專利名稱：人源化抗整聯蛋白α9抗體及其應用的制作方法
人源化抗整聯蛋白α9抗體及其應用1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及可免疫特異性地識別人整聯蛋白α 9的人源化抗體，并涉及它們在治 療和診斷各種與整聯蛋白α9有關或涉及整聯蛋白α9的疾病或病癥中的應用，這些病癥 或疾病包括癌癥、炎癥性疾病、自身免疫性疾病等。2.
背景技術：
細胞在一群稱作整聯蛋白(integrins)的細胞表面受體的介導下粘附于細胞外 基質(下文簡稱作ECM)。整聯蛋白通過形成α和β鏈的1 1異源二聚體而發(fā)揮其功能。 迄今為止，已經鑒定和確認了至少18種α鏈、8種β鏈和24種α β異源二聚體。已知每 種整聯蛋白識別一種特異的配體。根據整聯蛋白的配體特異性或功能將整聯蛋白歸為多個 亞家族，并將它們分為存在于纖連蛋白、玻連蛋白等內的膠原蛋白受體、層粘連蛋白受體、 識別Arg-Gly-Asp(RGD)序列的RGD受體，和僅存在于白細胞內的白細胞特異受體(Hynes， R. 0.,2002, Integrins !Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110 673-87 ；Miyasaka,M. ,2000,New edition of Adhesion Molecule Handbook,Shuiunsya)。 α 4和α 9整聯蛋白是一個不屬于上述任何類型的亞家族的成員，該亞家族稱作α 4整聯蛋 白亞家方矣(Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg, RonaldFerrando, Robert Pytela, Sheppard D.，1993, Sequence and Tissue Distribution ofthe Integrin α 9 Subunit, a Novel Partner of β 1 That Is Widely Distributed inEpithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology, 123 1289-97) 0迄今為止ECM被認為僅發(fā)揮細胞間的粘合物質(cementing substance)的作用?，F在已經清楚，整聯蛋白介導的ECM-細胞相互作用顯著地參與了細胞 生長、粘附、移動等的調節(jié)，并與多種疾病的發(fā)生有關，包括癌癥的進展、炎癥加重等。例如，骨橋蛋白(osteopontin)(下文簡稱作0ΡΝ)，一種ECM，是一種分泌型酸性磷 酸化糖蛋白，分子量為大約41kDa，該分子的表達被廣泛發(fā)現于乳汁、尿液、腎小管、破骨細 胞、成骨細胞、巨噬細胞、活化的T細胞、腫瘤組織等。OPN具有粘附序列GRGDS(SEQ ID NO 1)，位于其分子中心；人OPN中的SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序列或小鼠OPN中的SLAYGLR(SEQ ID NO 3)序列；及與其非常鄰近的一個凝血酶切割位點。OPN通過所述GRGDS(SEQ ID NO 1)序列與RGD整聯蛋白結合，或者通過SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序列或SLAYGLR (SEQ ID NO: 3)序列與α4(α4β 1)禾口 α9(α9β 1)整聯蛋白結合。WO 02/081522公開了通過使用OPN敲除小鼠或針對OPN的中和抗體抑制OPN的功 能對風濕性關節(jié)炎或肝炎的治療效果。而且，該公開文獻表明，SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序 列通過識別α9和α 4整聯蛋白對于炎癥性疾病的發(fā)病是至關重要的，并且OPN受體在免 疫活性細胞等內表達并與炎癥性疾病有關。已經發(fā)現，α9和α 4的結合譜的差異在于，α 4 β 1既結合未被凝血酶切割的 OPN(未切割的0ΡΝ)，也結合被凝血酶切割后OPN的N端片段(已切割的0ΡΝ)，而α 9 β 1 僅結合已切割的 OPN(Y. Yokosaki，et al. , (1999) TheJournal of Biological Chemistry, 274 36328-36334 ；P. Μ. Green, et al. , (2001)FEBS Letters, 503 75-79 ；S.Τ.Barry, et al. , (2000)Experimental Cell Research，258 :342_351)。
除了 OPN之外，α 4和α 9整聯蛋白有許多共同的配體。已知的配體有纖連蛋白 的EDA域、前肽-血管性血友病因子(prop印tide-von Willebrandfactor，pp-vWF)、組織 轉谷氨酰胺酶(tTG)、凝血因子XIII、血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)等。此外，纖連蛋白的 CS-I域、MadCAM-I (α 4β 7)等已知是被α 4整聯蛋白特異識別的配體。生腱蛋白-C、纖溶 酶等已知是被α9整聯蛋白特異識別的配體。整聯蛋白亞單位α 9、α 4和β 1的氨基酸序列是公知的。例如，在GenBank中，人 α 9被登記為ΝΜ_002207，小鼠α 9被登記為ΝΜ_133721，人α 4被登記為ΝΜ_000885，小鼠 α 4被登記為ΝΜ_010576，人β 1被登記為Χ07979，小鼠β 1被登記為ΝΜ_010578。還已知 這些整聯蛋白的氨基酸序列在物種間高度相似。3.發(fā)明概要盡管目前已知有多種治療癌癥、炎癥性疾病和自身免疫性疾病的藥物，但是人們 仍然希望開發(fā)對癌癥、炎癥性疾病和自身免疫性疾病具有更好的治療效果的預防和/或抑 制劑等。本發(fā)明是部分地基于本發(fā)明人的如下發(fā)現，即針對整聯蛋白α 9的特異性抑制抗 體具有抑癌和抗炎作用。先前，本發(fā)明人分離了可免疫特異性地識別人整聯蛋白α 9的小鼠單克隆抗體， 它們是由雜交瘤克隆1K11、21C5、24I11、25B6和28S1 (保藏號分別是FERM BP_10510、FERM BP-10511、FERM BP-10512、FERMBP-10513 和!7ERM BP-10832)產生的，并分離了可免疫特 異性地識別小鼠整聯蛋白α 9的小鼠單克隆抗體，它們是由雜交瘤克隆18R18D、12C4’ 58、 11L2B 和 55A2C(保藏號分別是 FERM ABP_10195、FERM ABP-IO196、FERM ABP-IO197 和 FERM ABP-10198)產生的。這里，雜交瘤克隆的名稱可以和由該克隆產生的單克隆抗體的名稱互 換使用。所有這些小鼠抗人α 9整聯蛋白抗體均是IgGl同種型。這些單克隆抗體中的一 些可抑制人和/或小鼠整聯蛋白α9與整聯蛋白α9的配體(例如骨橋蛋白)之間的結 合。因此，這些抗整聯蛋白α9抗體可抑制整聯蛋白α 9的功能，并對癌癥，例如癌細胞的 生長或轉移，和炎癥性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖 尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病(潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫 性疾病等，具有治療作用。而且，本發(fā)明的抗整聯蛋白α 9抗體可以用作體內診斷劑，用于檢測受試者體內 整聯蛋白α 9表達的存在和水平，藉此診斷涉及整聯蛋白α 9的疾病或病癥。然而，因為這些單克隆抗體是小鼠來源的，由于它們在人體內的免疫原性可能導 致不良作用，這妨礙了它們直接應用于人體的診斷或治療。為了降低免疫原性，本發(fā)明人制 備了一種人源化抗體，它們具備作為所述人源化抗體來源的原始小鼠抗整聯蛋白α 9抗體 所展示的生物學活性。因此，本發(fā)明提供了一種可免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其 抗原結合片段，所述抗體包括部分地衍生自非人類來源且部分地衍生自人類來源的抗原結 合區(qū)。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結合片段包括衍生自非人 類來源(供體)，例如1K11、21C5、24I11、25B6和28S1單克隆抗體，的互補決定區(qū)(CDR)，和 衍生自人類來源(受體)的框架區(qū)(FR)。在一個實施方案中，所述人源化抗體或其抗原結 合片段可抑制人α9整聯蛋白與人α9整聯蛋白的配體之間的結合。在一個具體的實施方案中，所述可免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其抗原結合片段包括(i)重鏈(H鏈)，其包括至少一個衍生自人H鏈可變區(qū)(V區(qū)) 的H鏈FR (FRH)，和至少一個H鏈互補決定區(qū)(⑶RH)，所述⑶RH衍生自可免疫特異性地識 別人α 9整聯蛋白的非人類抗體的CDRH中的至少一個；或(ii)輕鏈(L鏈)，其包括至少一 個衍生自人L鏈V區(qū)的L鏈FR(FRL)，和至少一個L鏈互補決定區(qū)(⑶RL)，該⑶RL衍生自 可免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的非人類抗體的CDRL中的至少一個；或(iii)上面的
(i)和(ii)。例如，所述非人類抗體，作為本發(fā)明人源化抗體中的至少一個CDRH和/或至 少一個⑶RL的來源，是由從下組選出的雜交瘤產生的單克隆抗體保藏號FERM BP-10510、 FERM BP-10511、FERMBP-10512、FERM BP-10513 和 FERM BP-10832。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結合片段包含(i) 至少一個衍生自人FRH的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6中的氨基酸序列；或(ii)至少一個衍生自人FRL的FRL，以及至少一個⑶RL，所 述⑶RL包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :11、12和13中的氨基酸序列；或(iii)同時包含上 面的⑴和(ii)。所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段包含CDRH1、CDRH2和CDRH3， 它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6?；蛘?，所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結 合片段包含⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :11，12和13。在一 個優(yōu)選實施方案中，所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段包含CDRHl、CDRH2、CDRH3、 CDRL1、CDRL2和CDRL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :4、5、6、11、12和13。又或者， 所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段包含從由GenBank登錄號No. X65891 (SEQ ID NO 18)編碼的人H鏈可變區(qū)衍生的FRH，或從由GenBank登錄號No. X72441 (SEQID NO 23) 編碼的人κ-L鏈可變區(qū)衍生的FRL。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明人源化抗體的FRH包 含至少一個選自氨基酸序列SEQ ID NO :19、20、21和22(FRH1、FRH2、FRH3和FRH4，分別由 X65891的相應部分編碼)中的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明人源化抗體 的FRL包含至少一個選自氨基酸序列SEQ ID NO :24、25、26和27 (FRL1、FRL2、FRL3和FRL4， 分別由X72441的相應部分編碼)中的氨基酸序列。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的 人源化抗體或其抗原結合片段包括(i) H鏈可變區(qū)(VH區(qū))，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 29;或(ii)L鏈可變區(qū)(VL區(qū))，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :31 ；或(iii)上面的⑴和
(ii)。在另一個優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結合片段包括(i) 至少一個衍生自人FRH的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :32、33和34中的氨基酸序列；或(ii)至少一個衍生自人FRL的FRL，以及至少一個 ⑶RL，所述⑶RL包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :37、38和39中的氨基酸序列；或(iii)上 面的(i)和(ii)。所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段可以包括CDRH1、CDRH2和 ⑶RH3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID N0:32、33和34?；蛘?，所述的本發(fā)明人源化抗體 或其抗原結合片段包括⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :37、 38和39。在一個優(yōu)選實施方案中，所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段包括CDRH1、 CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2 和 CDRL3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID NO :32、33、34、37、 38 禾口 39。在另一個優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結合片段包括(i) 至少一個衍生自人FRH的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包含選自氨基酸序列SEQID NO :42、43和44中的氨基酸序列；或(ii)至少一個衍生自人FRL的FRL，以及至少一個 ⑶RL，所述⑶RL包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :47、48和49中的氨基酸序列；或(iii)上 面的(i)和(ii)。所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段可以包括CDRH1、CDRH2和 ⑶RH3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :42、43和44。或者，所述的本發(fā)明人源化抗體 或其抗原結合片段包括⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :47、 48和49。在一個優(yōu)選實施方案中，所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段包括CDRH1、 CDRH2, CDRH3, CDRL1、CDRL2 和 CDRL3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID NO :42、43、44、47、 48 禾P 49。在另一個優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結合片段包括(i) 至少一個衍生自人FRH的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :52、53和54中的氨基酸序列；或(ii)至少一個衍生自人FRL的FRL，以及至少一個 ⑶RL，所述⑶RL包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :57、58和59中的氨基酸序列；或(iii) 上面的(i)和(ii)。所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段可以包括CDRH1、CDRH2 和⑶RH3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :52、53和54?；蛘?，所述的本發(fā)明人源化 抗體或其抗原結合片段可以包括⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID N0:57、58和59。在一個優(yōu)選實施方案中，所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段包括 CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDRLl、CDRL2 和 CDRL3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID NO :52、53、 54、57、58 和 59。在另一個優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結合片段包括(i) 至少一個衍生自人FRH的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :62、63和64中的氨基酸序列；或(ii)至少一個衍生自人FRL的FRL，以及至少一個 ⑶RL，所述⑶RL包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :67、68和69中的氨基酸序列；或(iii)上 面的(i)和(ii)。所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段可以包括CDRH1、CDRH2和 ⑶RH3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :62、63和64的。或者，所述的本發(fā)明人源化抗 體或其抗原結合片段包括⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :67、 68和69。在一個優(yōu)選實施方案中，所述的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段包括CDRH1、 CDRH2、CDRH3，CDRLl、CDRL2 和 CDRL3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID NO :62、63、64、67、 68 和 69。本發(fā)明進一步提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼可免疫特異性地識別人 α9整聯蛋白的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。具體地，本發(fā)明提供 了一種分離的核酸分子，其包含這樣的核苷酸序列，該序列編碼包含從SEQ ID Ν0:4、5、6、 32、33、34、42、43、44、52、53、54、62、63和64中選出的至少一種氨基酸序列的人源化H鏈，或 包含從 SEQ ID NO :11、12、13、37、38、39、47、48、49、57、58、59、67、68 和 69 中選出的至少一 種氨基酸序列的人源化L鏈，或者所述人源化H鏈和所述人源化L鏈二者。在一個優(yōu)選的 具體實施方案中，這樣的分離的核酸分子包括編碼VH區(qū)的核苷酸序列SEQ ID Ν0:28，或編 碼氨基酸序列SEQ ID NO :29的核苷酸序列。在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，這樣的分離 的核酸分子包括編碼VL區(qū)的核苷酸序列SEQ ID NO :30，或編碼氨基酸序列SEQ ID NO 31 的核苷酸序列。在另外一個優(yōu)選的具體實施方案中，這種分離的核酸分子同時包括核苷酸 序列SEQ ID Ν0:28和30。在另外一個優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子進一步包括編碼供體來源的信號肽(例如氨基酸序列SEQ ID N0:10和17，分別地)或異種 來源的信號肽的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供了一種載體，例如表達載體，其包括編碼本發(fā)明的可免疫特異 性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其抗原結合片段的H鏈和/或L鏈的核苷酸序列。 在這樣的載體中，本發(fā)明的核苷酸序列可與一種或多種調節(jié)元件可操作連接。本發(fā)明的核 苷酸序列可以包括編碼信號肽的核苷酸序列，其中所述信號肽是作為CDR來源的非人類供 體抗體的天然信號肽，或者是異種來源的信號肽。而且，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，其包含本發(fā)明的核酸分子，包括含有本發(fā)明核 酸分子的載體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的宿主細胞，其包括編碼本發(fā)明 人源化H鏈的第一核酸分子和編碼本發(fā)明人源化L鏈的第二核酸分子，所述第一和第二核 酸分子各自與調節(jié)元件可操作連接，使得有生物功能的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結合片 段得以被表達。因此，本發(fā)明進一步提供了一種用于制備本發(fā)明人源化抗體的方法，其包括在使 得所述人源化抗體表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞；并收集所產生的人源化抗體。本發(fā)明進一步提供了 一種組合物，其包含至少一種本發(fā)明的人源化抗體。此外，本 發(fā)明提供了一種用于預防或治療與α9整聯蛋白有關的病癥或疾病的藥物組合物，其包含 至少一種本發(fā)明的人源化抗體和可藥用的載體。所述任何一種組合物均可進一步包含其它 可以加和性或協同性地改善疾病或病癥的活性化合物。這樣的活性化合物包括，但不僅限 于，抗炎化合物、化療化合物，等等，以及抗體或其抗原結合片段，例如能夠免疫特異性地結 合人α 4整聯蛋白的抗體。在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種用于預防或治療與α 9整聯蛋白有關或涉及 α 9整聯蛋白的疾病或病癥的方法，所述方法包括向需要的受試者施用預防或治療有效量 的至少一種本發(fā)明人源化抗體。對于這類應用，本發(fā)明的人源化抗體可以和可增強該人源 化抗體生物學效應的治療性模塊偶聯。這樣的治療性模塊的實例包括另一種抗體，例如抗 α 4抗體(例如形成雙特異性抗體)，細胞生長抑制性或細胞殺傷性的細胞毒素，放射性元 素，和/或其它治療劑，包括抗炎劑、抗生素等。在另外一個方面中，本發(fā)明提供了一種用于診斷受試者體內與α 9整聯蛋白有關 或涉及α 9整聯蛋白的病癥或疾病的方法，所述方法包括向待檢查的受試者施用診斷有效 量的本發(fā)明人源化抗體。對于這類診斷應用，本發(fā)明的人源化抗體可以用可檢測的標志物， 例如放射性元素，標記。3. 1 定義如這里所使用的，術語“抗體”是指能夠免疫特異性地結合期望抗原，例如α 9整 聯蛋白，的抗體分子，并且涵蓋完整抗體或其片段，包括抗原結合片段。這里使用的術語“免疫特異性地識別”是指抗體或其抗原結合片段特異性地結合 靶多肽或蛋白(尤其是人α9整聯蛋白)的能力。這樣的抗體不與其它多肽或蛋白非特異 性結合。然而，免疫特異性結合靶多肽或蛋白(例如人α9整聯蛋白)的抗體或其抗原結 合片段可能和其它抗原交叉反應。例如，本發(fā)明可免疫特異性地識別人α9整聯蛋白的人 源化抗體或其抗原結合片段可能與例如鼠α9整聯蛋白交叉反應。優(yōu)選地，可免疫特異性 地結合人α 9整聯蛋白的抗體或其抗原結合片段不與其它抗原交叉反應。
這里使用的術語“抗原結合片段”是指抗體的保留有免疫特異性結合靶多肽或蛋 白(特別是人α 9整聯蛋白和/或小鼠α 9整聯蛋白)的能力的任意片段，包括單鏈抗體、 Fab片段、F(ab' )2片段、二硫鍵連接的Fvs，以及含有輕鏈(VL)可變區(qū)和/或重鏈(VH)可 變區(qū)或者甚至互補決定區(qū)(CDR)的可以特異性結合靶多肽或蛋白的片段。因此，人源化抗 體的這種抗原結合片段可以包含或者可以不包含部分或全長人類恒定區(qū)。各種用于獲得上 述抗體片段的方法在本領域是眾所周知的。這里使用的術語“衍生自人類來源”或“衍生自非人類來源”是指這樣的抗體部分， 其氨基酸序列衍生自人類抗體或非人類抗體的相應部分。這里使用的術語“受體序列”是指來自人類抗體的VH或VL區(qū)的框架區(qū)的核苷酸 或氨基酸序列，所述框架區(qū)充當來自供體抗體(通常是非人類抗體)的CDR的受體。4.附圖簡述

圖1顯示了小鼠24111 VH cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO :7)和推導氨基酸序 列(SEQ ID NO :8)。氨基酸殘基用單字母編碼顯示。信號肽序列(SEQID NO=IO)用斜體 標記。成熟VH的N端氨基酸殘基(E)用雙下劃線標記。根據Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991)定義的 CDR 序列用下劃線標記。圖2顯示了小鼠24111 VL cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)和推導的氨基酸序 列(SEQ ID N0:15)。氨基酸殘基用單字母編碼顯示。信號肽序列(SEQ ID N0 17)用斜體 標記。成熟VL的N端氨基酸殘基⑶用雙下劃線標記。根據Kabat等(1991)定義的⑶R 序列用下劃線標記。圖3顯示了兩側有SpeI和HindIII位點(下劃線)的設計的24111 VH基因的核 苷酸序列(SEQ ID NO 72)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。氨基酸殘基用單字母編 碼顯示。信號肽序列(SEQ ID N0 10)用斜體標記。成熟VH的N端氨基酸殘基(E)用雙下 劃線標記。根據Kabat等(1991)定義的⑶R序列用下劃線標記。內含子序列用斜體標記。圖4顯示了兩側有NheI和EcoRI位點(下劃線)的設計的24111 VL基因的核苷 酸序列(SEQ ID NO 73)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO :15)。氨基酸殘基用單字母編碼 顯示。信號肽序列(SEQ ID NO 17)用斜體標記。成熟VL的N端氨基酸殘基(D)用雙下劃 線標記。根據Kabat等(1991)定義的⑶R序列用下劃線標記。內含子序列用斜體標記。圖5顯示了 pCh24Ill和pHu24Ill (統稱“表達載體”)的結構示意圖。從頂部的 SalI位點出發(fā)順時針方向，質粒包含以人類巨細胞病毒(CMV)主立即早期啟動子(major immediate early promoter)和增強子(CMV啟動子)的重鏈轉錄單位，用于起始抗體重鏈 基因的轉錄。CMV啟動子后面是VH外顯子，一段含有人類Yl重鏈恒定區(qū)的基因組序列，其 包括CH1、鉸鏈、CH2和CH3外顯子以及間插的內含子，和一個位于CH3后面的、用于mRNA加 工的Y-I基因多聚腺苷酸位點。在重鏈基因序列之后，輕鏈轉錄單位從CMV啟動子開始， 隨后是VL外顯子和一段含有人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)及其前面的部分內含子的基因組 序列，和κ基因的多聚A信號。輕鏈基因的后面是SV40早期啟動子(SV40啟動子)、大腸 桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(gpt)和一個含有SV40多聚腺苷酸位點(SV40 poly(A)位點)的區(qū)段。最后，質粒含有質粒pUC19的一部分，包括細菌復制起點(pUC ori) 和β內酰胺酶基因(β內酰胺酶)。
圖 6 顯示了 24111 VH(SEQ ID NO :9)、人源化 24111 (Hu24Ill) VH(SEQID NO 29) 和人類受體序列 FRHl (SEQ ID NO :19)、FRH2 (SEQ ID NO :20)、FRH3 (SEQ ID NO :21)禾口 FRH4 (SEQ ID NO 22)的氨基酸序列比對，這些序列衍生自由GenBank登錄號No. X65891的 核苷酸序列編碼的氨基酸序列。氨基酸殘基用單字母編碼顯示。序列上方的數字表示根據 Kabat等(1991)的位置。由Kabat等(1991)定義的⑶R序列用下劃線標記。雙下劃線標 記的殘基被預測與⑶R接觸，并且在人源化形式中在這些位置上保留小鼠殘基。圖中省略 了 X65891中的CDR殘基。圖 7 顯示了 24111 VL (SEQ ID NO 16)、人源化 24111 VL (SEQ ID NO 16)和人類 受體序列 FRLl (SEQ ID NO 24), FRL2 (SEQ ID NO 25), FRL3 (SEQID NO 26)禾口 FRL4(SEQ ID NO 27)的氨基酸序列比對，這些序列衍生自由GenBank登錄號No. X72441的核苷酸序 列編碼的氨基酸序列。氨基酸殘基用單字母編碼顯示。序列上方的數字表示根據Kabat等 (1991)的位置。由Kabat等(1991)定義的CDR序列用下劃線標記。雙下劃線標記的殘基 被預測與⑶R接觸，并且在人源化形式中在這些位置上保留小鼠殘基。圖中省略了 X72441 中的⑶R殘基。圖8顯示了用于構建Hu24Ill VH基因的寡核苷酸。圖9顯示了用于構建Hu24Ill VL基因的寡核苷酸。圖10顯示了用于構建兩側有SpeI和HindIII位點的Hu24Ill VH基因(SEQ ID N0:74在5’端有5’-GGG尾巴，在3’端有CCC-3’尾巴)的寡核苷酸。箭頭指示每條寡核 苷酸的位置和方向(5，到3，)。信號肽(SEQ ID NO 10)和VH區(qū)(SEQ ID NO 29)的氨基
酸殘基用單字母編碼顯示。圖11顯示了用于構建兩側有NheI和EcoRI位點(SEQ ID NO :75在5，端有5，_GGG 尾巴，在3’端有CCC-3’尾巴)的Hu24Ill VL基因的寡核苷酸。箭頭指示每條寡核苷酸的 位置和方向(5，到3，)。信號肽(SEQ ID NO 17)和VL區(qū)(SEQ ID NO 31)的氨基酸殘基
用單字母編碼顯示。圖12顯示了兩側有SpeI和HindIII位點(下劃線)的Hu24Ill VH基因的核苷 酸序歹Ij (SEQ ID NO 74)，以及信號肽(SEQ ID NO 10 ；斜體顯示)和VH區(qū)(SEQ ID NO 29) 的推導氨基酸序列。氨基酸殘基用單字母編碼顯示。成熟VH的N端氨基酸殘基(Q)用雙 下劃線標記。根據Kabat等(1991)定義的⑶R序列用下劃線標記。內含子序列用斜體標記。圖13顯示了兩側有NheI和EcoRI位點(下劃線)的Hu24Ill VL基因的核苷酸 序歹丨J (SEQ ID NO 75)，以及信號肽(SEQ ID NO 17 ；斜體顯示)和VL區(qū)(SEQ ID NO 31) 的推導氨基酸序列。氨基酸殘基用單字母編碼顯示。成熟VL的N端氨基酸殘基(D)用雙 下劃線標記。根據Kabat等(1991)定義的⑶R序列用下劃線標記。內含子序列用斜體標記。圖14顯示了嵌合24111抗體和人源化24111抗體與人α 9整聯蛋白親和性之間 的比較。通過細胞ELISA考察了 1和0. Syg/ml的嵌合和人源化24111與CHO/α 9細胞的 結合。實驗重復進行三次。圖中顯示了平均吸光度值和SEM。圖15顯示了小鼠、嵌合和人源化24111抗體與人α 9整聯蛋白結合的FACS分析 結果。測試每種抗體在1，0. 33，0. 11，0. 037和0. 012yg/ml下與CHO/hu α 9細胞的結合。該圖中，以幾何平均通道熒光值(MCF ；Y軸)在被測的每種抗體濃度(X軸)作圖。圖16顯示了抗人α 9整聯蛋白抗體對人α 9/CH0-K1細胞與hOPN(RAA)N_half、生 腱蛋白-C、VCAM-I或人纖連蛋白之間細胞粘附抑制活性的結果。圖17顯示了在抗人整聯蛋白α4抗體的存在下，抗人α9整聯蛋白抗體對人黑素 瘤細胞的細胞粘附抑制作用的結果。圖18顯示了抗整聯蛋白α 4抗體和抗α 9整聯蛋白抗體對肝炎的治療效果。在 圖中，NHG指示正常倉鼠抗體，NRG指示正常大鼠抗體。圖19顯示B16-BL6細胞的生長被抗α 9整聯蛋白抗體抑制。圖20顯示了使用抗人α 9整聯蛋白抗體對人α 9/CH0-K1細胞(圖20a)、人α 4/ CHO-Kl (圖20b)和人嗜中性粒細胞(圖20c)的FACS分析結果。圖21顯示了在使用固定的VCAM-I作為ECM時，抗α 9整聯蛋白抗體對B16-BL6 細胞生長的抑制。圖22顯示了抗α 9整聯蛋白抗體在小鼠類風濕性關節(jié)炎模型中的治療作用。5.發(fā)明詳細說明5. 1針對人α 9整聯蛋白的抗體的制備可以免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白或其任何表位的抗體可以通過任何合適 的本領域已知方法來產生。在本發(fā)明中用作抗原的α 9整聯蛋白可以是⑴衍生自所有表達α 9整聯蛋白 的人類細胞或所有存在這些細胞的組織的蛋白質；(2) α 9整聯蛋白編碼基因DNA(優(yōu)選地 cDNA)被轉染進入細菌、酵母、細胞系包括動物細胞系等并表達而得的重組蛋白質；或(3) 合成蛋白質。α 9整聯蛋白包括包含與人α 9整聯蛋白(SEQ ID NO :76，其中殘基1_29是信號 肽)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。這里，術語“包含基本上相同氨基酸序列的多肽”是指這樣的變體多肽，其包含這 樣的氨基酸序列，其中有多個氨基酸，優(yōu)選地1-10個氨基酸，更優(yōu)選地，1個至數個(例如 1-5)氨基酸被替換、刪除和/或修飾，只要這些變異體多肽仍具有與天然存在的人α 9整聯 蛋白基本上等價的生物學性質；以及這樣的變體多肽，其包含這樣的氨基酸序列，其中有多 個氨基酸，優(yōu)選地1-10個氨基酸，更優(yōu)選地，1個至數個(例如1-5個)氨基酸被添加到天 然存在的人α9整聯蛋白的氨基酸序列。而且，變體多肽可以是具有多個這樣的氨基酸替 換、刪除、修飾和添加的多肽。作為本發(fā)明抗原的人α 9整聯蛋白可以通過本領域眾所周知的方法加以產生，除 了基因重組技術之外，還可以使用例如化學合成方法、細胞培養(yǎng)方法等，或者它們的修改形 式。用于產生變體多肽的方法實例包括合成寡核苷酸定點突變(缺口雙鏈體法 (gapped duplex method))、涉及通過用亞硝酸鹽或亞硫酸鹽處理隨機引入點突變的點突 變方法、涉及用Bal31酶或其它酶制備刪除突變體的方法、盒式誘變、接頭掃描法、錯誤摻 入法(miss incorporation method)、錯配引物法、DNA區(qū)段合成法等。在本發(fā)明中用作抗原的人α 9整聯蛋白還包括所述α 9整聯蛋白的“部分”。如這 里所使用的，“部分”是指包含與α 9整聯蛋白配體(例如0ΡΝ、VCAM-I、生腱蛋白-C等)結合所需區(qū)域的部分；具體地說，包含成熟人α 9整聯蛋白(SEQ ID NO 76的第30-第1035 個氨基酸殘基)第14-第980個氨基酸殘基的部分，和包含第11-第981個氨基酸殘基的 部分。所述α 9整聯蛋白的“部分”可以根據下文所述的本領域已知方法通過基因重組或 化學合成或其修改形式來產生，或者可以通過用蛋白水解酶等適當地消化通過細胞培養(yǎng)方 法分離的人α 9整聯蛋白來產生。作為抗原，也可以使用在細胞膜或其膜級分上過表達α9整聯蛋白的細胞本身。 過表達人α 9整聯蛋白的細胞可以通過本領域眾所周知的重組DNA技術加以制備。使用如上所述制備的合適抗原，可以通過本領域眾所周知的各種方法制備特異針 對人α9整聯蛋白或其任意表位的抗體?？梢酝ㄟ^本領域眾所周知的各種程序產生針對人 α 9整聯蛋白的多克隆抗體。例如，可以將目的抗原施用于多種宿主動物，包括但不限于， 家兔、小鼠、大鼠等，誘導含有抗原特異多克隆抗體的抗血清的產生?？梢允褂酶鞣N佐劑以 提高免疫響應，這取決于宿主物種，包括但不限于，弗氏佐劑(完全或不完全)、礦物凝膠例 如氫氧化鋁、表面活性物質例如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇類(pluronicpolyols)、聚 陰離子、肽、油乳液、鑰孔血藍蛋白、二硝基苯酚，和潛在可用于人類的佐劑，例如BCG(卡介 苗)和短棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。這些佐劑也是本領域眾所周知的。單克隆抗體可以使用本領域已知的多種技術加以制備，包括使用雜交瘤、重組、噬 菌體展示技術或其組合。例如，單克隆抗體可以用雜交瘤技術產生，所述雜交瘤技術包括 本領域己知的禾口例如下列文獻中教導的Harlow等，Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed.1988) ；Hammerling 等，Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas,pp. 563-681 (Elsevier,N. Y.，1981)(本文通過提述并 入兩篇文獻的全部內容)。這里使用的術語“單克隆抗體”不僅限于通過雜交瘤技術產生 的抗體。術語“單克隆抗體”是指衍生自單個克隆，包括任何真核、原核或噬菌體克隆，的抗 體，并不指產生它們的方法。用雜交瘤技術產生和篩選特異抗體的方法是常規(guī)的并且是本領域眾所周知的。在 一個非限制性實例中，可以用感興趣的抗原或表達這種抗原的細胞對小鼠進行免疫。一旦 檢測到免疫響應，例如在小鼠血清中檢測到特異針對該抗原的抗體，即收集小鼠的脾臟并 分離脾細胞。然后通過眾所周知的技術將脾細胞與任何合適的骨髓瘤細胞(例如P3U1， P3X63-Ag8，P3X63-Ag8-Ul，P3NSl-Ag4，SP2/0-Agl4，P3X63-Ag8-653 等)融合。通過有限稀 釋對雜交瘤進行篩選和克隆。然后通過本領域已知的方法對雜交瘤克隆進行測定，檢測分 泌能夠結合該抗原的抗體的細胞?？梢酝ㄟ^用陽性雜交瘤克隆對小鼠進行腹腔接種以產生 腹水，其一般含有高水平的抗體。識別特異表位的抗體片段可以通過已知技術加以產生。例如，Fab和F(ab’)2片 段可以通過用酶，例如木瓜蛋白酶(用于產生Fab片段)或胃蛋白酶(用于產生F(ab’ )2 片段)，對免疫球蛋白分子進行蛋白酶切割加以產生。F(ab’)2片段含有完整的輕鏈和重鏈 的可變區(qū)、CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)。本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段還可以通過任何本領域已知的用于合成抗體的 方法來產生，特別是通過化學合成，或者優(yōu)選地，通過重組表達技術產生。編碼抗體的核苷酸序列可以從本領域技術人員能夠獲得的任何信息來獲得(即， 從Genbank、文獻或者通過常規(guī)克隆和序列分析)。如果含有編碼特定抗體或其表位結合片段的核酸的克隆無法獲得，但是該抗體分子或其表位結合片段的序列已知，則可以化學合 成編碼該免疫球蛋白的核酸，或者通過使用可與序列的5’端雜交的合成引物進行PCR擴 增，從合適的來源[例如抗體cDNA文庫，或者從任何表達該抗體的組織或細胞(例如被選 擇用于表達抗體的雜交瘤細胞)產生的cDNA文庫或從其分離的核酸，優(yōu)選為poly A+RNA] 獲得編碼該免疫球蛋白的核酸，或者通過用特定針對特殊基因序列的寡核苷酸探針進行克 隆，從編碼該抗體的cDNA文庫中鑒定出例如cDNA克隆。PCR產生的擴增核酸隨后可通過任 何本領域眾所周知的方法克隆到可復制的克隆載體內。5. 2重組抗體的制備—旦確定了抗體的核苷酸序列，就可以用本領域眾所周知的核苷酸序列操作 方法對抗體的核苷酸序列進行操作，例如重組DNA技術、定點誘變、PCR等(見例如前文 Sambrook 等中描述的技術；禾口 Ausubel 等編，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & SonS，NY，本文通過提述并入其全部內容)，通過向抗體的表位結合 域區(qū)域或任何可能提高或降低抗體生物學活性的抗體部分內引入例如氨基酸替換、刪除、 和/或插入，而產生具有不同氨基酸序列的抗體。抗體的重組表達需要構建含有編碼該抗體的核苷酸序列的表達載體。一旦獲得了 編碼抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其一部分的核苷酸序列，就可以通過使用如前面部分 討論的本領域眾所周知的技術通過重組DNA技術產生用于產生抗體分子的載體。本領域技 術人員眾所周知的方法可以用于構建含有抗體編碼序列和合適轉錄和翻譯控制信號的表 達載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術和體內遺傳重組。可以將編碼重 鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈和輕鏈可變區(qū)、重鏈和/或輕鏈可變區(qū)表位結合片段、或抗體 的一個或多個互補決定區(qū)(⑶幻的核苷酸序列克隆到這樣的載體內，用于表達?？梢允惯@ 樣的序列和編碼原始抗體的天然信號肽或異源信號肽的多核苷酸融合。然后可以將這樣制 備的表達載體引入到合適的宿主細胞內，用于表達該抗體。因此，本發(fā)明包括含有編碼可免 疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其抗體結合片段的多核苷酸的宿主細胞?？梢杂帽景l(fā)明的兩種表達載體共轉染宿主細胞，第一個載體編碼衍生自重鏈的 多肽，第二個載體編碼衍生自輕鏈的多肽。兩個載體可以含有相同的選擇標記，以便同等 (equal)表達重鏈和輕鏈多肽，或含有不同的選擇標簽，以確保維持這兩種質粒?；蛘?，可以 使用編碼并且能夠表達重鏈和輕鏈多肽二者的單個載體。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包含 cDNA或基因組DNA。在另一個實施方案中，抗體還可以用本領域已知的各種噬菌體展示方法來產生。 在噬菌體展示方法中，功能性抗體域被展示在攜帶有它們的編碼多核苷酸序列的噬菌體顆 粒的表面上。在一個特定的實施方案中，這樣的噬菌體可用于展示從全套或組合抗體文庫 (例如人或鼠)表達的抗原結合域，例如Fab和Fv或二硫鍵穩(wěn)定化Fv。對于展示與感興 趣的抗原結合的抗原結合域的噬菌體，可以用抗原來選擇或鑒定它們，例如使用標記抗原 或結合或捕獲于固體表面或珠子上的抗原。在這些方法中使用的噬菌體典型地為絲狀噬菌 體，包括fd和M13?？乖Y合域被表達作為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白融合的重 組融合蛋白?？捎糜谥圃毂景l(fā)明的免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示方法的實例包括在 如下文獻中公開的方法Brinkman etal.，J. Immunol. Methods, 182 :41_50，1995 ；Ames et al. , J. Immunol. Methods, 184 177—186,1995 ；Kettleborough et al. , Eur. J. Immunol.,24 952-958,1994 ；Persic et al. , Gene,187 9-18,1997 ；Burton et al. , Advances in Immunology, 57 191-280,1994 ；PCT 申請 No.PCT/GB91/01134 ;PCT 公開 TO 90/02809 ； WO 91/10737 ；WO 92/01047；WO 92/18619 ；WO 93/11236；WO 95/15982 ；WO 95/20401 ；和 美國專禾Ij Nos. 5，698，426 ；5，223，409 ；5，403，484 ；5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ； 5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ；5，780，225 ；5，658，727 ；5，733，743 和 5，969，108，本文通過提述并入上述所有文獻的全部內容。如在上述參考文獻中介紹的，在噬菌體選擇之后，可以從噬菌體分離出抗體編碼 區(qū)，并用它們產生完整抗體，包括人抗體，或者產生任何其它期望的片段，并在任何期望的 宿主內表達，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母、細菌，例如將在下文詳細介紹 的。例如，也可以采用重組產生Fab，Fab'和F(ab’)2片段的技術，其中可以使用本領域 已知的方法，例如在下列文獻中公開的方法PCT公布WO 92/22324 ；Mullinax et al.， BioTechniques, 12(6) :864_869，1992 ；禾口 Sawai et al.，AJRI，34 :26_34，1995 ；禾口 Better et al. , Science，240 :1041-1043，1988(本文通過提述并入上述所有文獻的全部內容)。 可以用于產生單鏈Fvs和抗體的技術的實例包括在下列文獻中介紹的技術美國專利 Nos. 4，946，778 禾口 5，258，498 ；Huston et al. ,Methods in Enzymology, 203 46-88,1991 ； Shu et al.，PNAS，90 -.7995-7999,1993 ；和 Skerra et al.，Science，240 1038-1040，1988。一旦通過上述任何方法產生了本發(fā)明的抗體分子，就可以用任何本領域已知的用 于純化免疫球蛋白分子的方法加以純化，例如通過色譜(例如離子交換色譜、親和色譜，特 別是經蛋白A或蛋白G純化后借助針對特定抗原的親和性，和大小排阻柱色譜)、離心、差異 溶解性、或任何其它用于純化蛋白的常規(guī)技術。進一步，本發(fā)明的抗體或其片段可以和本文 所述的或者本領域已知的異源多肽序列相融合以幫助純化。對于一些應用，包括抗體在人體內的體內使用和體外檢測試驗，可以優(yōu)選地使用 嵌合、人源化或人抗體。嵌合抗體和人源化抗體在下文5. 3部分中有詳細討論。在體外免疫測定、純化方法(例如親和色譜)以及體內治療或診斷應用中，可 以使用與其它化合物或異源多肽融合或偶聯的抗體。見例如PCT公布WO 93/21232 ； EP 439，095 ；Naramura et al.，Immunol. Lett.，39 :91_99，1994 ；美國專利 5，474，981 ； Gillies et al.，PNAS，89 :1428_1432，1992 ；和Fell et al.，J. Immunol.，146 :2446_2452， 1991，本文通過提述并入它們的全部內容。例如，抗體可以用已知方法或商業(yè)可得的試劑盒 以多種方式加以標記(例如生物素標記、FITC標記、APC標記)。作為另一個實例，可以將 抗體和可在體內提高抗體生物學效應的治療性模塊偶聯。這些治療性模塊的實例包括另一 種抗體，細胞生長抑制性或細胞殺傷性的細胞毒素，放射性元素，和/或其它治療劑，包括 抗炎劑、抗生素等。在本發(fā)明中，人源化抗人α 9整聯蛋白抗體可以和另一種抗體(例如抗 α抗體)偶聯(以便例如形成雙特異性抗體)。作為另一個實例，本發(fā)明的人源化抗體可 以用可檢測的標志物(例如放射性元素)加以標記，用于體內診斷用途。5. 3嵌合和人源化抗體嵌合抗體是這樣的分子，其中抗體的不同部分來源于不同的動物物種，例如抗 體具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和衍生自人免疫球蛋白的恒定區(qū)。用于產生嵌合 抗體的方法是本領域已知的。見例如Morrison，Science，229 :1202，1985 ;0i et al.， BioTechniques,4 214 1986 ；Gillies et al. , J. Immunol. Methods, 125 191-202,1989 ；美國專利Nos. 5，807，715 ；4, 816，567 ；和4，816，397，本文通過提述并入其全部內容。人源化抗體是這樣的分子，其結合期望的抗原，并包含如下所述的可變區(qū)該可變 區(qū)含有一個或多個衍生自非人物種的互補決定區(qū)(CDR)和一個或多個衍生自人免疫球蛋 白分子的框架區(qū)。典型的非人類抗體人源化方法已經在多種參考文獻中有描述，例如Queen et al.，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 10029-10033 和美國專利 Nos. 5，585，089 和 5, 693, 762 ；Riechmann etal. ,Nature, 332 :323,1988 ；禾口 Tsurushita et al. ,Methods 36 69-83，2005，本文通過提述并入上述所有文獻的全部內容。例如，Tsurushita等(2005， 前文；下文稱作“Tsurushita”)的參考文獻提供了一種根據Queen等(1989，前文)最初 開發(fā)的抗體-人源化方法改進的用于小鼠單克隆抗體人源化的實際且有指導性的方案。 Tsurushita中公開的通用方案簡述如下。5. 3. 1.用于制備人源化抗體的通用方案小鼠V基因克降和測序有多種方法可用于克隆編碼目標小鼠單克隆抗體VH和VL區(qū)的cDNA。例如，使用 SMART RACE cDNA 擴增試劑盒(BD Biosciences, CA)或 GeneRacer 試劑盒(Invitrogen, CA)的5’RACE(CDNA末端快速擴增)方法已經被普遍使用。根據靶單克隆抗體H鏈和L鏈 的同種型可以制備用于5’ RACE的基因特異引物，從而能夠結合每條H鏈和L鏈可變區(qū)的 直接下游。因此，5’ RACE引物可以被設計成對小鼠的每個亞型(例如γ 1，y 2a, γ 2b或 Y3)特異?；蛘撸梢愿鶕喰烷g的共有或高度同源區(qū)設計用于所有亞型的通用引物。在 Tsurushita中，公開了如下的5’ RACE引物作為舉例⑴ 5，-GCCAGTGGATAGACTGATGG- (SEQ ID NO 129)(用于克隆小鼠 Y 1, Y 2a, y 2b 和Y3H鏈)(ii) 5‘ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC- (SEQ ID NO 130)(用于克隆小鼠 κ 輕鏈)PCR擴增的V基因片段可以被直接克隆到質粒載體內，例如使用ZeroBlimt Τ0Ρ0 PCR克隆試劑盒(Invitrogen)，并確定它們的DNA序列。對所得的序列應當加以確認，例如 通過將其編碼的氨基酸序列與目標單克隆抗體的氨基酸序列進行比較，該靶單克隆抗體的 序列通過N端氨基酸測序來確定，例如通過使用Model 241蛋白測序儀(Hewlett-Packard， CA)。典型地，確定目標抗體N端的至少15-20個氨基酸殘基，例如通過例如Edman降解，即 足以確認所克隆的DNA序列的真實性。Tsurushita提醒，當N端氨基酸是谷氨酰胺-小鼠 N端氨基酸最常見的兩種氨基酸之一-時，它可能已被轉換成焦谷氨酸(pyroglutamine)并 可阻斷N端測序。在這種情況下，必須將N端去阻斷以獲得序列。V區(qū)的三維建模首先，基于VH 和 VL 區(qū)的序列，依照例如 R. Levy et al. , 1989,Biochemistry 28: 7168-7175 和 B. Zilber et al.，1990，Biochemistry29 10032-10041 介紹的方法，鑒定對 于保持⑶R構象結構具有潛在重要性的目標抗體框架殘基。典型地，將每一個VH和VL區(qū) 分成14個結構上有意義的區(qū)段，它們是包含免疫球蛋白超家族域結構的β折疊片和類環(huán) 結構。在PDB數據庫中，將每個來自目標抗體的區(qū)段的氨基酸序列與結構已知的抗體的相 應區(qū)段進行比對(見 H. M.Berman et al. ,2000, Nucleic Acids Res. 28 :235_342)。通過 多重序列比對，選擇與每個目標區(qū)段具有最高序列同源性的相應區(qū)段，并構建V區(qū)的三維 模型。為了使結構最優(yōu)化，將模型進行多個循環(huán)的共軛梯度能量最小化(例如使用ENCAD，或如 Press et al. , 1990,"Numerical Recipes, Cambridge University Press, Cambridge 所述；AMBER，如 Weiner et al.，1981，J. Comp. Chem. 2 :287_303 所述；3D-JIG-SAW，可在由 Cancer Research UK 運營的 BioMolecularModelling 或"BMM”網站訪問；或 SWISS-MODEL， 可在由 Swiss Institute of Bioinformatics,Geneva 運營的 ExPASy Proteomics Server 網站訪問)。人框架的詵擇與V區(qū)結構建模并行地，將分別依據小鼠VH和VL區(qū)cDNA克隆推導出的氨基酸 序列與數據庫中，例如 Kabat 數據庫(見 Johnson et al.，2000，Nucleic Acids Res. 28 214-218.)、GenBank等，的人V區(qū)序列進行比較。與小鼠序列具有至少大約65%、至少大約 70%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、或者至少大約95%整體同一性的人框 架序列可以使用，例如，Smith-Waterman 算法(Gusf ield，1997，‘‘Algorithms on Strings, Trees, andSequences，，，Cambridge University Press, Cambridge)或 BLAST (Karlin et al. , 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)等來檢索。這些人序列可以以基于 cDNA的序列或者是蛋白質衍生序列為基礎；然而，常常優(yōu)選地使用胚系(germline)，因 為胚系可有助于消除與基于cDNA的或蛋白質衍生的序列中的體細胞高度突變(somatic hypermutations)相關的潛在免疫原性?；蛘撸鏠ueen等(1989，前文)中介紹的，使用共 有框架序列也能夠鑒定和除去從基于cDNA的或蛋白質衍生的序列獲得的框架內的這些超 突變殘基。在使用胚系VH區(qū)段作為受體框架的情況下，應當使用14號染色體，而非15和 16號染色體上編碼的VH片段，因為只有14號染色體上的VH片段可產生有功能的VH區(qū)。人源化V區(qū)的設計根據Queen等(1989，前文)，必須鑒定⑶R的大約4_6人內的框架氨基酸，因為這 些殘基被認為是支持正確CDR結構的潛在的關鍵框架殘基。這個過程可以用根據原子坐標 計算原子間距離的計算機程序來實現，或者通過計算機模型進行人工檢查來實現，所述計 算機程序例如 RASM0L，其可以在由 National Science Foundation (NSF)支持的 Molecular VisualizationFreeware網站訪問。如果關鍵框架位置處的氨基酸在小鼠供體與人受體序 列之間不同，則通常用小鼠供體的氨基酸代替人類殘基。然而，如果這些殘基對支持CDR結 構的貢獻極小，則通常使用相應的人類殘基。另外，如果所選的人類受體含有“非典型”氨 基酸，此類氨基酸在少于大約10-20%的V區(qū)序列中出現，則它們可能是在親和力成熟期間 發(fā)生了體細胞高度突變的結果，應當用供體殘基代替它們，以避免人體內的潛在免疫原性。此外，為了設計人源化的V區(qū)，還需要仔細考慮其它的因素，例如潛在N連接糖基 化信號的殘基(詳見Tsurushita)。取決于治療用途所需要獲得的或需要消除的效應物功能，人源化抗體可以含有衍 生自人抗體的人κ或λ輕鏈和/或γ 1、γ 2、γ 3、γ 4、μ、α 1、α 2、δ，或ε重鏈的人 類恒定區(qū)或其一部分，或其變異體。例如，含有突變的恒定區(qū)Fc部分可以和本發(fā)明嵌合或 人源化抗體的可變區(qū)融合，從而減少抗體與Fc受體的結合，和/或減少其修復(fix)補體 的能力(見例如 Winter et al. , GB2, 209, 757 B ；Morrison et al.，WO 89/07142, Morgan et al.，WO 94/29351)。這些抗體分子操作可以借助在5. 2部分介紹的重組DNA技術來實 施。優(yōu)選地，所得的嵌合或人源化抗體具有與非人類供體抗體相同的特異性，并具有與非人類供體抗體相似的或者至少為其大約1/3、至少大約1/2、或至少大約2/3的親和力。 在另一方面中，所得的嵌合或人源化抗體的親和力常數為至少大約IxlO7M-1,優(yōu)選地至少大 約IxlO8M^并且最優(yōu)選地至少大約IxlO9MA除了上述的通用方案之外，抗體可以用本領域已知的多種技術進行人源化， 包括例如 CDR 移植(EP 239，400 ；PCT 公布 WO 91/09967 ；美國專利 Nos. 5，225，539 ； 5，530，101 和 5，585，089)，飾面或表面重修(EP 592，106 ；EP519, 596 ；Padlan, Molecular Immunology,28 (4/5) 489-498,1991 ；Studnicka etal., Protein Engineering,7 (6) 805-814,1994 ；Roguska et al. , Proc Natl. Acad. Sci. USA，91 :969_973，1994)，和鏈改組 (chain shuffling)(美國專利No. 5，565，332)，本文通過提述并入這些文獻的全部內容。5. 3. 2用于制備人源化抗體作為藥物的其它考慮為了提供用作藥物的人源化抗體，需要為其準備一個高效、持續(xù)的產生系統。例 如，通過插入H和L鏈序列來制備用于人源化抗體的合適表達載體，并且可以獲得用該表達 載體轉染的高產率細胞系作為主細胞庫(master cell bank MCB)的種子細胞，其充當工作 細胞庫(working cell bank, WCB)的穩(wěn)定和半永久性來源。然后，可通過培養(yǎng)來自WCB的 工作細胞并收集培養(yǎng)基來制備人源化抗體。多種具有合適調節(jié)基因的表達載體均可用于制備這種生產細胞系。作為宿主細 胞，可以使用常用于表達哺乳動物蛋白質的細胞來表達人源化抗體。這些宿主細胞的實例 包括，但不限于，中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、SP2/0-Agl4. 19細胞、NSO細胞等?？梢酝ㄟ^選 擇表達載體與宿主細胞的最佳組合使人源化抗體的生產率最大化。而且，應當探索培養(yǎng)基 的組成，以便從各種無血清培養(yǎng)基和補充物中選擇合適的介質，使宿主細胞的人源化抗體 表達得以最優(yōu)化。根據效率和最終的產率，可以用本領域眾所周知的各種方法從培養(yǎng)上清純化由宿 主細胞產生的人源化抗體，包括親和色譜、離子交換色譜、疏水互作色譜等。5. 4藥物組合物和治療用途本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含如上所述的可免疫特異性地識別人α 9整 聯蛋白的人源化抗體或其抗體結合片段。包含本發(fā)明人源化抗體作為活性成分的藥物組 合物可用作預防和/或治療與α 9整聯蛋白有關的疾病或病癥的藥劑，所述疾病或病癥包 括但不限于，癌癥，例如癌細胞的生長和轉移，和炎癥性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié) 炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、癌癥轉移、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病 (潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫性疾病等。包含本發(fā)明人源化抗體的藥物組合物還可用于治療器官移植后的慢性排斥，和 自身免疫性疾病，例如全身性自身免疫性疾病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白賽氏病(Behcet’ s disease)、多肌炎、增生性腎小球腎炎、結節(jié)病等。包含本發(fā)明人源化抗體的用于預防或治療上述疾病或病癥的預防和/或治療劑， 具有低毒性，通過與合適的溶劑混合直接作為液體制備物，或者作為呈合適劑型的藥物組 合物，能夠經口或腸胃外施用給人類。用于上述施用的藥物組合物含有前述抗體或其鹽，以及可藥用的載體、稀釋劑或 賦形劑。這種組合物以適于口服或胃腸外施用的劑型提供。劑量可以根據待施用的受試者的年齡、體格、目標疾病、狀況、施用途徑等而改變。當抗體用于預防和/或治療例如成年患者的類風濕性關節(jié)炎時，有利的是通過靜脈內施用 本發(fā)明抗體，通常為單個劑量大約0. 01-大約20mg/kg體重，優(yōu)選地大約0. 1-大約10mg/kg 體重，更優(yōu)選地大約0. 1-大約5mg/kg體重，每天大約1-5次，優(yōu)選地大約每天1-3次。在 其它胃腸外施用和口服施用中，抗體可以按照相應于上面給定劑量的劑量施用。當狀況特 別嚴重時，劑量可以根據狀況而增加。各種輸送系統是已知的，并可用于施用本發(fā)明的藥物組合物，例如包裹在脂質體、 微顆粒、微膠囊內，能夠表達突變病毒的重組細胞，受體介導的內吞(見例如Wu and Wu, 1987，J. Biol. Chem. 262 =44294432)。導入的方法包括，但不僅限于，皮內、肌內、腹膜內、靜 脈內、皮下、鼻內、硬膜外和經口途徑?；衔锟梢酝ㄟ^任何方便的途徑施用，例如通過輸注 或推注，通過上皮細胞或黏膜襯里(例如口腔黏膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并可以和其它 生物活性劑一起施用。施用可以是全身性的或局部的。也可以采用肺部施用，例如通過使 用吸入器或噴霧器并與氣溶膠化劑配方。在一個具體實施方案中，可能希望將本發(fā)明的藥物組合物局部施用于需要治 療的區(qū)域；這可以通過包括但不限于下述的方法實現手術期間的局部灌注、局部施加 (topical application)，例如與手術后的創(chuàng)口包扎一起進行，通過注射、通過導管、通 過栓劑、通過鼻噴霧、或通過植入體，所述植入體是有孔、無孔或膠狀材料，包括膜，例如 sialastic膜，或纖維。在一個實施方案中，施用可以是通過在被感染組織部位(或之前部 位)直接注射。在另一個實施方案中，藥物組合物可以用在囊泡，特別是脂質體中投遞(見 Langer,1990, Science 249 1527-1533 ；Treat et al. , in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler(eds. ), Liss, New York, pp. 353-365 (1989) ；Lopez-Berestein,上文，pp. 317-327 ；通見上文)。在另外一個實施方案中，藥物組合物可以用控釋系統投遞。在一個實施方案 中，可以使用泵(見 Langer,前文；Sefton, 1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 201 ； Buchwald et al.，1980，Surgery 88 507 ；禾口 Saudek et al.，1989，N. Engl. J. Med. 321 574)。在另一個實施方案中，可以使用聚合物材料(見Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Pres. , Boca Raton, Florida(1974)； Controlled Drug Bioavailability, Drug ProductDesign and Performance, Smo1en and Ball (eds.), Wiley, New York(1984) ；Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 61 (1983) ；seealso Levy et al. , 1985, Science 228:190 ；During et al.，1989，Ann. Neurol. 25 351 ；Howard et al.，1989，J. Neurosurg. 71 105)。在另外一 個實施方案中，可以將控釋系統置于組合物的目標的附近，這樣就僅需要全身劑量的一部 分(見例如 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,前文，vol. 2, pp. 115-138(1984))。其它的控釋系統在 Langer (Science 249 1527-1533 (1990))的綜述 中有討論。用于口服給藥的組合物實例包括固體或液體劑型，具體地，藥片(包括糖衣和薄 膜包衣的藥片)、藥丸、顆粒、粉末制備物、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳劑、懸浮液等。這種 組合物通過公知的方法制造，并包含在藥物制備領域中通常使用的載體、稀釋劑或賦形劑 中。用于藥片的載體或賦形劑實例有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
可注射的制備物可以包括用于靜脈內、皮下、皮內和肌肉內注射、點滴注射等的劑 型。這些可注射制備物可以通過公知的方法制備。可注射制備物可以通過例如將上述抗體 或其鹽溶解、懸浮或乳化在常規(guī)用于注射的無菌水介質或油介質內加以制備。用于注射的 水介質有例如生理鹽水、含有葡萄糖和其它助劑的等滲溶液等，其可以與合適的增溶劑聯 合使用，例如醇(例如乙醇)、多元醇(polyalcohol)(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面 活性劑[例如聚山梨醇80(polysorbate 80)，HC0-50 (氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加 合物)]等。作為油介質，可以采用例如芝麻油、大豆油等，它們可以與增溶劑聯合使用，例 如苯甲酸芐酯、苯甲醇等。這樣制備的注射劑優(yōu)選地填充在合適的安瓿小瓶內。用于直腸 給藥的栓劑可以通過將前述抗體或其鹽與常規(guī)的栓劑基質混合加以制備。有利地，上述用于經口或胃腸外使用的藥物組合物被制備成與活性成分的某個劑 量相符合的單位劑量劑型(dosage forms in a unit dose)。這類單位劑量劑型包括例如 片劑、藥丸、膠囊、注射劑(安瓿小瓶)、栓劑等。所含的前述抗體的量一般為每個單位劑量 劑型大約5-500mg ；特別地，在注射劑型中，優(yōu)選地含有大約5-100mg前述抗體，對于其它劑 型，為大約10-250mg。上述的每種組合物可以進一步包含其它的活性化合物，除非配方會導致與上述抗 體發(fā)生任何不良相互作用。本發(fā)明還涉及細胞和/或組織重塑的抑制劑和/或促進劑，其包括α 9整聯蛋白 結合性功能分子(例如0ΡΝ、VCAM-1、生腱蛋白-C、纖連蛋白、pp-vWF、tTG等)作為活性成 分；并涉及用于抑制和/或促進細胞和/或組織重塑的方法，其包括使表達α9整聯蛋白的 細胞和/或組織(例如腫瘤細胞、嗜中性粒細胞、平滑肌等)與α 9整聯蛋白結合性功能分 子接觸。在這種治療劑中活性成分的劑量、給藥方法、藥物制備等可以參考前述包含本發(fā)明 的人源化抗體的藥物的說明合適地加以確定。如上所述，本發(fā)明進一步提供了用于預防或治療涉及α 9整聯蛋白或與α 9整聯 蛋白有關的疾病或病癥的方法，所述方法包括向需要的受試者施用有效量的至少一種本發(fā) 明人源化抗體。5. 5診斷用途包含本發(fā)明人源化抗體的藥物組合物可以用作如下疾病的診斷劑癌癥，例如癌 細胞的生長和轉移，和炎癥性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖 維化、糖尿病、癌癥轉移、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫等，或作為下述疾病的診斷劑器官 移植后慢性排斥，自身免疫性疾病，例如全身性自身免疫性疾病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白賽 氏病、多肌炎、增生性腎小球腎炎、結節(jié)病等。本發(fā)明的人源化抗體能夠特異識別α 9整聯 蛋白，因此能夠用于定量試液中的α 9整聯蛋白，特別是用于通過夾心式免疫測定、競爭性 測定、免疫測量、濁度滴定法等、免疫染色等等的定量。在本發(fā)明的測試方法中應用這些免 疫學方法時，不需要陳述任何特定的條件、程序等。通過在常規(guī)條件和程序的基礎上加以本 領域的普通技術上的考慮就足以構建測定系統。關于這些一般技術手段的細節(jié)，可以參考 綜述、教科書等。如上所述，使用本發(fā)明的抗體可以高敏感度地定量α 9整聯蛋白。本發(fā)明的人源 化抗體特別有用于通過應用體內定量α9整聯蛋白的方法診斷各種與α9整聯蛋白有關的 疾病。例如，當檢測到α 9整聯蛋白的表達水平增加或降低時，即可診斷某人很可能正患有與α 9整聯蛋白有關的疾病，例如癌癥或炎癥性疾病，或者某人很可能將來會患上這些疾 病。因此，本發(fā)明還提供了用于診斷受試者涉及α9整聯蛋白或與α9整聯蛋白有關的疾 病或病癥的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用有效量的至少一種本發(fā)明人源化抗 體或兩種均施用。用于這種體內診斷的所需劑量可能少于治療用途所需的劑量，并可以由 本領域的技術人員根據常規(guī)程序加以確定。本發(fā)明的人源化抗體還可用于特異性檢測試液(例如體液、組織等)中存在的α 9 整聯蛋白。所述人源化抗體還可用于制備純化α 9整聯蛋白用的抗體柱、用于在純化時檢 測每一組分中含有的α 9整聯蛋白、或用于分析整聯蛋白α在測試細胞內的行為。6.實施例下面的實施例舉例說明了可免疫特異性識別人和/或小鼠α 9整聯蛋白的單克隆 抗體的制備，單克隆抗體可變區(qū)的測序，抗體的表位作圖和其它表征，這些抗體的嵌合和人 源化，以及所得的嵌合和人源化抗體的表征。這些實施例不應理解為限制性。6. 1針對人α 9整聯蛋白的小鼠抗體的制備針對人α 9整聯蛋白的小鼠單克隆抗體根據消減免疫法(Williams C. V. ,etal.， 1992，Biotechniques 12:842-847)加以制備。簡而言之，三只Balb/c小鼠以4xl06細 胞/小鼠腹腔注射CHO-Kl細胞。隨后2天內，對小鼠環(huán)磷酰胺腹腔給藥，劑量為4mg/小 鼠。環(huán)磷酰胺注射后2周時，對小鼠進行腹腔注射表達人α 9整聯蛋白的CHO-Kl細胞(人 α 9/CH0-K1細胞)，劑量為2χ106細胞/小鼠。在2周后再用相同的細胞以3χ106細胞/ 小鼠再進行一次腹腔注射。通過本領域眾所周知的方法制備雜交瘤(見例如Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. 1988) ；Hammerling, et al. , in :Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier,N. Y.，1981)。建立了產生與人α 9/CH0-K1細胞免疫特異性反應，但 不與表達人整聯蛋白α 4的CHO Kl細胞反應的單克隆抗體的雜交瘤克隆，并分離了 5個產 生可免疫特異性識別人α 9整聯蛋白的單克隆抗體的雜交瘤克隆(即1K11，21C5，24I11， 25B6 和 28S1)。6. 2抗人α 9整聯蛋白單克隆抗體的表位分析制備了多個12殘基多肽，它們從人α 9整聯蛋白的N端及隨后每隔3個殘基開 始(即氨基酸殘基1-12，4-15，7-18，以此類推)，并以5nmol/點將它們藉由C6間隔臂和 2 β Ala殘基偶聯到纖維素膜上。用封閉緩沖液(牛奶/0.05%Tween20溶于PBS)封閉膜， 并使之與IOml如下所述的溶液在室溫下反應3小時，該溶液含有1. O μ g/ml用過氧化物酶 標記的每種抗人0 9整聯蛋白單克隆抗體(即分別是11(11，2比5，24111和2586)。用1^^5 清洗后，使膜與增強化學發(fā)光(ECL)檢測試劑在室溫下反應1分鐘。測量由于酶反應而發(fā) 射的冷光，并根據發(fā)光強度確定抗體的表位。作為對照，使用Y9A2(見Wang et al.，1996， Am J Respir Cell Mol Biol 15，664-672)，一種商業(yè)可得的針對人α 9整聯蛋白的單克隆 抗體。下面的表1顯示了表位作圖的結果，表明本發(fā)明人分離的單克隆抗體具有與Υ9Α2 迥異的表位。表 1 6. 3抗人α 9整聯蛋白抗體的⑶R分析單克隆抗體(即IKl 1，21 C5，24I11，25B6和28S1)的CDR氨基酸序列通過將從相 應雜交瘤提取的mRNA逆轉錄制備cDNA來加以確定。使用這些cDNA作為模板，使用ScFv克 隆弓I物(Light Primer Mix 禾口 Heavy PrimerMix ；Amersham Biosciences Corp. , IL 生產)
6.4 iESmaiMSE(1)因為已知細胞粘附涉及α 9整聯蛋白與其配體，即各種ECM，包括0ΡΝ、纖連蛋 白、生腱蛋白-C、VCAM-I等，的結合，所以對分離的抗人α 9整聯蛋白抗體的細胞粘附抑制
通過PCR對H鏈和L鏈的可變區(qū)進行延伸和擴增。將PCR產物克隆到pCRIITOPO載體內，
測序并確定氨基酸序列。每種抗體該過程重復3次。結果如表2所示。
活性進行了檢查。簡而言之，通過從大腸桿菌宿主細胞分離N端以下至OPN凝血酶切割位點為止的 部分，制備了與谷胱甘肽S轉移酶(GST)形成融合蛋白的hOPN(RAA)N-half，其中GRD序 列已被RAA序列替換；并用Precision蛋白酶(Amersham Biosciences)切去GST部分。 VCAM-I從R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)購買。生腱蛋白-C和人纖連蛋白通過 分別合成含有AEIDGIEL(SEQ ID NO 92)的多肽；生腱蛋白-C的α 9整聯蛋白結合區(qū)和 CPEDGIHELFP (SEQ ID NO 93)；人纖連蛋白的α 9整聯蛋白結合區(qū))，隨后將它們附接于牛 血清白蛋白(BSA)上來加以制備。對于人α 9整聯蛋白，使用大量表達人α 9整聯蛋白的 CHO-KO 細胞(人 α 9/CH0-K1)。將50 微升生腱蛋白-C、纖連蛋白、VCAM-I 或 hOPN(RAA)N-half 以 1. 25-5. 0 μ g/ml 添加到96孔板中，并在37°C溫育1小時以包被平板。用封閉液(0. 5% BSA/PBS)封閉平板 后，用PBS清洗一次，然后向平板添加人ci9/CH0-Kl細胞(LOxlO5細胞/ml)并以200 μ 1/ 孔添加溶解于0. 25% BSA-最小基本培養(yǎng)基(MEM)中的分離單克隆抗體(10g/ml)，并在5% 0)2下37°0溫育1小時。用PBS洗去未粘附細胞，固定粘附的細胞并用0.5%結晶紫(WAK0， Osaka, Japan)/20%甲醇進行染色。將經染色的細胞在室溫下保持30分鐘，并向其添加 20%乙酸以使之分散(dissolution)。通過測量590nm波長下的OD對粘附活性進行定量。如圖16所示，涉及生腱蛋白-C的細胞粘附被21C5，24I11，25B6和28S1抑制，但不 被IKll抑制。涉及纖連蛋白的細胞粘附被21C5，25B6和28S1抑制，并被24111抑制(程 度低一些)，但不被IKll抑制。涉及VICAM-I的細胞粘附被21C5，24111，25B6和28S1抑 制，但不被IKll抑制。相似地，涉及hOPN(RAA)N-half的細胞粘附被21C5，24111，25B6和 28S1抑制，但不被IKll抑制。(2)因為整聯蛋白α 4與α 9整聯蛋白具有許多共同的ECM配體，故而預期抗整聯 蛋白α 4和抗α 9整聯蛋白抗體的共存可提高細胞粘附抑制活性。因此，對兩種類型抗體 的組合效果進行體外檢驗，基于表達整聯蛋白α 4和α 9整聯蛋白的人黑素瘤細胞(G361) 的細胞粘附考察抗體組合對轉移癌的可能抑制效果，以VCAM-I (1. 25 μ g/ml)為ECM，使用 大鼠單克隆抗體P1H4 (Cat. No. MAB 16983Z, Chemicon InternationalInc.，CA)作為抗人整 聯蛋白α 4抗體。如圖17所示，涉及VCAM-I的粘附不被單獨任何一種抗人α 9整聯蛋白抗體抑制， 但在抗人整聯蛋白α 4抗體的共同存在下，可以被陽性對照(Y9A2)、21C5和24111抑制。由 于表達多種α9整聯蛋白分子的細胞通常也表達整聯蛋白α 4分子，所以這個結果提示，通 過組合使用抗人α9整聯蛋白抗體和抗人整聯蛋白α 4抗體，可有效實現對細胞粘附的抑 制，藉此增強對各種病癥和疾病，包括涉及這些整聯蛋白分子的轉移癌，的抑制。6. 5抗人α 9整聯蛋白抗體在FACS分析中的應用使用內源表達α 9整聯蛋白的人α 9/CH0-K1細胞、CH0-K1細胞和人嗜中性粒細 胞檢查抗人α 9整聯蛋白抗體是否可用于FACS。在人嗜中性粒細胞中，FACS分析在細胞計 數為LOxlO5的條件進行，且抗體在冰上反應。用50%山羊血清封閉與Fc受體的非特異性 反應。使用FITC標記的抗小鼠IgG抗體作為第二抗體。結果(見圖20a，20b和20c)，所 有抗人α 9整聯蛋白抗體均可檢測到人ci9/CH0-Kl和人嗜中性粒細胞上的α 9整聯蛋白。 所有抗體均不與人α 4/CH0-K1細胞反應(見圖20a，20b和20c)。這些結果顯示，所有的抗人α 9整聯蛋白抗體均可用FACS檢測在細胞上表達的人α 9整聯蛋白。6.6抗α 9整聯蛋白抗體的治療效果在小鼠系統中考察抗α 9整聯蛋白的治療效果。制備了抗小鼠α 9整聯蛋白抗體(11L2B，12C4，58，18R18D和55A2C)，方法與制備 小鼠抗人α9整聯蛋白抗體的方法(見前文6.1部分)基本上相同，只是倉鼠用表達小鼠 α 9整聯蛋白的CHO-Kl細胞(小鼠CI9/CH0-K1細胞)進行免疫，并且選擇所得的與小鼠 α 9/ΝΙΗ3Τ3細胞反應但不與小鼠α 4/ΝΙΗ3Τ3細胞反應的單克隆抗體。6.6. 1對肝炎的治療效果WO 02/081522公開，抑制OPN功能可以治療肝炎。因此，在小鼠肝炎模型中使用倉 鼠抗小鼠α 9整聯蛋白抗體11L2B和大鼠抗小鼠整聯蛋白α 4抗體RlI(Pharmingen)對 抗α 9整聯蛋白抗體的治療效果進行了研究。靜脈內注射200yg伴刀豆球蛋白A(Con A) (Vector) 12 小時后，用 GPT/ALT-PIII 和 GOT/AST-PIII (Fuji Film)對小鼠血液的 AST 和 ALT水平進行測量。Con A注射前3個小時，施用200 μ g抗體。如圖18所示，發(fā)現AST和 ALT水平被抗α 9整聯蛋白抗體降低，可以見到治療效果。此外，同時使用抗整聯蛋白α4 抗體可以提高治療效果。這些結果表明，抗α 9整聯蛋白抗體可以治療肝炎。6. 6. 2抗α 9整聯蛋白抗體對小鼠癌細胞系牛長的影響鼠黑素瘤細胞系B16-BL6大量表達α 9整聯蛋白。因此，對于已建立的抗小鼠α 9 整聯蛋白抗體，考察了它們抑制癌細胞生長的活性。在細胞培養(yǎng)用96 孔板(Becton Dickinson)上準備 B16-BL6 細胞，10% FCS/DMEM 中5xl04細胞/mL。添加10yg/ml抗小鼠α 9整聯蛋白抗體和抗小鼠整聯蛋白α 4抗體之 后，向每個孔添加100 μ L細胞-抗體懸浮液。在5% C02下37°C溫育24小時，并添加每孔 10 μ L Cell Counting Kit 8 (Do jinKagaku Kenkyu-sho)，隨后在 5% C02 下 37°C溫育 1 小 時。測量O.D. 450吸光值，并對細胞計數進行定量分析。如圖19所示，12C4' 58給出最高 的抑制活性，對B16-BL6細胞生長的抑制為大約35%。55A2C和R1-2均可抑制生長達大約 20%。接下來，為了在接近體內條件下分析對細胞生長的抑制效果，將VCAM-I固定在 固相上，并類似地進行測定。VCAM-I是α 9整聯蛋白的配體；使用了一種重組可溶形式的 VCAM-I蛋白rhVCAM-l-Fc嵌合體(Roche)。使用10 μ g/mL的固定在固相上的rhVCAM_l_Fc 嵌合體，用0.5%BSA/PBS封閉非特異性反應。在抗體單獨使用時，嵌合體的添加濃度為 10yg/ml，在共同使用抗體時，添加濃度為各5yg/ml。之后，遵循與圖19相同的程序。結 果，單獨施用12C4' 58和單獨使用α 4抑制抗體克隆Rl_2根本未獲得效果或者僅獲得微 弱的效果，而在同時施用12C4' 58和R1-2時，細胞生長抑制效果顯示了大約20%的顯著 增加，如圖21所示。6. 6. 3抗α 9整聯蛋白抗體在小鼠類風濕性關節(jié)炎模型中的治療效果用倉鼠抗小鼠α 9整聯蛋白抗體(55A2C)或正常倉鼠IgG(NHG)以400 μ g/小鼠 腹腔內注射7周齡雌性小鼠(Balb/c)(每組3只)。24小時后，以2mg/小鼠靜脈內注射 II型膠原特異性單克隆抗體關節(jié)炎誘導雞尾酒(Chondrexlnc.)。72小時后，腹腔內注射 400 μ g/小鼠的55A2C或NHG以及50 μ g/小鼠的LPS。從LPS注射前3天到LPS注射后6 天對小鼠進行觀察，根據 Wood等人(1969，Int. Arch. Allergy App 1. Immunol. 35 456)的方
24法對關節(jié)炎水平進行打分。結果如圖22所示。注射對照NHG的小鼠具有高分值，并發(fā)生了 類風濕性關節(jié)炎，而在注射了抗小鼠α 9整聯蛋白抗體的小鼠體內，類風濕性關節(jié)炎的發(fā) 生被完全阻斷。因此，表明抗α9整聯蛋白抗體對類風濕性關節(jié)炎具有預防和治療效果。6.7非人抗體的人源化6.7.1小鼠24111 V基因的克隆和測序小鼠24111雜交瘤細胞在含有10%胎牛血清(FBS ;HyClone，Logan，UT)的 TIL 培養(yǎng)基 I (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan)中在 7· 5 % C02 培養(yǎng)箱 內37°C生長。使用TRIzoI試劑(Invitrogen，Carlsbad, CA)按照供應商的方案從大約 3xl06個雜交瘤細胞提取總RNA。使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)按照供應商的規(guī) 程合成以寡dT為引物的cDNA。通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增24111重鏈和輕鏈的可 變區(qū) cDNA，其中使用 PhusionDNA 聚合酶(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)、分別對小 鼠Yl-和κ鏈恒定區(qū)退火的引物、以及GeneRacer試劑盒提供的GeneRacer 5'引物 (5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-) (SEQ ID NO :94)。對于重鏈可變區(qū)(VH)的 PCR 擴增，引 物序列為 5' -GCCAGTGGATAGACAGATGG-(SEQ IDNO 95)。對于輕鏈可變區(qū)(VL)的 PCR擴增， 引物序列為 5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC- (SEQ ID NO 96)。將擴增的 VH 和 VLcDNA 亞克 隆到 pCR4Blunt-T0P0 載體(Invitrogen)內，用于確定序列。在 Tocore (Menlo Park, CA) 進行可變區(qū)DNA測序。對多條重鏈和輕鏈克隆測序，鑒定了與典型小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū) 同源的獨特序列。圖1和2分別顯示了共有cDNA序列以及推導的氨基酸序列。6. 7. 2 嵌合 24IllIgGl/K 抗體的構津通過PCR生成了呈包括剪接供體信號和合適的側翼限制酶位點的外顯子形式的 編碼 24111 VH 的基因，所述 PCR 用 24111 VH cDNA 作為模板，5，-GGGACTAGTACCACCATGAAA TGCAGCTGGGTTATCTTC- (SEQ IDNO 97) (SpeI 位點用下劃線標記)作為 5’ 引物，5，-GGGAAGC TTAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-(SEQ ID NO 98) (HindIII位點用下劃線 標記)作為3’引物(圖3)。相似地，通過PCR生成了呈包括剪接供體信號和合適側翼限制 酶位點的外顯子形式的編碼24111 VL的基因，PCR以24111 VL cDNA為模板，5’ -GGGGCTAGC ACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-(SEQ IDNO 99) (NheI 位點用下劃線標記)為 5，引物， 5’-GGGGAATTCTGAGAAGACTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-(SEQ ID NO: 100) (EcoRHi 點用下劃線標記)為3’引物(圖4)。24111 VH和VL外顯子的剪接供體信號分別衍生自小 鼠胚系JH4和J κ 2序列。PCR擴增片段用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia, CA)進行凝膠純化，用SpeI和HindIII (用于VH)或NheI和EcoRI (用于VL)消化，并克隆 到帶有人Y-I和κ恒定區(qū)的哺乳動物表達載體內，用于產生嵌合24111 IgGl/κ抗體。圖 5顯示了所得的表達載體pCh24Ill的結構示意圖。6. 7. 3人源化24111基因的產生24111 可變區(qū)的人源化按照 Queen 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033,1989)概述的方法進行。首先，在計算機程序的幫助下構建24111可變區(qū)的分 子模型。接著，基于面向人可變區(qū)序列的同源性搜索，選擇了由GenBank登錄號No. X65891 核苷酸序列編碼的人氨基酸序列作為受體來提供人源化24111 VH的框架，其中X65891與 24111 VH具有高度同源性[FRH中的氨基酸同一性為74.2% (63/87)]。相似地，選擇由 GenBank登錄號No. X72441[FRH中的氨基酸同一性為77. 5% (62/80)]的核苷酸序列編碼的人氨基酸序列作為受體，用于人源化24111 VL0在計算機模型提示與互補決定區(qū)(OTR)有顯著接觸的框架位置上，用來自24111 可變區(qū)的氨基酸代替人框架氨基酸。這在位置27、28、29、30、48、66、67和71上進行(根據 Kabat 編石馬系統；見Kabat et al. , Sequences ofProteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991)，從而產生人源化24111 (Hu24Ill) VH(圖6)。對于輕鏈，在殘基70和71進 行替換，以產生人源化24111 (Hu24111) VL (圖7)。圖6和圖7分別顯示了 VH和VL的24111、 設計的HU24I11和人受體氨基酸序列的比對結果。將編碼每一個HU24I11 VH和VL的基因設計為這樣的外顯子，其包含信號肽、剪 接供體信號、和用于后續(xù)克隆到哺乳動物表達載體內的合適的限制酶位點。Hu24Ill VH和 VL外顯子的剪接供體信號分別來自人胚系JH4和Jk 1序列。Hu24Ill VH和VL外顯子內 的信號肽序列分別衍生自相應的小鼠Hu24111 VH和VL序列。使用ThermalAce DNA聚合 酶(Invitrogen)，通過多個重疊合成寡核苷酸引物的延伸和PCR擴增，構建了 Hu24Ill VH 和VL基因，如He等(J. Immunol. 160 1029-1035，1998)所概述的那樣。圖8和9分別列 舉了用于構建Hu24Ill VH和VL基因的寡核苷酸。圖10和11分別顯示了所述寡核苷酸在 Hu24Ill VH和VL基因內的位置。用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)對PCR擴增片段 進行凝膠提純，并克隆到pCR4Blunt-T0P0載體內，用于確定序列。用SpeI和HindIII (用 于VH)或NheI和EcoRI (用于VL)消化后，將Hu24Ill VH和VL基因亞克隆到哺乳動物表 達載體內的相應位點，用于產生人IgGl/κ形式。圖5顯示了所得的表達載體pHu24Ill的 示意結構。圖12和13分別顯示了所得的Hu24Ill VH和VL基因的核苷酸序列和推導的氨 基酸序列。6.7.4嵌合和人源化24111 IgGl/κ的瞬時表達根據Durocher等(Nuc 1. Acids Res. 30 :e9，2002)的方法利用聚乙烯亞胺分別將 pCh24111和pHu24111質粒DNA轉染到HEK293細胞內，對嵌合和人源化的24111 IgGl/ κ抗 體進行瞬時表達。將經瞬時轉染的ΗΕΚ293細胞在含有10% FBS的DMEM內在7. 5% C02培 養(yǎng)箱內37°C保持4天。通過夾心式ELISA測量培養(yǎng)上清中每種Ch24Ill和Hu24Ill IgGl/ κ抗體的表達水平。取塊ELISA板，加入100 μ 1/孔在PBS中以1/2，000稀釋過的山羊抗 人IgG Fcy鏈特異多克隆抗體(SouthernBiotech，Birmingham，AL)在4°C過夜進行包被， 用清洗緩沖液(含有0. 05% Tween 20的PBS)清洗，并用300 μ 1/孔封閉緩沖液(含有2% 脫脂牛奶和0. 05% Tween 20的PBS)在室溫下封閉1小時。用清洗緩沖液清洗后，向ELISA 板添加100 μ 1/孔的適當溶解于ELISA緩沖液(含有脫脂牛奶和0. 025% Tween 20的 PBS)中的樣品。使用從人骨髓瘤血清純化的人IgGl/κ抗體(SouthernBiotech)作為標 準。在室溫下溫育ELISA板2小時并用清洗緩沖液清洗之后，用100 μ 1/孔的1/2，000稀 釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的山羊抗人κ鏈多克隆抗體(SouthernBiotech)檢測結 合的抗體。在室溫下溫育1小時并用清洗緩沖液清洗之后，通過添加100 μ 1/孔ABTS底物 (bioWORLD，Dublin，0Η)進行顯色。通過添加100 μ 1/孔的2%草酸終止顯色。讀取405nm 吸光度。6. 7. 5人源化24111的表征通過細胞ELISA考察嵌合和人源化24111抗體與人α9整聯蛋白的結合。將在表面上表達重組人α 9整聯蛋白的CHO-Kl穩(wěn)定轉染體(CHO/hu α 9 ；由Gene Techno Science提供)以2xl05個細胞/孔接種在96孔組織培養(yǎng)板的50 μ 1含有10% FBS的F12/ DMEM(HyClone)內，并使其在7. 5% CO2培養(yǎng)箱內37°C過夜生長。為了檢測與人α9整聯 蛋白的結合，向每個孔添加50 μ 1溶于含有10% FBS的F12/DMEM中的嵌合24111、人源化 24111或無關人IgGl/κ骨髓瘤抗體(SouthernBiotech)。在4°C溫育1小時并用冰冷PBS 清洗細胞兩次后，向每個孔添加100 μ 1/孔1/1，000稀釋的HRP偶聯山羊抗人IgG多克隆 抗體(SouthernBiotech)。在4°C溫育1小時后，用冰冷PBS清洗細胞三次。為了顯色，添 加100 μ 1 ABTS底物。通過添加100 μ 1 2%草酸終止顯色。讀取405nm吸光度。結果顯 示，在0. 5和1 μ g/ml下，嵌合24111抗體與人α 9整聯蛋白的結合與人源化24111抗體幾 乎相同(圖14)。還利用CHO/hu α 9細胞進行FACS結合測定檢查了小鼠、嵌合和人源化24111單克 隆抗體的抗原結合。純化的小鼠24111單克隆抗體由Gene TechnoSciences提供。每次試 驗大約8xl05個CHO/hu α 9細胞，用FACS結合緩沖液(含有0. 5% BSA和0. 05% NaN3的 PBS)清洗，并懸浮在200 μ 1含有各種量的測試抗體的FACS結合緩沖液中。冰上30分鐘后， 用FACS結合緩沖液清洗細胞兩次。然后將被小鼠24111染色的細胞懸浮在200μ 1以1/200 稀釋在FACS結合緩沖液內的FITC標記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體(SouthernBiotech) 內。將被嵌合或人源化24111染色的細胞懸浮在200 μ 1以1/200稀釋在FACS結合緩沖液 內的FITC標記羊抗人IgG多克隆抗體(SouthernBiotech)內。冰上30分鐘后，將細胞用 FACS結合緩沖液清洗，并懸浮在200 μ 1 FACS結合緩沖液中，用FACSCan流式細胞儀(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)進行分析。在本分析中，嵌合和人源化24111抗體與 CHO/hu α 9細胞的結合彼此非常相似(圖15)。使用瞬時表達抗體的細胞ELISA和FACS的實驗結果表明，小鼠24111抗體的人源 化是成功的。這里公開的其它小鼠抗人0 9抗體(即1K11，21C5，25B6和28S1)的人源化也同 樣可以通過采用本文說明的程序來進行。這些小鼠單克隆抗體各自的VH和VL區(qū)DNA序列 和氨基酸序列匯總如下。 1每一個抗體的V基因通過使用Amersham簡并引物的方法克隆。2每個克隆的推導氨基酸序列從VH區(qū)的第2個殘基開始(根據Kabat編碼體系)7.保藏根據微生物保藏布達佩斯條約，可產生抗人α 9整聯蛋白單克隆抗體的在這里稱 作11(11，2比5，24111，2586和283 1的雜交瘤于2006年2月15日儲存于日本產業(yè)技術綜 合研究所國際專利生物保管(International PatentOrganism D印ositary)，地址為AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-chomeTsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan, 授予的登錄號分別為 Nos. FERMBP-10510, FERM BP-10511，FERM BP-10512，FERM BP-10513 和FERMBP-10832，本文引用所有這些的全部內容作為參考。8.工業(yè)實用性本發(fā)明的人源化單克隆抗體可抑制α 9整聯蛋白的功能，從而對癌癥，例如癌細 胞的生長或轉移，和炎癥性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維 化、糖尿病、癌癥轉移、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病(潰瘍性結腸炎和克羅恩 氏病)、自身免疫性疾病等，顯示治療作用。本發(fā)明的包含抗α 9整聯蛋白抗體和抗整聯蛋 白α 4抗體二者的的藥物組合物顯示出對癌癥和炎癥性疾病具有更高的治療作用。9.序列表整個說明書中引用的序列總結如下。
權利要求
一種可免疫特異性地識別人α9整聯蛋白的人源化抗體或其抗原結合片段，其包括(i)H鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VH區(qū)的FRH，以及至少一個CDRH，所述CDRH衍生自可免疫特異性地識別人α9整聯蛋白的非人類抗體的至少一個CDRH；或(ii)L鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VL區(qū)的FRL，以及至少一個CDRL，所述CDRL衍生自可免疫特異性地識別人α9整聯蛋白的非人類抗體的至少一個CDRL；或(iii)上述的(i)和(ii)。
2.權利要求1的人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述非人類抗體是由選自下組的 雜交瘤產生的小鼠單克隆抗體保藏號FERM BP-10510、FERM BP-1051U FERM BP-10512、 FERM BP-10513 和 FERM BP-10832。
3.權利要求1的人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體的至少一個CDRH 包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6中的氨基酸序列，并且所述人源化抗體的至少一 個⑶RL包含選自氨基酸序列SEQ IDNO 11、12和13中的氨基酸序列。
4.權利要求2或3的人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述人抗體VH區(qū)包含從由 GenBank登錄號為X65891 (SEQ ID NO :18)的核苷酸序列編碼的氨基酸序列衍生的氨基酸 序列，并且所述人抗體VL區(qū)包含從由GenBank登錄號X72441 (SEQ ID NO 23)的核苷酸序 列編碼的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
5.權利要求4的人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述H鏈包含氨基酸序列SEQID NO :29，并且所述L鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :31。
6.一種分離的核酸分子，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO :29的核苷酸序列。
7.權利要求6的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDN0:28。
8.權利要求6的核酸分子，進一步包含編碼信號肽的核苷酸序列。
9.權利要求8的核酸分子，其中所述信號肽包含氨基酸序列SEQIDNO=IO0
10.一種分離的核酸分子，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO :31的核苷酸序列。
11.權利要求10的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDN0:30。
12.權利要求10的核酸分子，進一步包含編碼信號肽的核苷酸序列。
13.權利要求12的核酸分子，其中所述信號肽包含氨基酸序列SEQIDNO :17。
14.一種載體，其包含權利要求6或10或其二者的核酸分子，其中所述核酸分子與一個 或多個調節(jié)元件可操作地連接。
15.一種分離的宿主細胞，其包含權利要求14的載體。
16.一種制備人源化抗體或其抗原結合片段的方法，包括在所述人源化抗體或其抗原 結合片段得以表達的條件下培養(yǎng)權利要求15的宿主細胞，并收集所表達的人源化抗體。
17.一種藥物組合物，其包含權利要求1、2或5中任一項的人源化抗體或其抗原結合片 段以及可藥用的載體。
18.一種預防或治療與α 9整聯蛋白有關的病癥或疾病的方法，所述方法包括向有需 要的受試者施用有效量的權利要求5的人源化抗體或其抗原結合片段。
19.一種體內診斷與α 9整聯蛋白有關的病癥或疾病的方法，所述方法包括向待檢受 試者施用有效量的權利要求1或2的人源化抗體或其抗原結合片段。
20.一種可免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含(i)H鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VH區(qū)的FRH以及，至少一個⑶RH，所述⑶RH包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :32、33和34中的氨基酸序列；或(ii)L鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VL區(qū)的FRL，以及至少一個CTRL，所述⑶RL包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :37、38和39中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
21.一種可免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含(i)H鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VH區(qū)的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :42、43和44中的氨基酸序列；或(ii)L鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VL區(qū)的FRL，以及至少一個CTRL，所述⑶RL包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :47、48和49中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
22.一種可免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含(i)H鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VH區(qū)的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :52、53和54中的氨基酸序列；或(ii)L鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VL區(qū)的FRL，以及至少一個CTRL，所述⑶RL包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :57、58和59中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
23.一種可免疫特異性地識別人α 9整聯蛋白的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含(i)H鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VH區(qū)的FRH，以及至少一個⑶RH，所述⑶RH包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :62、63和64中的氨基酸序列；或(ii)L鏈，其包含至少一個衍生自人抗體VL區(qū)的FRL，以及至少一個CTRL，所述⑶RL包 含選自氨基酸序列SEQ ID NO :67、68和69中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
全文摘要
本發(fā)明提供了可免疫特異性地識別人α9整聯蛋白的人源化抗體。這些抗體中的一些可以抑制整聯蛋白α9的生物學功能，從而顯示對多種與整聯蛋白α9有關的病癥或疾病具有治療作用，這些病癥或疾病包括癌癥，例如癌細胞的生長和轉移，和炎癥性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病(潰瘍性大腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫性疾病等。
文檔編號G01N33/577GK101918555SQ20098010202
公開日2010年12月15日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權日2008年1月11日
發(fā)明者今重之, 尚卡·庫馬, 曹仲欣, 鶴下直也 申請人:株式會社遺傳科技;科研制藥株式會社