biāo)記為紅色發(fā)光復(fù)合物；χ = 0. 5時(shí)標(biāo)記為綠色和紅色發(fā)光復(fù)合物；Pic =吡啶甲酸； Pic-Y =3-氨基吡啶甲酸或3-羥基吡啶甲酸)于真空(2 · 10-2毫巴)110°C下干燥3小時(shí)， 溶解于DMSO中，并在惰性氣體環(huán)境下向添加合適量的在干燥的DMSO (摩爾比率Pic-Y: NCO =1:1)中的DNA溶液。該反應(yīng)于氬氣存在時(shí)90°C下進(jìn)行M小時(shí)(或與3-羥基吡啶甲酸反 應(yīng)70小時(shí))。如有必要，在真空中相同溫度下蒸餾出DMS0。標(biāo)記異硫氰酸酯改性的DNA
將復(fù)合物NaEuxTb(1_x) (Pic)3(Pic-Y)(例如χ = 0時(shí)只標(biāo)記為綠色發(fā)光復(fù)合物；χ = 1 時(shí)只標(biāo)記為紅色發(fā)光復(fù)合物；χ = 0. 5時(shí)標(biāo)記為綠色和紅色發(fā)光復(fù)合物；Pic =吡啶甲酸； Pic-Y =3-氨基吡啶甲酸或3-羥基吡啶甲酸)溶解于DMSO中，加入適量的水、DMSO或DMSO/ 水溶液(摩爾比率Pic_Y:NCS = 1:1)的DNA溶液。該反應(yīng)于氬氣存在時(shí)90°C下進(jìn)行24小 時(shí)(或與3-羥基吡啶甲酸反應(yīng)70小時(shí))。如有必要，在真空中相同溫度下蒸餾出DMSO或水。
權(quán)利要求
1.一種至少兩種不同的用于配置熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(FRET對)的熒光團(tuán)的應(yīng)用，在 FRET對中存在至少一種作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一種作為受體熒光團(tuán)的 第二熒光團(tuán)(B)，其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀 土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物為基礎(chǔ)配置，熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)以下種 方式選擇，即從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能量轉(zhuǎn)移在激發(fā)能量的影響和/或作用 和/或應(yīng)用下發(fā)生是極其有利的，特別是從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能量轉(zhuǎn)移至 少以一種實(shí)質(zhì)上非輻射方式發(fā)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，從第一熒光團(tuán)(A)到第二熒光團(tuán)(B)的能 量轉(zhuǎn)移取決于熒光團(tuán)(A)和(B)間的距離，能量轉(zhuǎn)移，尤其是能量轉(zhuǎn)移的強(qiáng)度和/或效率，可 能隨著熒光團(tuán)(A)和(B)空間間距的減小而增加。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致第一熒光團(tuán)(A)的熒光 的減弱和第二熒光團(tuán)(B)的熒光的增強(qiáng)。
5.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)的狀態(tài)與第二 熒光團(tuán)(B)的狀態(tài)重疊，或至少部分重疊。
6.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和/或第二熒光 團(tuán)(B)，相互獨(dú)立，每個(gè)都應(yīng)該包括一種染料，尤其是熒光染料。
7.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，相互獨(dú)立的第一熒光團(tuán)(A)和/ 或第二熒光團(tuán)(B)，每個(gè)包括至少一個(gè)核心，優(yōu)選為一個(gè)由一種稀土元素組成的核心。
8.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，稀土元素選自鈧、釔、鑭、鈰、鐠、 釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥組成的組中。
9.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，稀土元素是選自鑭系元素，尤其 是選自由鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥組成的組中。
10.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，稀土元素選自銪和鋱組成的組中。
11.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)含有鋱作為稀土金 屬，特別是以鋱(III)的形式存在。
12.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(B)含有銪作為稀土金 屬，特別是以銪(III)的形式存在。
13.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)和(B)每個(gè)都與稀 土元素結(jié)合，特別是至少與一個(gè)配體結(jié)合，特別是絡(luò)合劑和/或螯合劑，特別是多個(gè)配體， 優(yōu)選為四配體，和/或相互獨(dú)立的熒光團(tuán)(A)和(B)中的稀土元素以離子鍵、配位鍵和/或 共價(jià)鍵，特別是共價(jià)鍵，連接到至少一個(gè)配體，尤其是多個(gè)配體，優(yōu)選為四配體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，配體尤其是絡(luò)合劑和/或螯合劑，是多 齒配體，尤其是雙齒配體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，配體特別是絡(luò)合劑和/ 或螯合劑，是甲基吡啶酸、吡啶甲酸和/或其衍生物，尤其是取代型衍生物，優(yōu)選為羥基衍 生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13到15中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，配體，尤其是絡(luò)合劑和/或螯合劑，尤其是甲基吡啶酸、吡啶甲酸和/或其衍生物，包括特別的取代基和/或官能團(tuán) 更好地與優(yōu)選有機(jī)分子共價(jià)結(jié)合和/或耦合，特別是，該取代基和/或官能團(tuán)選自氨基、羧 酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧樹脂、巰基和羥基。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于，取代基或官能團(tuán)是羥基。
18.根據(jù)權(quán)利要求13到17中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，配體，尤其是絡(luò)合劑和/ 或螯合劑是羥基甲基吡啶酸和/或羥基吡啶甲酸。
19.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)為根據(jù)圖5的式中 的有機(jī)金屬配合物。
20.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)可從以下組中選 擇四(4-羥基吡啶-2-羧酸)鋱(III)、三(吡啶-2 -羧酸)-(4-羥基吡啶-2-羧酸)鋱 (III)、二 (吡啶-2 -羧酸)_ 二(4-羥基吡啶-2-羧酸)鋱(III)、(批啶-2 -羧酸)-三 (4-羥基吡啶-2-羧酸)鋱(III)和/或其衍生物。
21.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)是一通式為 [Tbx (Pic)y (Pic-Y) J (4_3x)-的化合物，其中，在這個(gè)通式中，Tb 是鋱(III)， Pic是吡啶，Y是一個(gè)官能團(tuán)，特別地選自氨基、羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧樹脂、巰基和羥 基，優(yōu)選為羥基，χ是1到4的整數(shù)，特別為1或2，優(yōu)選為1，且 y和ζ都是0到4的整數(shù)，其中y+z=4。
22.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(B)，是根據(jù)圖4的式中 的有機(jī)金屬配合物。
23.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(B)可從以下組中選 擇四(4-羥基吡啶-2-羧酸)銪(III)、三(吡啶-2 -羧酸)-(4-羥基吡啶-2-羧酸)銪 (III)、二(吡啶-2 -羧酸)_ 二(4-羥基吡啶-2-羧酸)銪(III)、(卩比啶-2 -羧酸)-三 (4-羥基吡啶-2-羧酸)銪(III)和/或其衍生物。
24.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(B)，是一通式為 [Eux, (Pic，)y，(Pic，-Y’)z，] (4_3x’)_的化合物，其中，在這個(gè)通式中，Eu 是銪(III)， Pic’是吡啶，Y’是一個(gè)官能團(tuán)，特別地選自氨基、羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧樹脂、巰基和 羥基，優(yōu)選為羥基，χ’是1到4的整數(shù)，尤其為1或2，優(yōu)選為1，且 y’和ζ’都是0到4的整數(shù)，其中，y’ +ζ’ =4。
25.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)通過 特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基，尤其是連接子和/或間隔子相互耦合和/或連接。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基應(yīng)該以這樣一種方式選擇，以使 熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)之間。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基與各自的配體的取代基和/或各自的官能團(tuán)相耦合和/或結(jié)合，尤其是如前述權(quán)利要求所限定的絡(luò)合 劑和/或螯合劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求25到27中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，優(yōu)選有機(jī)基與熒光團(tuán) (A)和/或熒光團(tuán)(B)共價(jià)結(jié)合，特別是有機(jī)基優(yōu)選地與熒光團(tuán)(A)和/或(B)的配體的官 能團(tuán)共價(jià)連接和/或耦合，和/或特別地有機(jī)基包含能夠與配體的官能團(tuán)結(jié)合和/或耦合 的官能團(tuán)，優(yōu)選為共價(jià)結(jié)合和/或耦合。
29.根據(jù)權(quán)利要求25到洲中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基與熒光團(tuán)(A) 和/或熒光團(tuán)(B)通過(聚)尿烷基的形成而共價(jià)連接。
30.根據(jù)權(quán)利要求25到四中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基是一能夠與靶分 子和/或靶結(jié)構(gòu)相互反應(yīng)的自由基，和/或該有機(jī)基是能與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)相互作用 的自由基。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)之間的相 互作用或相互反應(yīng)，導(dǎo)致從熒光團(tuán)(A)到熒光團(tuán)(B)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的改變，特別是減 少。
32.根據(jù)權(quán)利要求25到31中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基是，或包括一核苷 酸序列，特別是一 DNA或RNA序列，優(yōu)選為一寡核苷酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的應(yīng)用，其特征在于，核苷酸序列，尤其是在5’端和3’端包 括互補(bǔ)的核苷酸序列部分，優(yōu)選以這樣一種方式，即在核苷酸序列部分與靶分子和/或靶 結(jié)構(gòu)不發(fā)生相互反應(yīng)時(shí)，存在互補(bǔ)核苷酸序列部分的雜交。
34.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)優(yōu)選 通過共價(jià)鍵與具有互補(bǔ)核苷酸序列部分的核苷酸序列相連接構(gòu)成了分子信標(biāo)(MB)，優(yōu)選在 5’端和3’端。
35.根據(jù)權(quán)利要求25到31中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基是或包括肽和/ 或氨基酸，特別是寡肽。
36.根據(jù)權(quán)利要求25到31中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，有機(jī)基是飽和或不飽和 烴基，優(yōu)選不飽和的支鏈或直鏈烴基。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的應(yīng)用，其特征在于，烴基的鏈長度含有至少2個(gè)碳原子，尤其是 2-20個(gè)碳原子，優(yōu)選為2-15個(gè)碳原子，更優(yōu)選為2-12個(gè)碳原子。
38.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)與一 有機(jī)基，一起構(gòu)成了根據(jù)圖3所示的通式的復(fù)合物，在這個(gè)通式中，η是從1到20的整數(shù)， 尤其是2到15，優(yōu)選為2到12。
39.一熒光共振能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物(FRET復(fù)合物)，其包括至少一個(gè)作為供體熒光團(tuán)的第 一熒光團(tuán)(A)和至少一個(gè)作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)通過 特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基，尤其是連接子和/或間隔子相互耦合和/或連接，其特征在 于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物 為基礎(chǔ)配置，熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物，其特征在于，F(xiàn)RET復(fù)合物對應(yīng) 于通式DF-S-AF其中，在這個(gè)通式中，DF是一供體熒光團(tuán)，優(yōu)選為熒光團(tuán)(A)，AF為一受體熒光團(tuán)，優(yōu)選為熒光團(tuán)(B)，S是一特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基，優(yōu)選是連接子和/或間隔子。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物，其特征在于，具有權(quán)利要 求1-39的特征部分中的一個(gè)或更多特征。
42.一熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(FRET系統(tǒng))，其包括至少一個(gè)作為供體熒光團(tuán)的第一熒 光團(tuán)(A)和至少一個(gè)作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)，根據(jù)本發(fā)明的FRET系統(tǒng)，其特征在 于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物 為基礎(chǔ)配置，熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán) (B)彼此獨(dú)立，每個(gè)包括一個(gè)有機(jī)基，優(yōu)選如權(quán)利要求沈到37中任一項(xiàng)所限定。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，熒光團(tuán)(A)和 熒光團(tuán)(B)通過特別的二價(jià)和/或雙鍵有機(jī)基，尤其是連接子和/或間隔子相互耦合和/或 連接，特別是如權(quán)利要求25到37中任一項(xiàng)所限定。
45.根據(jù)權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，具有權(quán) 利要求1-38的特征部分中的一個(gè)或更多特征。
46.根據(jù)權(quán)利要求39到41中任一項(xiàng)所述的FRET復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求42到45中任 一項(xiàng)所述FRET系統(tǒng)用于樣品中的項(xiàng)目檢測的應(yīng)用。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的應(yīng)用，其特征在于，F(xiàn)RET復(fù)合物的熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B) 和/或FRET系統(tǒng)的熒光團(tuán)(A)和熒光團(tuán)(B)形成樣品中的FRET對。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)該項(xiàng)目發(fā)生和/或作為該項(xiàng)目 的結(jié)果，F(xiàn)RET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)改變其自身的發(fā)射光譜，尤其是在激發(fā)能量的影響和 /或作用和/或應(yīng)用下，和/或當(dāng)該項(xiàng)目發(fā)生和/或作為該項(xiàng)目的結(jié)果，F(xiàn)RET復(fù)合物和/或 FRET系統(tǒng)發(fā)出可檢測的信號(hào)，尤其是在激發(fā)能量的影響和/或作用和/或應(yīng)用下。
49.根據(jù)權(quán)利要求46到48中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光團(tuán)(A)與(B)的相 對排列可由于該項(xiàng)目被改變，尤其是以這樣的方式，即FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)的發(fā)射 光譜被改變，和/或發(fā)出可檢測的信號(hào)。
50.根據(jù)權(quán)利要求46到49中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，相對于該項(xiàng)目發(fā)射光譜 和/或檢測信號(hào)的改變被暫時(shí)延遲，和/或在該項(xiàng)目發(fā)生后改變發(fā)射光譜和/或產(chǎn)生可檢 測的信號(hào)。
51.根據(jù)權(quán)利要求46到50中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)射光譜和/或可檢測 的信號(hào)的改變可由時(shí)間分辨熒光測量確定，特別是，其可以區(qū)別發(fā)射光譜或可檢測的信號(hào) 的改變與樣品的自發(fā)熒光。
52.根據(jù)權(quán)利要求46到51中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，F(xiàn)RET復(fù)合物和/或FRET 系統(tǒng)的可檢測的信號(hào)相比較于自發(fā)熒光被延長2倍，尤其是延長5倍，特別是延長10倍，優(yōu) 選地延長100倍。
53.根據(jù)權(quán)利要求46到52中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述項(xiàng)目是FRET復(fù)合物 和/或FRET系統(tǒng)與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)的相互反應(yīng)和/或相互作用和/或雜交，尤其是核苷酸序列，優(yōu)選為DNA或RNA序列，或肽和/或氨基酸序列，和/或該項(xiàng)目是空間變化，尤其 是FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)的構(gòu)型和/或構(gòu)象變化。
54.一種根據(jù)權(quán)利要求39到41中任一項(xiàng)所述的FRET復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求42到45 中任一項(xiàng)所述的FRET系統(tǒng)用于與靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)的相互作用及靶分子和/或靶結(jié)構(gòu) 的檢測和/或識(shí)別和/或測定，尤其是FRET復(fù)合物和/或FRET系統(tǒng)與靶分子和/或靶結(jié) 構(gòu)的相互作用。
55.根據(jù)權(quán)利要求M所述的應(yīng)用，其中，靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)是核苷酸序列，優(yōu)選為 DNA或RNA序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求M所述的應(yīng)用，其中，靶分子和/或靶結(jié)構(gòu)是(多)肽和/或氨基酸 序列，尤其是酶或抗體。
57.一種根據(jù)權(quán)利要求39到41中任一項(xiàng)所述的FRET復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求42到45 中任一項(xiàng)所述的FRET系統(tǒng)用作染料的用途，尤其是熒光染料，特別是用于標(biāo)記的目的。
58.一種根據(jù)權(quán)利要求39到41中任一項(xiàng)所述的FRET復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求42到45 中任一項(xiàng)所述的FRET系統(tǒng)用作生物傳感器或探針，尤其是FRET探針的用途。
59.根據(jù)權(quán)利要求M、57和58所述的應(yīng)用，其特征在于具有權(quán)利要求1到38和46到 53的特征部分中的一個(gè)或多個(gè)特征。
60.一熒光共振能力轉(zhuǎn)移對(FRET對)，其包括至少兩個(gè)不同的熒光團(tuán)，在FRET對中，至 少一個(gè)作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一個(gè)作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)， 其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀土元素的有機(jī)金 屬復(fù)合物為基礎(chǔ)配置，熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種至少兩種不同的用于配置熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(FRET對)的熒光團(tuán)的應(yīng)用，其中，在FRET對中存在至少一種作為供體熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)(A)和至少一種作為受體熒光團(tuán)的第二熒光團(tuán)(B)，其特征在于，第一熒光團(tuán)(A)和第二熒光團(tuán)(B)相互獨(dú)立，每個(gè)都以一種稀土元素的有機(jī)金屬復(fù)合物為基礎(chǔ)配置，其中熒光團(tuán)(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102131893SQ200980133260
公開日2011年7月20日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者彼得·克勞斯, 曼弗雷德·里茨 申請人:Inbio 于爾根·布德菲爾德-彼得·克勞斯-曼弗雷德·里茨公司