專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種固定含氨基化合物的活性載體及其固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于含氨基化合物在固相材料表面的固定
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是氨基酸或蛋白質(zhì)在固相材料表面的固定，尤其是將抗原或抗體固定在固相載體，通過(guò)特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)行痕量檢測(cè)的免疫分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：免疫分析診斷技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，標(biāo)記物穩(wěn)定等特點(diǎn)外，其檢測(cè)程序亦簡(jiǎn)便、快速，只需微量標(biāo)本，近年來(lái)已應(yīng)用于檢測(cè)各種激素，腫瘤標(biāo)志物，藥物及其它微量生物活性物質(zhì)，亦可用于細(xì)菌和病毒感染的快速診斷。在目前應(yīng)用的免疫分析診斷技術(shù)中，載體是以聚苯乙烯為主要原料制成的實(shí)心珠、管狀物、96孔板等，檢測(cè)的抗體或者抗原通過(guò)物理吸附的方式附著在載體表面，在吸附過(guò)程中，抗體或者抗原需要比較高的濃度(一般為10iig/mL)，而這種方式的缺點(diǎn)是1.浪費(fèi)了寶貴的抗體或者抗原，尤其是有的抗體或者抗原價(jià)格很貴，造成診斷成本的提高。(因?yàn)檎嬲皆谳d體表面的抗體或者抗原只有10%左右)。2.由于抗體或者抗原是吸附在載體表面，隨著時(shí)間的推移，抗體或者抗原會(huì)從載體的表面脫落，因而影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。3.由于抗體或者抗原是吸附在載體表面，使得同批次的均一性差。
發(fā)明內(nèi)容為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種固定含氨基化合物的活性載體及其固定方法。該活性載體帶有磺酰氯基團(tuán)，能夠與氨基在溫和的條件下反應(yīng)，特別是與含有氨基的具有生物活性的物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、抗原、單克隆抗體、第二抗體、多克隆抗體以及核苷酸等反應(yīng)。本發(fā)明提供的一種固定含氨基化合物的活性載體及其固定方法可用于放射免疫分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、時(shí)間分辨免疫分析、聚合酶鏈反應(yīng)、基因工程或多肽的固相合成。其具體技術(shù)方案是以具有芳香環(huán)的高分子聚合物為固相材料，通過(guò)化學(xué)方法，即一步法或兩步法反應(yīng)得到帶有功能性基團(tuán)磺酰氯的活性載體，然后通過(guò)磺酰氯基團(tuán)與含有氨基的目標(biāo)化合物在堿性水溶液中反應(yīng)，使含有氨基的目標(biāo)化合物以化學(xué)鍵的形式固定在固相材料表面上。所述的固相材料為用聚苯乙烯制成的實(shí)心珠、管狀物或者96孔板。—步法的具體步驟為A.以400-800體積份的甲苯為溶劑，80-250體積份的氯磺酸為磺化劑，20-250重量份的三氯氧磷或者氯化鋅為催化劑，將上述試劑混合均勻；B.10-6(TC條件下，將固相材料浸泡于步驟A配制的混合液中4.0-12.0小時(shí)，用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；重量份與體積份的關(guān)系為g/ml或kg/1。4兩步法的具體步驟為以400-800體積份的甲苯為溶劑，與80-250體積份的濃硫酸混合均勻后，10-6(TC條件下，將固相材料浸泡在甲苯與濃硫酸的混合液中反應(yīng)4.0-12.0小時(shí)；向混合液中再加入20-250重量份的氯化亞砜或者三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)4.0_12.O小時(shí)；用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；所述重量份與體積份的關(guān)系為g/ml或kg/1。—步法優(yōu)選條件一A.以640體積份的甲苯為溶劑，210體積份的氯磺酸為磺化劑，80重量份的三氯氧磷或者氯化鋅為催化劑，將上述試劑混合均勻；B.6(TC條件下，將固相材料浸泡于步驟A配制的混合液中6小時(shí)，用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；—步法優(yōu)選條件二A.以780體積份的甲苯為溶劑，160體積份的氯磺酸為磺化劑，220重量份的三氯氧磷或者氯化鋅為催化劑，將上述試劑混合均勻；B.3(TC條件下，將固相材料浸泡于步驟A配制的混合液中10.5小時(shí)，用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；兩步法優(yōu)選條件一以420體積份的甲苯為溶劑，與230體積份的濃硫酸混合均勻后，3(TC條件下，將固相材料浸泡在甲苯與濃硫酸的混合液中反應(yīng)4.5小時(shí)；向混合液中再加入180重量份的氯化亞砜或者三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)；用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；兩步法優(yōu)選條件二以720體積份的甲苯為溶劑，與90體積份的濃硫酸混合均勻后，2(TC條件下，將固相材料浸泡在甲苯與濃硫酸的混合液中反應(yīng)11小時(shí)；向混合液中再加入80重量份的氯化亞砜或者三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)；用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；重量份與體積份的關(guān)系為g/ml或kg/1。所述的含有氨基的目標(biāo)化合物為無(wú)生物活性或者有生物活性的化合物，無(wú)生物活性的化合物為C4—18的脂肪族胺或芳香族胺，包括乙二胺、十八胺、苯胺、芐胺，有生物活性的化合物包括氨基酸、蛋白質(zhì)、抗原、單克隆抗體、第二抗體、多克隆抗體或核苷酸?；酋Ｂ然鶊F(tuán)與氨基酸或蛋白質(zhì)的偶聯(lián)反應(yīng)條件為ra值在4-10的水溶液體系，優(yōu)選ra值在6-9的水溶液體系。本發(fā)明提供的一種以化學(xué)鍵的方式固定含氨基化合物的活性載體及其固定方法，其優(yōu)點(diǎn)有1、節(jié)約原料(在免疫分析中經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，固定抗體或抗原可節(jié)省80%);2、因?yàn)槭峭ㄟ^(guò)化學(xué)鍵連接在一體的，所以具有生物活性的物質(zhì)不會(huì)從載體的表面脫落，穩(wěn)定性好(只要不失去生物活性，就可以使用)；3、均一性好(將物理吸附變成定量的化學(xué)反應(yīng))；4、活性載體制作過(guò)程簡(jiǎn)單，費(fèi)用低。下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，而不是限制本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:在三角瓶中加入氯磺酸160mL，氯化鋅40g，甲苯640mL，混勻；將96孔板放入其中，3(TC反應(yīng)10.5小時(shí)；取出96孔板用水沖洗，再用丙酮洗劑，5(TC烘干，密封保存。實(shí)施例2:在三角瓶中加入氯磺酸85mL，三氯氧磷80g，甲苯450mL，混勻；將96孔板放入其中，4(TC反應(yīng)7.5小時(shí)；取出96孔板用水沖洗，再用丙酮洗劑，6(TC烘干，密封保存。實(shí)施例3:在三角瓶中加入氯磺酸95mL，氯化鋅160g，甲苯520mL，混勻；將96孔板放入其中，6(TC反應(yīng)6小時(shí)；取出96孔板用水沖洗，再用丙酮洗劑，4(TC烘干，密封保存。實(shí)施例4:在三角瓶中加入氯磺酸105mL，三氯氧磷30g，甲苯640mL，混勻；將直徑0.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，55t:反應(yīng)4.5小時(shí)；取出聚苯乙烯珠用水沖洗，再用丙酮洗劑，6(TC烘干，密封保存。實(shí)施例5:在三角瓶中加入氯磺酸185mL，氯化鋅80g，甲苯600mL，混勻；將直徑0.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，45t:反應(yīng)5.5小時(shí)；取出聚苯乙烯珠用水沖洗，再用丙酮洗劑，3(TC烘干，密封保存。實(shí)施例6:在三角瓶中加入氯磺酸235mL，三氯氧磷220g，甲苯720mL，混勻；將直徑0.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，35t:反應(yīng)7小時(shí)；取出聚苯乙烯珠用水沖洗，再用丙酮洗劑，6(TC烘干，密封保存。實(shí)施例7:在三角瓶中加入氯磺酸125mL，氯化鋅220g，甲苯750mL，混勻；將直徑0.5cm的聚苯乙烯管放入其中，25t:反應(yīng)9.5小時(shí)；取出聚苯乙烯管用水沖洗，再用丙酮洗劑，55t:烘干，密封保存。實(shí)施例8:在三角瓶中加入氯磺酸210mL，氯化鋅240g，甲苯780mL，混勻；將直徑0.5cm的聚苯乙烯管放入其中，15t:反應(yīng)11小時(shí)；取出聚苯乙烯管用水沖洗，再用丙酮洗劑，45t:烘干，密封保存。實(shí)施例9:在三角瓶中加入濃硫酸90mL，甲苯420mL，混勻；將直徑0.5cm的聚苯乙烯管放入其中，2(TC反應(yīng)11.0小時(shí)；向混合液中再加入180g的氯化亞砜繼續(xù)反應(yīng)5.0小時(shí)；取出聚苯乙烯管用水沖洗，再用丙酮洗劑，50°C烘干，密封保存。實(shí)施例10:在三角瓶中加入濃硫酸180mL，甲苯520mL，混勻；將直徑O.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，35t:反應(yīng)8小時(shí)；向混合液中再加入80g的三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)9.5小時(shí)；取出聚苯乙烯珠用水沖洗，再用丙酮洗劑，3(TC烘干，密封保存。實(shí)施例11:在三角瓶中加入濃硫酸230mL，甲苯720mL，混勻；將96孔板放入其中，55。C反應(yīng)4.5小時(shí)；向混合液中再加入180g的三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)；取出96孔板用水沖洗，再用丙酮洗劑，60°C烘干，密封保存。實(shí)施例12:將15mgC-肽(C_P)抗體加入到3000mL0.1MpH為8.7-8.8的碳酸氫鈉的水溶液中，攪棒混勻；向制備實(shí)施例2制得的含磺酰氯基團(tuán)的活性96孔板的每孔加入100iU濃度為5iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小時(shí)。向0.01MpH為7.4的3000ml磷酸鹽緩沖液中加入蔗糖90g，BSA12g，混勻；每孔加110iU，37t:溫浴45分鐘；用洗板機(jī)洗孔1次，在紙抹布上輕輕拍干。將包被板放在風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干1小時(shí)，即可得到化學(xué)偶聯(lián)的C-肽(C-P)抗體包被的活性載體板。實(shí)施例13:將制備實(shí)施例5所得到的100顆活性載體，加入到2000mL甲胎蛋白(AFP)抗體濃度為10yg/mL、pH為8.7-8.8的0.1M的碳酸氫鈉的水溶液中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。向0.OIMpH為7.4的1000ml磷酸鹽緩沖液中加入蔗糖30g，BSA4g，混勻；將連接好的活性載體加入其中，37t:溫浴45分鐘。將連接好的活性載體放在風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干1小時(shí)，即可得到化學(xué)偶聯(lián)的甲胎蛋白(AFP)抗體包被的活性載體珠。實(shí)施例14:將制備實(shí)施例6所得到的100顆活性載體，加入到2000mL人促甲狀腺素(hTSH)抗體濃度為10yg/mL、pH為8.7-8.8的0.1M的碳酸氫鈉的水溶液中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。向0.01MpH為7.4的1000ml磷酸鹽緩沖液中加入蔗糖30g，BSA4g，混勻；將連接好的活性載體加入其中，37t:溫浴45分鐘。將連接好的活性載體放在風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干1小時(shí)，即可得到化學(xué)偶聯(lián)的人促甲狀腺素(hTSH)抗體包被的活性載體珠。實(shí)施例15:將15mg癌胚抗原(CEA)抗體加入到3000mL0.1MpH為8.7-8.8的碳酸氫鈉的水溶液中，攪棒混勻；向制備實(shí)施例11制得的含磺酰氯基團(tuán)的活性96孔板的每孔加入100ii1濃度為5iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小時(shí)。向0.01MpH為7.4的3000ml磷酸鹽緩沖液中加入蔗糖90g，BSA12g，混勻；每孔加110iU，37t:溫浴45分鐘；用洗板機(jī)洗孔1次，在紙抹布上輕輕拍干。將包被板放在風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干1小時(shí)，即可得到化學(xué)偶聯(lián)的癌胚抗原(CEA)抗體包被的活性載體板。免疫分析的效果實(shí)驗(yàn)前列腺特異抗原(prostatespecificantigen,PSA)是與前列腺癌(PC)相關(guān)的一種抗原。它是公認(rèn)的診斷PC的較好的腫瘤標(biāo)志物。PC在男性所有類(lèi)型癌中占10%20%，是男性最常見(jiàn)的癌腫。該病進(jìn)展緩慢，是威脅50歲以上男性生命的主要癌癥，在西方國(guó)家占男性死亡率的第二位，目前我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率也急劇增加。PSA是一種僅由前列腺上皮細(xì)胞分泌的糖蛋白，相對(duì)分子量為33kD，有獨(dú)特的組織特異性，患PC時(shí)，血清中PSA升高。PSA被公認(rèn)是90年代診斷PC不可缺少的腫瘤標(biāo)志物，配合直腸指診或超聲波檢查，可明顯提高PC診斷的陽(yáng)性率。前列腺特異抗原包被板制備1、物理吸附的普通板的包被將25mg前列腺特異抗原抗體加入到2500mL0.1MpH為8.7-8.8的碳酸氫鈉的水溶液中，攪棒混勻；向96孔物理吸附的普通板的每孔加入100ill濃度為10iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小時(shí)。向0.01MpH為7.4的3000ml磷酸鹽緩沖液中加入蔗糖90g，BSA12g，混勻；每孔加110iU，37t:溫浴45分鐘；用洗板機(jī)洗孔1次，在紙抹布上輕輕拍干；將包被板放在風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干1小時(shí)，即可得到物理吸附的前列腺特異抗原包被的普通板Plate-l.2、含磺酰氯基團(tuán)的活性載體的包被將15mg前列腺特異抗原抗體加入到3000mL0.1MpH為8.7_8.8的碳酸氫鈉的水溶液中，攪棒混勻；向制備實(shí)施例1制得的含磺酰氯基團(tuán)的活性96孔板的每孔加入100iU濃度為5iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小時(shí)。向0.01MpH為7.4的3000ml磷酸鹽緩沖液中加入蔗糖90g，BSA12g，混勻；每孔加110iU，37t:溫浴45分鐘；用洗板機(jī)洗孔1次，在紙抹布上輕輕拍干。將包被板放在風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干1小時(shí)，即可得到化學(xué)偶聯(lián)的前列腺特異抗原包被的活性載體板Plate-2.兩種不同板子的對(duì)照實(shí)驗(yàn)操作按照北京市福瑞生物工程公司前列腺特異抗原化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種固定含氨基化合物的活性載體，其特征在于該活性載體是帶有功能性基團(tuán)磺酰氯的具有芳香環(huán)的高分子聚合物的固相材料。2.—種含氨基化合物的固定方法，其特征在于該方法為以具有芳香環(huán)的高分子聚合物為固相材料，通過(guò)化學(xué)方法，即一步法或兩步法反應(yīng)得到帶有功能性基團(tuán)磺酰氯的活性載體，然后通過(guò)磺酰氯基團(tuán)與含有氨基的目標(biāo)化合物在堿性水溶液中反應(yīng)，使含有氨基的目標(biāo)化合物以化學(xué)鍵的形式固定在固相材料表面上。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定含氨基化合物的活性載體，其特征在于，所述的固相材料為用聚苯乙烯制成的實(shí)心珠、管狀物或者96孔板。4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種固定含氨基化合物的活性載體的制備方法，其特征在于該方法為一步法或兩步法反應(yīng)所述的一步法具體步驟為A.以400-800體積份的甲苯為溶劑，80-250體積份的氯磺酸為磺化劑，20-250重量份的三氯氧磷或者氯化鋅為催化劑，將上述試劑混合均勻；B.10-6(TC條件下，將固相材料浸泡于步驟A配制的混合液中4.0-12.0小時(shí)，用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；所述的兩步法的具體步驟為以400-800體積份的甲苯為溶劑，與80-250體積份的濃硫酸混合均勻后，10-6(TC條件下，將固相材料浸泡在甲苯與濃硫酸的混合液中反應(yīng)4.0-12.0小時(shí)；向混合液中再加入20-250重量份的氯化亞砜或者三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)4.0-12.0小時(shí)；用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；重量份與體積份的關(guān)系為g/ml或kg/1。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種固定含氨基化合物的活性載體的制備方法，其特征在于該方法中所述的一步法或兩步法具體步驟為所述的一步法具體步驟為A.以640體積份的甲苯為溶劑，210體積份的氯磺酸為磺化劑，80重量份的三氯氧磷或者氯化鋅為催化劑，將上述試劑混合均勻；B.6(TC條件下，將固相材料浸泡于步驟A配制的混合液中6小時(shí)，用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；所述的兩步法的具體步驟為以420體積份的甲苯為溶劑，與230體積份的濃硫酸混合均勻后，3(TC條件下，將固相材料浸泡在甲苯與濃硫酸的混合液中反應(yīng)4.5小時(shí)；向混合液中再加入180重量份的氯化亞砜或者三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)；用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；重量份與體積份的關(guān)系為g/ml或kg/1。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含氨基化合物的固定方法，其特征在于該方法中所述的固相材料為用聚苯乙烯制成的實(shí)心珠、管狀物或者96孔板；所述的一步法或兩步法具體步驟為A.以400-800體積份的甲苯為溶劑，80-250體積份的氯磺酸為磺化劑，20-250重量份的三氯氧磷或者氯化鋅為催化劑，將上述試劑混合均勻；B.10-6(TC條件下，將固相材料浸泡于步驟A配制的混合液中4.0-12.0小時(shí)，用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；所述的兩步法的具體步驟為以400-800體積份的甲苯為溶劑，與80-250體積份的濃硫酸混合均勻后，10-6(TC條件下，將固相材料浸泡在甲苯與濃硫酸的混合液中反應(yīng)4.0-12.0小時(shí)；向混合液中再加入20-250重量份的氯化亞砜或者三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)4.0-12.0小時(shí)；用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；重量份與體積份的關(guān)系為g/ml或kg/l。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種含氨基化合物的固定方法，其特征在于該方法中所述的一步法或兩步法具體步驟為所述的一步法具體步驟為A.以780體積份的甲苯為溶劑，160體積份的氯磺酸為磺化劑，220重量份的三氯氧磷或者氯化鋅為催化劑，將上述試劑混合均勻；B.3(TC條件下，將固相材料浸泡于步驟A配制的混合液中10.5小時(shí)，用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；所述的兩步法的具體步驟為以720體積份的甲苯為溶劑，與90體積份的濃硫酸混合均勻后，2(TC條件下，將固相材料浸泡在甲苯與濃硫酸的混合液中反應(yīng)11小時(shí)；向混合液中再加入80重量份的氯化亞砜或者三氯化鋁繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)；用水沖洗固體表面，再用丙酮洗滌，干燥即可；重量份與體積份的關(guān)系為g/ml或kg/1。8.根據(jù)權(quán)利要求2、6或7所述的一種含氨基化合物的固定方法，其特征在于，所述的含有氨基的目標(biāo)化合物為無(wú)生物活性或者有生物活性的化合物，無(wú)生物活性的化合物為C4—18的脂肪族胺或芳香族胺，包括乙二胺、十八胺、苯胺、芐胺，有生物活性的化合物包括氨基酸、蛋白質(zhì)、抗原、單克隆抗體、第二抗體、多克隆抗體或核苷酸。9.根據(jù)權(quán)利要求2、6、7或8所述的一種含氨基化合物的固定方法，其特征在于，磺酰氯基團(tuán)與氨基酸或蛋白質(zhì)的偶聯(lián)反應(yīng)條件為ra值在4-i0的水溶液體系；條件優(yōu)選ra值在6-9的水溶液體系。10.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種固定含氨基化合物的活性載體，其特征在于該活性載體在放射免疫分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、時(shí)間分辨免疫分析、聚合酶鏈反應(yīng)、基因工程或多肽的固相合成中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種固定含氨基化合物的活性載體及其固定方法，特別是氨基酸或蛋白質(zhì)在固相材料表面的固定方法。該方法是以具有芳香環(huán)的高分子聚合物為固體材料，通過(guò)化學(xué)方法，使其帶有功能性基團(tuán)磺酰氯，通過(guò)磺酰氯與含有氨基的目標(biāo)物反應(yīng)，使目標(biāo)物以化學(xué)鍵的形式固定在固體聚合物表面上。該活性載體制作過(guò)程簡(jiǎn)單、費(fèi)用低，該固定方法節(jié)約原料，穩(wěn)定性好，均一性好，可用于放射免疫分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析和時(shí)間分辨免疫分析、聚合酶鏈反應(yīng)、基因工程和多肽的固相合成等領(lǐng)域。文檔編號(hào)G01N33/545GK101776686SQ20091021755公開(kāi)日2010年7月14日申請(qǐng)日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者仲偉強(qiáng),沙栩正申請(qǐng)人:沙栩正;仲偉強(qiáng)