專(zhuān)利名稱(chēng)：一種包被載體及其在檢測(cè)精子成熟度和無(wú)創(chuàng)分離成熟精子方法中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)體外精子質(zhì)量、體外輔助生殖領(lǐng)域，特別是涉及一 種包被載體及其在檢測(cè)精子成熟度和無(wú)創(chuàng)分離成熟精子方法中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸是卵子和透明帶黏液基質(zhì)的主要成分。精子頂體和胞質(zhì)膜 中含有透明質(zhì)酸酶。當(dāng)精子穿透卵冠丘復(fù)合體時(shí)，胞質(zhì)膜中透明質(zhì)酸酶水
解卵冠丘復(fù)合體中的黏液透明質(zhì)酸，從而穿過(guò)黏液；在透明帶誘發(fā)頂體 反應(yīng)時(shí)精子釋放透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸，有助于精子穿透透明帶完成 受精。在整個(gè)過(guò)程中，精子與透明質(zhì)酸結(jié)合起到了重要作用。有研究表明 只有成熟的活動(dòng)精子可以與透明質(zhì)酸結(jié)合，成熟精子遺傳物質(zhì)完整，有 益于成功妊娠和子代健康。
輔助生殖是治療不孕不育的有效方法，但同時(shí)也存在一定的遺傳風(fēng) 險(xiǎn)，尤其是采用細(xì)胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)技術(shù)時(shí)，穿入卵細(xì)胞的精子 是人為選擇的，選擇具有一定的隨機(jī)性，所選精子的成熟度將決定胚胎 的健康狀況，不成熟的精子與卵細(xì)胞結(jié)合后，胚胎會(huì)變得不穩(wěn)定，容易 導(dǎo)致流產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育以及畸形等嚴(yán)重后果。由于必須保證精子的形 態(tài)、結(jié)構(gòu)與活力不受外來(lái)破壞，故要選擇成熟的精子進(jìn)行ICSI目前是一 件非常困難的事情
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透 明質(zhì)酸衍生物包被載體，并應(yīng)用于檢測(cè)精子成熟度和分離成熟精子，結(jié) 果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單快捷、成本低、安全性能好的；還提供應(yīng)用這種 包被載體來(lái)檢測(cè)精子成熟度和分離成熟精子的方法。
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種包被載體，其特征在于所述包 被載體為被透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被的栽體。
所述包被載體為包被載片或包被容器，或包被的球體或圓柱體或錐 體或立方體或不規(guī)則體置于或固定在載片表面或容器內(nèi)。
所述的包被載體通過(guò)如下步驟制備
a. 以乙醇洗滌待包被載體，干燥；
b. 透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物2~6mg/ml,脫乙 酰殼多糖3~8 mg / ml,以0.02 0.10mol/L、 pH = 4.0的檸檬 酸或醋酸緩沖液充分溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；
c. 包被于載體；
d. 以10~30%丙酮，0.5 3.5% 1,2,7,8-二環(huán)氧基辛烷，10~25%異 丙醇，余量為蒸餾水組成的洗滌液洗滌3次，烘干即可；
所述包被載體為無(wú)毒性材質(zhì)；所述包被載體為玻璃材質(zhì)或塑料材質(zhì)。 本發(fā)明的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被的載體應(yīng)用
于檢測(cè)活力精子成熟度。
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)精子成熟度的方法，其特征在于，包括如下
步驟
A. 制備活力精子標(biāo)本；
B. 將活力精子標(biāo)本加樣到透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生 物包^皮載體；
C. 室溫反應(yīng)5-60分鐘，使成熟的活力精子與包被物結(jié)合；D. 顯微鏡下觀察活力精子頭部被包被物捕獲的狀況，并計(jì)數(shù)一定數(shù)
量的活動(dòng)精子和其中與包被物結(jié)合的活動(dòng)精子個(gè)數(shù)；
E. 計(jì)算活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合率，公式為活力精子與透明質(zhì)酸 結(jié)合率=與包被物結(jié)合的活動(dòng)精子數(shù)/活動(dòng)精子總數(shù)x100。/。。
所述步驟A中標(biāo)本制備方法為取用液化的新鮮精液，或取用液氮超 低溫凍存的解凍精液；
其中，新鮮精液液化方法為
a. 等待新鮮精液在體外自然液化；
若精液在體外60分鐘后仍然不能完全自然液化時(shí)，則
b. 在精液中加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液并以吸管反復(fù)吹 打，促進(jìn)精液完全液化；或
c. 在精液中加入lmg/ml菠蘿蛋白酶等蛋白水解酶，37。C孵育 5 20分鐘；
所述步驟B中的載體為包被載片或者是表面置有或固定有包被的球 體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體的載片，將活力精子標(biāo)本加樣到 包被的載片后蓋上蓋玻片；
所述步驟D中，計(jì)數(shù)的活動(dòng)精子總數(shù)大于或等于200個(gè)。 所述檢測(cè)方法中活力精子標(biāo)本的加樣量與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或 透明質(zhì)酸衍生物在載體上的包被量、包被范圍有關(guān)；活力精子標(biāo)本的加 樣量越大、標(biāo)本中活力精子密度越大，要求透明質(zhì)酸在載體上的包被量 與包被范圍越大；載體上包被物結(jié)合精子的能力相對(duì)于參入反應(yīng)的精子 總是過(guò)量的。該方法中反應(yīng)時(shí)間與室溫有關(guān)，室溫較高、反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 可能導(dǎo)致結(jié)合的精子因活動(dòng)力增強(qiáng)而掙脫結(jié)合； 一般反應(yīng)時(shí)間為5~60分 鐘。
由于只有成熟的活動(dòng)精子才可與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物結(jié)合，故與載體結(jié)合的為成熟的活力精子，不能結(jié)合的為非成熟
精子，精子透明質(zhì)酸結(jié)合判定標(biāo)準(zhǔn)為精子活動(dòng)受限，精子頭部結(jié)合在 載體上不能前向泳動(dòng)，精子尾部可自由擺動(dòng)的為與載體結(jié)合的活力精子， 即成熟精子；精子頭部未與載體結(jié)合，精子整體可以自由穿梭泳動(dòng)的為 非結(jié)合精子，即非成熟精子；檢測(cè)的活動(dòng)精子總數(shù)不低于200個(gè)。檢測(cè) 的活動(dòng)精子總數(shù)包括與透明質(zhì)酸結(jié)合的和非結(jié)合的活動(dòng)精子。
本發(fā)明的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被的載體應(yīng)用 于分離成熟精子。
本發(fā)明還提供一種分離成熟精子的方法，其特征在于，包括如下步
驟
A. 活力精子標(biāo)本制備；
B. 將活力精子標(biāo)本加樣到透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生 物包^皮載體內(nèi)；
C. 18-37度下反應(yīng)5-120分鐘，使成熟活力精子與包被物結(jié)合；
D. 收集與包被物結(jié)合的精子。 所述步驟A中，樣品制備包括以下步驟
a、 采用液化的新鮮精液或采用液氮超低溫凍存的解凍精液；
其中，新鮮精液的液化方法為①等待新鮮精液在體外自 然液化；若新鮮精液在體外60分鐘后仍然不能完全液化時(shí)， 則②在精液中加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液并以吸管反 復(fù)吹打；③在精液中加入lmg/ml的菠蘿蛋白酶等蛋白水解 酶，37。C孵育5~20分鐘；
b、 以上泳法或密度梯度法收集高活力精子；
c、 以培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液調(diào)整精子濃度至 0.25 1.0xl06/ml;
9d、在潔凈的包被栽體內(nèi)預(yù)先加入培養(yǎng)液覆蓋包被區(qū)域；或在栽
體包凈皮區(qū)域內(nèi)預(yù)先加入培養(yǎng)液滴或聚乙烯基吡咯烷酮液滴； 其中，所述步驟b中上泳法收集高活力精子的步驟如下
① 于試管底部加入精液lml,輕輕在試管精液上層加入1.5 ml培 養(yǎng)液，其中精液與培養(yǎng)液體積比值為1:1.5;
② 輕輕將試管置于45度角傾斜試管架上，置37。C、 5%(:02培 養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)；
③ 小心吸取最上層lml培養(yǎng)液；
④ 500g離心5分鐘；
⑤ 吸走精子沉淀團(tuán)上方的培養(yǎng)液；
⑥ 加入0.2ml培養(yǎng)液。
所述步驟B中的載體為包被容器，或者是內(nèi)部置有或固定有包被的 球體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體的容器；
所述步驟B中的包被載體為無(wú)毒無(wú)熱源型材質(zhì)；
所述步驟B中的將活力精子標(biāo)本加樣到包被載體內(nèi)的方法，采用如 下三種方法中的其中一種
直接覆蓋包凈皮區(qū)域；或
當(dāng)在潔凈的包被載體內(nèi)預(yù)先加入了培養(yǎng)液時(shí)，則加樣到該培養(yǎng)液中；
或
當(dāng)在載體包被區(qū)域內(nèi)存在預(yù)先加入的培養(yǎng)液滴或聚乙烯基吡咯烷酮 液滴時(shí)，則加樣到上迷液滴內(nèi)；
所述步驟D的收集與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子的方法為直接在顯4敖鏡 下以細(xì)胞漿內(nèi)精子注射用穿刺針或其他中空細(xì)管吸取與載體內(nèi)包被區(qū)域 結(jié)合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者
小心傾倒去除未與包被區(qū)域結(jié)合的精子并立即加入培養(yǎng)液或商品化
10的精子洗滌液；然后直接在顯微鏡下以細(xì)胞漿內(nèi)精子注射用穿刺針或中 空細(xì)管吸取與包被區(qū)域結(jié)合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者
小心傾倒去除未與載體內(nèi)包被區(qū)域結(jié)合的精子后，立即在載體內(nèi)加 入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液，并以吸管輕輕吹打透明質(zhì)酸或透明質(zhì) 酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被區(qū)域結(jié)合的精子，促進(jìn)結(jié)合精子從結(jié)合表面 分離，收集分離后的精子，即得到成熟的活力精子。
所述分離方法中捕獲精子能力與反應(yīng)時(shí)間和溫度有關(guān)， 一般反應(yīng)時(shí) 間為5 120分鐘，溫度為18~37°C。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)18 28。C反應(yīng)時(shí)間10~30 分鐘；30 35"C反應(yīng)時(shí)間5 10分鐘；28°。反應(yīng)時(shí)間30 120分鐘，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)28。C反應(yīng)時(shí)間30-120分鐘較18~28°(:反應(yīng)時(shí)間10 30分鐘可捕獲更多 的成熟精子，在此期間，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)捕獲的精子量越多。
所述分離方法中進(jìn)一步采用上泳法或者密度梯度法不僅提高了高活 力精子的回收率，從而也提高了后續(xù)提取成熟活力精子的效率。
本發(fā)明中檢測(cè)和分離方法所用的培養(yǎng)液可以是本領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)室常少見(jiàn)所 用的培養(yǎng)液，比如可以是HTF培養(yǎng)液或F10培養(yǎng)液或Qui皿，s培養(yǎng)液或 Earle培養(yǎng)液?；蛴上率鼋M分組成的培養(yǎng)液NaCl重量含量為0.28-1.11%、 KC1重量含量為0.02-0.07%、 CaCl2'2H20重量含量為0.01-0.05%、 KH2P04 重量含量為0.01-0.03%、 MgS04.7H20重量含量為0.01-0.06%、酚紅重量 含量為0.0005-0.003%。、 NaHC03重量含量為0.10-0.42%、葡萄糖重量含 量為0.05-0.20%、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060%0、 BSA重量含量 為0.17-0.70%、青霉素的含量為10000-20000單位％、硫酸鏈霉素重量含 量為0.05-0.50%。和乳酸鈉糖漿(600 g/L)體積含量為0.18-0.74%,余量為 蒸餾水。該培養(yǎng)液用于調(diào)整精子密度，為精子提供能量和適宜的生存與 反應(yīng)條件，也可用于以上泳法提取高活力精子。
本發(fā)明中的活力精子是指有運(yùn)動(dòng)力的精子， 一定是活體精子；而活
ii體精子不一定具有運(yùn)動(dòng)力?；顒?dòng)精子是指具有泳動(dòng)能力的精子，與活力 精子同義。
本發(fā)明的有益效果為
1、 由于只有成熟的精子頭部才具備與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明 質(zhì)酸衍生物結(jié)合的受體，因此通過(guò)檢測(cè)活力精子與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸 鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被固相結(jié)合的狀況，便可判定精子的成熟狀況； 將結(jié)合于包被固相的活力精子通過(guò)洗滌或直接選取的方法從包被固相上 分離開(kāi)，就可以獲得成熟、結(jié)構(gòu)完整無(wú)損的活力精子。研究表明分別 以免疫組化法、苯胺藍(lán)染色法、熒光染色法、鈣離子載體法、巴氏染色 法、計(jì)算機(jī)輔助分析法檢測(cè)精子的肌酸激酶、核蛋白、DNA、誘發(fā)頂體 反應(yīng)、形態(tài)學(xué)和活動(dòng)力，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸結(jié)合精子與非結(jié)合精子之間、透 明質(zhì)酸結(jié)合法分離之后與分離前精子之間均存在顯著性差異(PO.01 ), 與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子、透明質(zhì)酸結(jié)合法分離之后的活力精子各項(xiàng)指標(biāo) 均明顯高于非結(jié)合精子和分離前的精子，且與這些指標(biāo)呈正相關(guān)。這些 充分說(shuō)明本發(fā)明方法捕獲的精子成熟度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
2、 由于采用了預(yù)包被方案，試劑組成簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單快捷；
3、 本發(fā)明采用無(wú)毒性包被載體，不會(huì)殺傷活力精子；采用無(wú)毒無(wú)熱 源性的包被載體、保證了分離后的精子用于輔助生殖的安全性。
本發(fā)明可用于評(píng)價(jià)男性精子質(zhì)量、精子成熟度及男性不育病因?qū)W分 析；并適用于輔助生殖或生殖研究中安全地收集成熟活力精子，從而實(shí) 現(xiàn)較大程度改善胚胎質(zhì)量的目的。


圖1是實(shí)施例八中，28"條件下反應(yīng)時(shí)間與透明質(zhì)酸包被載體捕獲 精子數(shù)量的關(guān)系趨勢(shì)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一包被載體的制備 按照如下步驟制備包被載體
a. 以乙醇洗滌待包被載體，千燥；
b. 以0.02mol/L的檸檬酸緩沖液(pH 4.0 )充分溶解得到的透明質(zhì)酸 2mg/ml、脫乙酰殼多糖8mg/ml,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；
c. 包纟皮于載體；
d. 以10°/。丙酮，0.5% 1,2,7,8-二環(huán)氧基辛烷，25%異丙醇，余量蒸餾 水混合而成的洗滌液洗滌3次，烘干。
其中，包被載體可以是包被載片，包被容器，表面置有或固定有包 被的球體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體的載片，內(nèi)部置有或固定 有包被的球體或圓柱體或立方體或不規(guī)則體的容器等。
其中，包被載體可以是玻璃載體、塑料載體或其它材質(zhì)的載體。 其中，包被載體可以是各種培養(yǎng)亞、微孔或微板(microwdl & microplate)、試管、培養(yǎng)管、離心管或其他載體。 '
實(shí)施例二包被載體的制備
方法同實(shí)施例一，所不同在于，步驟b中采用透明質(zhì)酸衍生物透 明質(zhì)酸衍生物6mg/ml，脫乙酰殼多糖6mg/ml，以0.10mol/L的檸檬 酸緩沖液(pH4.0)充分溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；
步驟d中的洗滌液成分為30%丙酮,3.5% 1,2，7,8-二環(huán)氧基辛烷, 10°/。異丙醇，余量蒸餾水。
所述透明質(zhì)酸衍生物的種類(lèi)包括在透明質(zhì)酸分子的羧基、羥基、 N-乙?；瓦€原末端4個(gè)位點(diǎn)，與其他化合物以酯化、交聯(lián)、接枝等化 學(xué)方式修飾形成的衍生化合物。
13實(shí)施例三包被載體的制備
方法同實(shí)施例一，所不同在于，所述步驟b中采用透明質(zhì)酸鈉鹽和
其他緩沖液透明質(zhì)酸鈉鹽4mg/ml,脫乙酰殼多一唐3 mg/ml，以 0.06mol/L的醋酸緩沖液(pH4.0)充分溶解混勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；
所述步驟d中的洗滌液成分為20。/。丙酮，2.0% 1,2，7,8-二環(huán)氧基辛 烷，15%異丙醇，余量蒸餾水。
上述透明質(zhì)酸鈉鹽可以用透明質(zhì)酸鉀鹽替換，其它均同。
實(shí)施例四應(yīng)用包被載體檢驗(yàn)活力精子的成熟度 具體步驟如下
1. 活力精子標(biāo)本準(zhǔn)備取男性新鮮精液，由于60分鐘仍然不能液化， 故在精液中加入lmg/ml菠蘿蛋白酶等蛋白水解酶，37。C孵育5 20分鐘 使其液化。
2. 取活力精子標(biāo)本10ul加樣到包被載片，蓋上蓋玻片；
3. 室溫反應(yīng)IO分鐘，使成熟的活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合；
4. 在30分鐘內(nèi)完成結(jié)果觀察和計(jì)數(shù)顯微鏡下觀察的活動(dòng)精子總數(shù) 為300個(gè)，其中，與透明質(zhì)酸結(jié)合的活動(dòng)精子為15個(gè)。成熟活力精子判 定標(biāo)準(zhǔn)精子活動(dòng)受限，精子頭部結(jié)合在載體上不能前向泳動(dòng)，精子尾 部可自由擺動(dòng)的為成熟的活力精子；精子頭部未與載體結(jié)合，精子整體 可以自由穿梭泳動(dòng)的為非成熟活力精子。
5. 計(jì)算活力精子與透明質(zhì)酸的結(jié)合率?；盍油该髻|(zhì)酸結(jié)合率=與 透明質(zhì)酸結(jié)合的活動(dòng)精子數(shù)/活動(dòng)精子總數(shù)x100。/。 = 15/300xl00%=5%, 即為精子標(biāo)本的成熟度。
實(shí)施例五應(yīng)用包被載體檢驗(yàn)活力精子的成熟度 具體步驟如下1. 活力精子標(biāo)本準(zhǔn)備取男性新鮮精液，由于60分鐘仍然不能液化， 故加入培養(yǎng)液(也可采用其他商品化的精子洗滌液)并以吸管反復(fù)吹打 以使其液化。
2. 取上述活力精子標(biāo)本10ul加樣到包被載片，蓋上蓋玻片；
3. 室溫反應(yīng)30分鐘，使成熟的活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合；
4. 在30分鐘內(nèi)完成結(jié)果觀察和計(jì)數(shù)。顯微鏡下觀察的活動(dòng)精子總數(shù) 為400個(gè)，其中，與透明質(zhì)酸結(jié)合的活動(dòng)精子為260個(gè)。成熟活力精子 判定標(biāo)準(zhǔn)精子活動(dòng)受限，精子頭部結(jié)合在載體上不能前向泳動(dòng)，精子 尾部可自由擺動(dòng)的為成熟的活力精子；精子頭部未與載體結(jié)合，精子整 體可以自由穿梭泳動(dòng)的為非成熟活力精子。
5. 計(jì)算活力精子透明質(zhì)酸結(jié)合率?；盍油该髻|(zhì)酸結(jié)合率=與透 明質(zhì)酸結(jié)合的活動(dòng)精子數(shù)/活動(dòng)精子總數(shù)><100% =260/400=65%，即為精 子標(biāo)本的成熟度。
實(shí)施例六應(yīng)用包被載體檢驗(yàn)活力精子的成熟度 具體步驟如下
1. 活力精子標(biāo)本準(zhǔn)備取男性新鮮精液，其在體外30分鐘時(shí)完全自 然液化。
2. 取上述活力精子標(biāo)本10ul加樣到包被載片，蓋上蓋玻片；
3. 室溫反應(yīng)60分鐘，使成熟的活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合；
4. 在30分鐘內(nèi)完成結(jié)果觀察和計(jì)數(shù)。顯微鏡下觀察的活動(dòng)精子總數(shù) 為500個(gè)，其中，與透明質(zhì)酸結(jié)合的活動(dòng)精子為450個(gè)。成熟活力精子 判定標(biāo)準(zhǔn)精子活動(dòng)受限，精子頭部結(jié)合在載體上不能前向泳動(dòng)，精子 尾部可自由擺動(dòng)的為成熟的活力精子；精子頭部未與載體結(jié)合，精子整 體可以自由穿梭泳動(dòng)的為非成熟活力精子。
5. 計(jì)算活力精子透明質(zhì)酸結(jié)合率。活力精子透明質(zhì)酸結(jié)合率=與透明質(zhì)酸結(jié)合的活動(dòng)精子凄W活動(dòng)精子總數(shù)x100 % = 450/500x100 % =90 % ， 即為精子標(biāo)本的成熟度。
實(shí)施例七應(yīng)用包被載體檢驗(yàn)活力精子的成熟度
方法基本同實(shí)施例六，所不同在于，活力精子標(biāo)本采用超低溫凍存 的解凍精液，顯微鏡下觀察的活動(dòng)精子總數(shù)為500個(gè)，其中，與透明質(zhì) 酸結(jié)合的活動(dòng)精子為350個(gè)。活力精子透明質(zhì)酸結(jié)合率=與透明質(zhì)酸結(jié)合 的活動(dòng)精子數(shù)/活動(dòng)精子總數(shù)x100。/0 =350/500x100% =70%，即為精子標(biāo) 本的成熟度。
實(shí)施例四 七中，采用的包被載體為包被載片，還可以采用表面置 有或固定有包被的球體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體的載片。
實(shí)施例八應(yīng)用包被載體分離、收集成熟的活力精子 具體步驟如下
1.樣品制備
1 )取1份男性新鮮精液，在精液中加入lmg/ml的菠蘿蛋白酶等
蛋白水解酶，37。C孵育5 20分鐘，使其液化。 2)以上泳法收集高活力精子
① 于試管底部加入精液lml,輕輕在試管精液上層加入1.5 ml 培養(yǎng)液(精液與培養(yǎng)液體積比值為1:1.5);
② 輕輕將試管置于45度角傾斜試管架上，置37。C、 5%<:02培 養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)；
③ 小心吸取最上層lml培養(yǎng)液； 500g離心5分鐘；
⑤ 吸走精子沉淀團(tuán)上方的培養(yǎng)液；
⑥ 加入0.2ml培養(yǎng)液；
163) 上述得到的液體取三份，分別以培養(yǎng)液調(diào)整精子濃度至
0.25xl06/ml， 0.5xl06 /ml, l.OxlO6 /ml，調(diào)整濃度后每份樣品 lOjil;
4) 在潔凈的包被容器內(nèi)預(yù)先加入培養(yǎng)液。
2. 將上述3份樣品的活力精子標(biāo)本分別加樣到透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸 鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被容器內(nèi)的培養(yǎng)液中。
3. 分別于28。C反應(yīng)15, 30, 45， 60， 75， 90， 105, 120分鐘， <吏 成熟活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合。
4. 收集與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子直接在顯微鏡下以細(xì)胞漿內(nèi)精子注 射(ICSI)用穿刺針(也可以用其他中空細(xì)管代替)吸取與容器內(nèi)包被 區(qū)域結(jié)合的活動(dòng)精子，即得成熟的活力精子。結(jié)果參見(jiàn)附圖1所示，隨 著時(shí)間推移收集成熟精子量增加。
實(shí)施例九應(yīng)用包被載體分離、收集成熟的活力精子 具體步驟如下
1.樣品制備
1 )取新鮮精液，加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液并以吸管反復(fù) 吹打，使其完全液化；
2) 同實(shí)施例八，以上泳法收集高活力精子；
3) 以商品化的精子洗滌液，如美國(guó)Irvine公司的F10精子洗精 液，調(diào)整精子濃度至0.25-1.0xl(^個(gè)/ml;(如果在"包被載體檢驗(yàn)活 力精子的成熟度"試驗(yàn)中，精子成熟率較高，則此處精子濃度可以 低一點(diǎn)；如果標(biāo)本中精子成熟率較低，為了可以收集到較多的成熟 精子，則此處精子濃度應(yīng)調(diào)整得高一些。如果收集的精子僅僅是用 于ICSI,則精子數(shù)量不需要太多，此處精子濃度無(wú)需太高，但如果 并非是ICSI用途，需要的成熟精子越多越好，則此處精子濃度調(diào)高一些更好。) 4)在潔凈的容器包被區(qū)域內(nèi)加入聚乙烯基吡咯烷酮液滴；
2.將活力精子標(biāo)本加樣到包被區(qū)域的聚乙烯基吡咯烷酮液滴中； 3.37。C反應(yīng)120分鐘，使成熟活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合。 4.收集與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子小心傾倒去除未與容器內(nèi)透明質(zhì)酸 或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被區(qū)域結(jié)合的精子并立即加入培養(yǎng)液 或商品化的精子洗滌液，容器內(nèi)即為分離得到的成熟的活力精子，然后 直接在顯微鏡下以細(xì)胞漿內(nèi)精子注射用穿刺針或中空細(xì)管吸取與容器內(nèi) 透明質(zhì)酸包被區(qū)域結(jié)合的活力精子。這樣處理去除了未結(jié)合的精子，在 最后收集成熟精子時(shí)，大大減少非成熟精子混入成熟精子中的機(jī)會(huì)。
實(shí)施例十應(yīng)用包被載體分離、收集成熟的活力精子 具體步驟如下
1.樣品制備
1) 取超低溫凍存的解凍精液；
2) 以密度梯度法收集高活力精子。采用瑞典N(xiāo)idacon公司的密度 梯度液PureSperm40和PureSperm80,密度梯度方法如下
① 臨用前制備梯度先在無(wú)菌錐形離心管底加入體積約為 PureSperm80密度梯度液2ml，然后其上層輕輕加入體積約為 PureSperm40的密度梯度液2ml，勿混合，待用。
② 在上述已制備好的密度梯度管中加入精液l~1.5ml。 300g離心 20分鐘。
③ 用另一支無(wú)菌巴氏管吸走上層精液、密度梯度液。
④ 再用另一支無(wú)菌巴氏管穿過(guò)梯度液，吸取底部精子沉淀物。
將收集到的精子沉淀團(tuán)加入到另外一支無(wú)菌錐形離心管。
⑥加入5ml培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液(如瑞典N(xiāo)idacon公司PureSpermWash)， 輕豐5〉'昆勻。
⑦ 500g離心IO分鐘。
⑧ 用新的巴氏管吸去精子沉淀團(tuán)上方的液體。
⑨ 力口入0.2 0.4ml培養(yǎng)液。
3 )以培養(yǎng)液調(diào)整精子濃度至0.25-1.0xl(^個(gè)/ml;(如果在"包^皮載 體檢驗(yàn)活力精子的成熟度"試驗(yàn)中，精子成熟率較高，則此處 精子濃度可以低一點(diǎn)；如果標(biāo)本中精子成熟率較低，為了可以 收集到較多的成熟精子，則此處精子濃度應(yīng)調(diào)整得高一些。如 果收集的精子僅僅是用于ICSI,則精子數(shù)量不需要太多，此處 精子濃度無(wú)須太高，但如果并非是ICSI用途，需要的成熟精 子越多越好，則此處精子濃度調(diào)高一些更好。)
4)在潔凈的包被容器內(nèi)包被區(qū)域加入培養(yǎng)液滴。
2. 將活力精子標(biāo)本加樣到上述包被區(qū)域的培養(yǎng)液滴中。
3. 18。C反應(yīng)IO分鐘，使成熟活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合。
4. 收集與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子小心傾倒去除未與容器內(nèi)透明質(zhì)酸 或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被區(qū)域結(jié)合的精子后，立即在容器內(nèi) 加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液，并以吸管輕輕吹打透明質(zhì)酸或透明 質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被區(qū)域結(jié)合的精子，促進(jìn)結(jié)合精子從結(jié)合表 面分離，收集分離后的精子，即得到成熟的活力精子。這樣處理去除了 未結(jié)合的精子，在最后收集成熟精子時(shí)，大大減少非成熟精子混入成熟 精子中的機(jī)會(huì)，且能一次性獲得數(shù)量較多的成熟精子。
其中，實(shí)施例八 十中，采用的包被載體為包被容器，還可以釆用 內(nèi)部置有或固定有包被的球體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體的容 器。
其中，實(shí)施例四 十的描述中，采用的載體是以透明質(zhì)酸包被的，也可以采用透明質(zhì)酸鹽和透明質(zhì)酸衍生物的包^^皮載體，應(yīng)用的方法相同， 透明質(zhì)酸鹽和透明質(zhì)酸衍生物與精子結(jié)合的有效成份仍是"透明質(zhì)酸"。
另外，本發(fā)明(包括權(quán)利要求和各實(shí)施例中)所述透明質(zhì)酸鹽包括
鈉鹽、鉀鹽等。所述透明質(zhì)酸衍生物的種類(lèi)包括在透明質(zhì)酸分子的羧 基、羥基、N-乙酰基和還原末端4個(gè)位點(diǎn)，與其他化合物以酯化、交聯(lián)、 接枝等化學(xué)方式修飾形成的衍生化合物。
本發(fā)明的方法中，精子液化的方法也可以采用新鮮精液在體外60分 鐘內(nèi)自然液化，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，如60分鐘后仍然不能完全液化時(shí)，可 采用實(shí)施例八~九的液化方法。
權(quán)利要求
1、一種包被載體，其特征在于所述包被載體為被透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被的載體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的包被載體，其特征在于所述包被載體為包被載片或包被容器，或包被的球體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體置于或固定在載片表面或容器內(nèi)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的包被載體，其特征在于，通過(guò)如下步驟制備a. 以乙醇洗滌待包被載體，干燥；b. 透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物2 6mg/ml，脫乙酰殼多糖3 8mg/ml，以0.02 0.10mol/L、 pH =4.0的檸檬酸或醋酸緩沖液充分溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；c. 包^皮于載體；d. 以10 30%丙酮，0.5~3.5% 1，2，7,8-二環(huán)氧基辛烷，10 25%異丙醇，余量為蒸餾水組成的洗滌液洗滌3次，烘干即可；所述包被載體為無(wú)毒性材質(zhì)；所述包被載體為玻璃材質(zhì)或塑料材質(zhì)。
4、 權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被的載體應(yīng)用于檢測(cè)活力精子成熟度。
5、 一種檢測(cè)精子成熟度的方法，其特征在于，包括如下步驟A. 制備活力精子標(biāo)本；B. 將活力精子標(biāo)本加樣到透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被載體；C. 室溫反應(yīng)5-60分鐘，使成熟的活力精子與包被物結(jié)合；D. 顯微鏡下觀察活力精子頭部被包被物捕獲的狀況，并計(jì)數(shù)一定數(shù)量的活動(dòng)精子和其中與包被物結(jié)合的活動(dòng)精子個(gè)數(shù)；E.計(jì)算活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合率，公式為活力精子與透明質(zhì)酸結(jié)合率=與包被物結(jié)合的活動(dòng)精子數(shù)/活動(dòng)精子總數(shù)x100。/。。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)精子成熟度的方法，其特征在于所述步驟A中標(biāo)本制備方法為取用液化的新鮮精液，或取用液氮超低溫凍存的解凍精液；其中，新鮮精液液化方法為a. 等待新鮮精液在體外自然液化；若精液在體外60分鐘后仍然不能完全自然液化時(shí)，則b. 在精液中加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液并以吸管反復(fù)吹打，促進(jìn)精液完全液化；或c. 在精液中加入lmg/ml菠蘿蛋白酶等蛋白水解酶，37°。孵育5~20分鐘；所述步驟B中的載體為包被載片或者是表面置有或固定有包被的球體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體的載片，將活力精子標(biāo)本加樣到包被的載片后蓋上蓋玻片；所述步驟D中，計(jì)數(shù)的活動(dòng)精子總數(shù)大于或等于200個(gè)。
7、 權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被的載體應(yīng)用于分離成熟精子。
8、 一種分離成熟精子的方法，其特征在于，包括如下步驟A. 活力精子標(biāo)本制備；B. 將活力精子標(biāo)本加樣到透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被載體內(nèi)；C. 18-37度下反應(yīng)5-120分鐘，使成熟活力精子與包被物結(jié)合；D. 收集與包被物結(jié)合的精子。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離成熟精子的方法，其特征在于所述步驟A中，樣品制備包括以下步驟a、 采用液化的新鮮精液或采用液氮超低溫凍存的解凍精液；其中，新鮮精液的液化方法為①等待新鮮精液在體外自然液化；若新鮮精液在體外60分鐘后仍然不能完全液化時(shí)，則②在精液中加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液并以吸管反復(fù)吹打；③在精液中加入lmg/ml的菠蘿蛋白酶等蛋白水解酶，37°C孵育5~20分鐘；b、 以上泳法或密度梯度法收集高活力精子；c、 以培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液調(diào)整精子濃度至0.25~1.0xl06/ml;d、 在潔凈的包被載體內(nèi)預(yù)先加入培養(yǎng)液覆蓋包被區(qū)域；或在載體包被區(qū)域內(nèi)預(yù)先加入培養(yǎng)液滴或聚乙烯基吡咯烷酮液滴；其中，所述步驟b中上泳法收集高活力精子的步驟如下① 于試管底部加入精液lml，輕輕在試管精液上層加入1.5 ml培養(yǎng)液，其中4青液與培養(yǎng)液體積比值為1:1.5;② 輕輕將試管置于45度角傾斜試管架上，置37°C、 5%(:02培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)；③ 小心吸取最上層lml培養(yǎng)液； 500g離心5分鐘；⑤ 吸走精子沉淀團(tuán)上方的培養(yǎng)液；⑥ 加入0.2ml培養(yǎng)液。
10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的分離成熟精子的方法，其特征在于所述步驟B中的載體為包被容器，或者是內(nèi)部置有或固定有包被的球體或圓柱體或錐體或立方體或不規(guī)則體的容器；所述步驟B中的包被載體為無(wú)毒無(wú)熱源型材質(zhì)；所述步驟B中的將活力精子標(biāo)本加樣到包被載體內(nèi)的方法，采用如下三種方法中的其中一種直接覆蓋包被區(qū)域；或當(dāng)在潔凈的包#:載體內(nèi)預(yù)先加入了培養(yǎng)液時(shí)，則加樣到該培養(yǎng)液中；或當(dāng)在載體包被區(qū)域內(nèi)存在預(yù)先加入的培養(yǎng)液滴或聚乙烯基吡咯烷酮液滴時(shí)，則加樣到上述液滴內(nèi)；所述步驟D的收集與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子的方法為直接在顯微鏡下以細(xì)胞漿內(nèi)精子注射用穿刺針或其他中空細(xì)管吸取與載體內(nèi)包被區(qū)域結(jié)合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者小心傾倒去除未與包^^皮區(qū)域結(jié)合的精子并立即加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液；然后直接在顯微鏡下以細(xì)胞漿內(nèi)精子注射用穿刺針或中空細(xì)管吸取與包被區(qū)域結(jié)合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者小心傾倒去除未與載體內(nèi)包被區(qū)域結(jié)合的精子后，立即在載體內(nèi)加入培養(yǎng)液或商品化的精子洗滌液，并以吸管輕輕吹打透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被區(qū)域結(jié)合的精子，促進(jìn)結(jié)合精子從結(jié)合表面分離，收集分離后的精子，即得到成熟的活力精子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種包被載體及其在檢測(cè)精子成熟度和無(wú)創(chuàng)分離成熟精子的方法中的應(yīng)用。該包被載體為被透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽或透明質(zhì)酸衍生物包被的載體。檢測(cè)方法為標(biāo)本制備；將標(biāo)本加樣到包被載體，蓋上蓋玻片；室溫反應(yīng)5-60分鐘；顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)；計(jì)算活力精子透明質(zhì)酸結(jié)合率；分離方法為標(biāo)本制備；將標(biāo)本加樣到包被載體內(nèi)；18-37度下反應(yīng)5-120分鐘；收集結(jié)合的精子。采用上述包被載體，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單快捷，成本低、安全性能好。可用于評(píng)價(jià)精子質(zhì)量、精子成熟度及男性不育病因?qū)W分析；并適用于輔助生殖或生殖研究中安全地收集成熟活力精子，從而實(shí)現(xiàn)較大程度改善胚胎質(zhì)量的目的。
文檔編號(hào)G01N33/544GK101487841SQ20091010543
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日
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