專(zhuān)利名稱(chēng)：：檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，具體地說(shuō)是檢測(cè)與老年黃斑變性疾病相關(guān)LOC387715基因與HTRA1基因之間，HTRA1基因上游4340bp處包含LOC387715基因的部分3，UTR區(qū)域的443堿基序列缺失/54堿基序列插入變異的試劑盒。
背景技術(shù)：
：黃斑變性疾病被認(rèn)為是一類(lèi)以進(jìn)行性中心視力下降及黃斑部視網(wǎng)膜色素上皮變性為特征的異質(zhì)性疾病，是重要的致盲性眼病。黃斑變性包括老年黃斑變性、黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(stargart病、best病、sorsby眼底營(yíng)養(yǎng)不良等)。老年黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)現(xiàn)已成為老年人最主要的致盲性眼病之一，全世界患病人數(shù)1000萬(wàn)，我國(guó)60-69歲人群AMD患病率為7.77%,70歲以上可達(dá)15.33%。目前對(duì)于AMD還無(wú)有效的治療方法，其主要原因就是發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)研究認(rèn)為，黃斑變性是一組異質(zhì)性疾病，遺傳因素在其發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。一些與老年黃斑變性(AMD)有相似臨床和組織病理表現(xiàn)的其他類(lèi)型黃斑變性的研究已取得重要進(jìn)展，比如近年研究發(fā)現(xiàn)隱性Stargardt黃斑變性在ABCR基因上有變異；顯性Stargardt黃斑變性(STGD3)在ELOVL4基因上有變異；Best黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)在VMD2基因上有變異；Sorsby眼底營(yíng)養(yǎng)不良患者在TIMP3基因存在點(diǎn)變異，還有黃斑蝶樣萎縮等與Peripherin/RDS基因變異有關(guān)。老年性黃斑變性是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家不可逆性視力喪失的主要原因，很多研究顯示其具有顯著的遺傳傾向。目前針對(duì)不同人群和種族的黃斑變性疾病的研究，正成為國(guó)際研究熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)單基因性黃斑變性疾病及疾病人群和種族相匹配對(duì)照人群的基因分析(多基因疾病分析)工作尚未真正系統(tǒng)性開(kāi)展，亦沒(méi)有相關(guān)的基因譜分析。AMD的前期研究證實(shí)補(bǔ)體旁路途徑成員的編碼基因，包括補(bǔ)體因子H(CFH)以及因子B/C2和個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，尤其是位于染色體lq31上的CFH被認(rèn)為是AMD主要的風(fēng)險(xiǎn)因子。其他一些關(guān)聯(lián)分析還顯示染色體10q26上存在另一個(gè)AMD的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。然而其確切致病基因尚不清楚。老年黃斑變性是一種和年齡增長(zhǎng)有關(guān)的多因素復(fù)合作用的眼底病。多發(fā)生在45歲以上，年齡越大，患病率越高。是全球成人致盲的首要疾病之一。老年性黃斑變性有時(shí)發(fā)展很慢，使患者不易察覺(jué)，有時(shí)卻進(jìn)展很快，迅速剝奪患者視物能力，因而其早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防顯得至關(guān)重要。本病真正病因不明，系多因素疾病，影響因素除年齡外，還有人種、性別、代謝等，遺傳因素至關(guān)重要。臨床上分為萎縮型(干性型)和滲出型(濕性型)。干性者，在眼底可見(jiàn)玻璃膜疣，逐步引起黃斑區(qū)變薄，從而影響功能。目前尚無(wú)特別有效的方法治療。濕性者，多引起視力的嚴(yán)重障礙，其視力破壞的原因主要是異常的新生血管在視網(wǎng)膜下生長(zhǎng)，引起視網(wǎng)膜出血、水腫及視網(wǎng)膜組織的破壞，最終導(dǎo)致疤痕形成，從而引起視力的喪失。濕性AMD—旦發(fā)病，病程迅速，常規(guī)治療的效果不佳，難以大幅度地恢復(fù)其已經(jīng)喪失的視功能。因此，早期診斷發(fā)現(xiàn)，及早干預(yù)，能更好的延緩病程，減少病人的視力喪失，提高生活質(zhì)量。目前的AMD診斷于依賴(lài)1、多于50歲以上老年人發(fā)病，年齡越大，發(fā)病率越高；2、雙眼先后發(fā)生視物變形、視力減退或明顯視力障礙；3、眼底有較明顯的玻璃膜疣及兩型各自的表現(xiàn)；4、眼底熒光血管造影。為了更為準(zhǔn)確地將患病風(fēng)險(xiǎn)人群篩選出來(lái)，發(fā)明人在本發(fā)明中，提供一種新的遺傳標(biāo)記物，在早期篩選發(fā)現(xiàn)AMD高危人群時(shí)準(zhǔn)確率更高，可以及時(shí)實(shí)施早期檢測(cè)和預(yù)防，減少其視力損害。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，該試劑盒通過(guò)檢測(cè)來(lái)源于待測(cè)個(gè)體的樣本中是否存在LOC387715基因與HTRA1基因之間，HTRA1基因上游4340bp處包含LOC387715基因的部分3'UTR區(qū)域的443堿基序列缺失/54堿基序列插入變異，更進(jìn)一步的，是否存在HTRA1基因1號(hào)外顯子內(nèi)的G—T變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrs2293870)，以及該區(qū)域內(nèi)與上述兩種連鎖的變異，而在早期監(jiān)測(cè)或診斷老年黃斑變性疾病的發(fā)生，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供參考。本發(fā)明針對(duì)染色體10q26的易感位點(diǎn)進(jìn)行了AMD和正常對(duì)照的基因型分析，發(fā)現(xiàn)染色體10q26的LOC387715基因與HTRA1基因之間的缺失/插入是導(dǎo)致AMD的主要的致病性變異，該D/I是位于HTRAl基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游4340bp處，包含LOC387715基因的部分3'UTR區(qū)域的443bp的堿基缺失和54bp堿基插入，本發(fā)明全世界首次發(fā)現(xiàn)了該變異和AMD的直接關(guān)聯(lián)性。此D/I基因型變異影響了下游HTRAl基因的表達(dá)，并繼而參與AMD致病過(guò)程。該處缺失/插入變異與其上游基因ARMS2(LOC387715)的關(guān)系尚在研究中，但本研究發(fā)現(xiàn)此處變異導(dǎo)致了上游基因ARMS2表達(dá)的下調(diào)，是否該蛋白表達(dá)量及其功能改變參與了AMD發(fā)病過(guò)程需要進(jìn)一步研究證實(shí)。研究結(jié)果顯示，相對(duì)于無(wú)缺失基因型，缺失基因型個(gè)體胎盤(pán)組織的HTRAl的轉(zhuǎn)錄翻譯水平上調(diào)，LOC387715的轉(zhuǎn)錄翻譯水平下調(diào)，免疫印跡也顯示AMD患者眼睛HTRAl抗體反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性。由此可見(jiàn)該變異引起了HTRAl的表達(dá)上調(diào)，從而在AMD易感性中占據(jù)重要地位。另外，本發(fā)明針對(duì)染色體10q26的易感位點(diǎn)進(jìn)行了AMD和正常對(duì)照的基因型分析，還發(fā)現(xiàn)位于10q26染色體HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)的G—T變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrs2293870)也是導(dǎo)致AMD的病因之一，其關(guān)聯(lián)度達(dá)到P〈10—12。SNPrs2293870的G—T變異導(dǎo)致了氨基酸的改變，有可能導(dǎo)致蛋白功能的改變。前期的研究還發(fā)現(xiàn)，HTRAl基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游512bp處的G—A變異與AMD高度相關(guān)，此處等位基因G—A的改變屬于單核苷酸序列多態(tài)性(SNPrsl1200638)，于2003年在基因組研究時(shí)發(fā)現(xiàn)報(bào)道。然而該變異的意義尚不清楚。本研究全世界首次發(fā)現(xiàn)了rsl1200638和AMD的直接關(guān)聯(lián)性。即使相對(duì)于包含己知AMD風(fēng)險(xiǎn)基因CHF變異的對(duì)照者，分析得到rsl1200638變異的人群歸因危險(xiǎn)度也達(dá)到49.3%。將rsll200638和CHF基因變異協(xié)同分析，得到人群歸因危險(xiǎn)度達(dá)到71.4%。研究結(jié)果顯示存在rsl1200638G—A變異的AMD患者淋巴細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞HTRAl的轉(zhuǎn)錄翻譯水平上調(diào)，免疫印跡也顯示AMD患者眼睛HTRAl抗體反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性。由此可見(jiàn)，rsll200638的G—A變異引起了HTRAl的表達(dá)上調(diào)，從而在AMD易感性中占據(jù)重要地位。此外，染色體10q26上的rsl04卯924G—T變異也和AMD高度相關(guān)，并且rsl1200638和rsl0490924處于一個(gè)LD。HTRAl基因編碼分泌型絲氨酸蛋白酶，其編碼產(chǎn)物在小鼠視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均有表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)HTRAl蛋白參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖降解，促進(jìn)了基質(zhì)蛋白降解酶對(duì)底物的降解作用，例如膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶?？梢韵胍?jiàn)，HTRAl的過(guò)度表達(dá)會(huì)破壞Bruch's膜的完整性，使得脈絡(luò)膜血管易于穿透侵入細(xì)胞外基質(zhì)，形成濕性AMD。此外，TGF-卩在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解和血管生成中發(fā)揮著重要作用，而HTRAl能夠結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-p。因此，LOC387715基因與HTRAl基因之間的缺失/插入變異，以及rsll200638的G—A變異均上調(diào)了HTRA1表達(dá)(見(jiàn)圖7)，繼而HTRAl蛋白及其下游信號(hào)活性分子的改變影響了眼內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)代謝降解過(guò)程以及血管生成，最終參與了AMD的發(fā)病進(jìn)程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了位于LOC387715基因與HTRAl基因之間的一組單核苷酸多態(tài)性變異(見(jiàn)下表)，它們也和AMD高度相關(guān)，并且與上述HTRAl基因上游4340bp的缺失/插入變異在一個(gè)LD。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，試劑盒的檢測(cè)原理為檢測(cè)與老年黃斑變性疾病密切相關(guān)的LOC387715基因與HTRAl基因間HTRA1基因缺失/插入變異是否存在，進(jìn)一步的，還檢測(cè)HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)的G—T變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrs2293870)是否存在，更進(jìn)一步的，還檢測(cè)與其連鎖的一組SNP變異是否存在。試劑盒中可以包括任選的用于檢測(cè)所述的LOC387715基因與HTRA1基因間缺失/插入變異和HTRA1基因1號(hào)外顯子內(nèi)的G—T變異的試劑以及相關(guān)變異位點(diǎn)的試劑，例如檢測(cè)LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入，以及檢測(cè)HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)的G—T突變的試劑和任選的用于擴(kuò)增LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入片段的試劑以及擴(kuò)增HTRAl基因或包含rs2293870基因片段的試劑。首先對(duì)獲得的樣本提取DNA并針對(duì)HTRA1基因或其-4340bp處443bp缺失片段以及1號(hào)外顯子位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)方法可以參考本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的檢測(cè)基因點(diǎn)突變位點(diǎn)的方法，例如直接測(cè)序法或使用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法或單堿基引物延伸法或Taqman法或芯片雜交等，判斷rs2293870位點(diǎn)的等位基囟型。優(yōu)選地，可以在試劑盒中進(jìn)一步包括擴(kuò)增和檢測(cè)rsl1200638變異的相關(guān)試劑，由于rsl1200638和rsl0490924連鎖度高，檢測(cè)HTRAl基因上游序列的G—T變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrsl0490924)也具有診斷AMD的效力?？梢栽谠噭┖兄屑尤雛sl0490924位點(diǎn)的擴(kuò)增和檢測(cè)試劑，進(jìn)一步提高準(zhǔn)確性。在所述的試劑盒中還可以進(jìn)一步包括包括檢測(cè)LOC387715基因與HTRAl基因之間的一組SNP，rsll200630、ENSSNP6019764、rs36212731、rs36212732、rs36212733rs3750848、rs3750847、rs3750846、rs2014307、rs3793917、rs3763764、rs58077526和/或rs2672593變異的試劑，如在試劑盒中加入所述位點(diǎn)的擴(kuò)增和檢測(cè)試劑，進(jìn)一步提供準(zhǔn)確性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，由于LOC387715基因與HTRA1基因間的缺失/插入突變導(dǎo)致AMD患者的HTRAl轉(zhuǎn)錄翻譯水平上調(diào)和HTRAl蛋白表達(dá)水平上調(diào)，因此針對(duì)HTRAl基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平設(shè)計(jì)的試劑盒同樣適用本發(fā)明。同時(shí)，該缺失/插入突變還導(dǎo)致了LOC387715轉(zhuǎn)錄翻譯水平下調(diào)和蛋白表達(dá)下調(diào)，因此針對(duì)LOC387715基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平設(shè)計(jì)的試劑盒同樣適用本發(fā)明。對(duì)于檢測(cè)上述基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平可以采用例如RT-PCR技術(shù)，提取mRNA,檢測(cè)患者細(xì)胞或組織內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄水平而獲得檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，可以通過(guò)提取來(lái)源于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的總蛋白，與HTRA1、LOC387715蛋白抗體進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定蛋白的表達(dá)水平而獲得檢測(cè)結(jié)果。更進(jìn)一步，可以通過(guò)制備HTRA1、LOC387715蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體，采用免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交方法在原位進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。本發(fā)明提供了檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，可用于早期監(jiān)控和檢測(cè)AMD高危人群，實(shí)施早期預(yù)防和治療，減少其視力損害。本發(fā)明試劑盒以L(fǎng)OC387715基因與HTRA1基因間缺失/插入變異和HTRA1基因1號(hào)外顯子G—T突變及其相關(guān)位點(diǎn)/基因?yàn)槟繕?biāo)，與AMD的關(guān)聯(lián)度高，協(xié)同HTRA1基因啟動(dòng)子區(qū)域的G—A變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrs11200638)、HTRA1基因上游序列的G—T變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrs10490924)的分析，更可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。圖1是LOC387715基因與HTRA1基因間缺失/插入變異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果A、B:純合插入PCR擴(kuò)增片段(大小約1000bp)C:雜合缺失/插入變異的PCR片段包括約600bp和1000bp的兩個(gè)條帶D:純合缺失變異的PCR擴(kuò)增片段(大小約600bp)圖2是Snapshot檢測(cè)SNPrs2293870，rsl1200638，rs10490924的基因型8圖3是Snapshot方法檢測(cè)Jrsl1200630(T/C)，ENSSNP6019764(G/A)，rs3750847(C/T)，rs36212731(G/T)的基因分型圖圖4是Snapshot方法檢測(cè)rs2014307(G/T)，rs3750846(T/C)，rs36212732(A/G)，rs58077526(A/C)的基因分型圖圖5是Snapshot方法檢測(cè)rs3763764(A/G)，rs36212733(C/T)，rs3793917(C/G)，rs3750848(T/G)，rs2672593(A/G)的基因分型圖圖6為RT-PCR檢測(cè)缺失/插入變異對(duì)HTRAlmRNA豐度的影響；圖7為RT-PCR檢測(cè)缺失/插入變異對(duì)LOC387715mRNA豐度的影響；圖8為Western檢測(cè)缺失/插入變異對(duì)LOC387715蛋白表達(dá)的影響；圖9為熒光免疫化學(xué)檢測(cè)AMD患者視網(wǎng)膜色素上皮的HTRA1蛋白表達(dá)。發(fā)明的具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所用試劑，除非特別說(shuō)明，均為市售購(gòu)買(mǎi)。實(shí)施例1血樣收集及標(biāo)本處理選取214例中國(guó)人老年性黃斑變性(AMD)患者以及214例對(duì)照者?；颊邽榕R床確診的AMD，其中115例濕性AMD患者，99例干性AMD患者，對(duì)照是符合AMD患者年齡段的大于或等于60歲、非玻璃疣和視網(wǎng)膜色素改變的人群。對(duì)所有參加者詳細(xì)調(diào)査其病史以及家族史，并對(duì)其進(jìn)行體格檢查和詳細(xì)的眼科專(zhuān)科檢查。在簽署知情同意書(shū)以后每人采集EDTA抗凝血樣510ml。酚—氯仿法提取基因組DNA。實(shí)施例2包含HTRA1基因上游4340堿基處缺失/插入變異基因的PCR擴(kuò)增和基因型分析(一)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離鑒定1、抽取受檢者血液，提取DNA;2、以5,畫(huà)GCCAACTGGAGCTTCTCATC-3,和5，-GTAGTTTCCAGGGGCTCTCC-3，為上下游引物，PCR擴(kuò)增基因組DNA;反應(yīng)條件95°C3minutes,(94°C30seconds,57°C30seconds,72°C45seconds)*35cycles3、1%瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小判別缺失/插入變異。瓊脂糖電泳鑒定含HTRAl基因上游4340bp的缺失/插入序列的PCR產(chǎn)物釆用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，缺失/插入使得PCR產(chǎn)物正常片段小約400bp，通過(guò)電泳分離即可判讀基因型。無(wú)缺失/插入的PCR產(chǎn)物大小約1000bp，純合缺失/插入的PCR片段大小約600bp，雜合缺失/插入的PCR產(chǎn)物包括上述兩條條帶(見(jiàn)圖1)。(二)核苷酸序列測(cè)定1、抽取受檢者血液，提取DNA;2、以5，-GCCAACTGGAGCTTCTCATC-3，禾口5，-GTAGTTTCCAGGGGCTCTCC-3，為上下游引物，PCR擴(kuò)增基因組DNA;反應(yīng)條件95。C3minutes,(94°C30seconds,57°C30seconds,72。C45seconds)*35cycks3、膠回收純化PCR產(chǎn)物；4、測(cè)序反應(yīng)；5、變性為單鏈；6、ABI3100上機(jī)讀取核苷酸序列。(三)其他方法1、基于等位基因特異性寡核苷酸雜交反應(yīng)原理的芯片檢測(cè)流程DNA抽提-----DNA消化---加接頭--擴(kuò)增---產(chǎn)物片段化——生物素標(biāo)記----芯片雜交…洗滌—--染色-—-掃描----數(shù)據(jù)分析2、Tagman方法流程序列比對(duì)—--引物設(shè)計(jì)----引物合成-—DNA抽提和定量—PCR_—探針雜交掃描分析核苷酸測(cè)序結(jié)果如下(1)443bp缺失/54bp插入變異序列，陰影部分即443bp缺失后插入的54bp從a妙欣此妙fcg"妙agc/gg妙aafc故c加flccc"gflga妙"gcccaac"c紅toacafc/欲TTATTAATTAATTAABaatgggtgagtagggatggattacaccaccctgga(54bp)(2)無(wú)缺失的正常序列，陰影部分為序列(1)中缺失的443bp，其中下劃線(xiàn)部分為功能編碼序列10:7rrc(:cSggv3to欲cfltoflctoa"fl/to(2ato(3flaa"c^gafc(3fcc雄cacttgctgcatttcaaatgcttggcagtcacatgtagttegtggctoccctcttggac3gCEic卿teg卿ttotttcc3tc3ctgc卿犯sittct卿ctttgeigc加tgaggacaggggcttgatcattcgacactgctttacagtgtctagcagtgtctaccctgtggcaggggctcaggaaattttcctgaaccgaacctaactgaactgatgtgggtttgtcatcagggtgtacctgctgttaaaggaggttacgacctctgatgctggggtggccagaggggatgggagtgggtctggcactctgaggaaaggGGGTGAAACCAGCTGAGAAGtcatcttttacctgctggcatggccccagccagggttctgttgctatgggag,___JAATGGGTGAGTAGGGATGGATTACACCACCCTGGA(443bp)結(jié)論HTRA1基因上游4340堿基處443bp缺失/54bp插入變異在AMD病人和對(duì)照組之間存在顯著差異，缺失基因型的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于插入基因?qū)嵤├?包含rs2293870、rsl1200638、rsl0490924單核苷酸多態(tài)性DNA片段的PCR擴(kuò)增和基因型分析1、提取AMD患者和對(duì)照組的血液基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增基因組包含目的序列(rs2293870、rsl1200638、rsl0490924)的基因組DNA片段引物序列，-GGCCGCTCGGCGCCTTTGGC-3'5,-CCCCGAAGGGCACCACGCAC-3'5，-ATGCCACCCACAACAACTTT-3';，-CGCGTCCTTCAAACTAATGG畫(huà)3'5,畫(huà)TACCCAGGACCGATGGTAAC-3，；;，-GAGGAAGGCTGAATTGCCTA-3'rs2293870:正向反向rsl1200638:正向反向rs10490924:正向反向反應(yīng)條件rs2293870:95。C3minutes，seconds)*35cyclesrsl1200638:95°C3minutes,seconds)*35cyclesrsl0490924:95°C3minutes,seconds)*35cycles3、樣本的基因型分析(94°C30seconds,57°G30seconds,72。G45(94°C30seconds,52°C30seconds,72°C45(94°C30seconds,55°C30seconds,72°C45(一)單堿基引物延伸法基因分型(Snapshot)純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物總體積Exol酶SAPbufferddH20SAP、Total122.9ul0.1u10.1ul0.8u12ul注:PCR產(chǎn)物總體積9u1視PCR反應(yīng)數(shù)量而定，N對(duì)引物的PCR，則每對(duì)物獲得的產(chǎn)物加樣為9lU/N。反應(yīng)條件37°Clhour;75°C15min單堿基引物延伸反應(yīng)體系純化產(chǎn)物SNaPshotMultiplexSNaPshotprimerDdH204.反應(yīng)條件:1U1ly10.2XN補(bǔ)足5"196°Clmin96°C10sec50°C5sec60°C30secTotal5U乂25個(gè)循環(huán)純化反應(yīng)物反應(yīng)體系0.7SAP/well反應(yīng)條件37°Clhour;75°C變性反應(yīng)體系純化產(chǎn)物15minHD9ulTotalion1反應(yīng)條件95°C5min;迅速冰浴冷卻5.ABI3100上機(jī)讀取基因型結(jié)果(二)核苷酸序列測(cè)定1、膠回收(1)將放有膠回收的管中加入BindingBuffer30ulfangru55。C孵育7min(完全溶化)(待(2)膠溶化后，取出柱管，作好標(biāo)記，把液體轉(zhuǎn)入柱管中，10000rpm/lmin離心，完畢后倒掉上清液，再加入700ulSpw，靜置23min，10000rpm/lmin離心，倒掉上清液。(3)重復(fù)上述2操作一次。(4)倒掉上清液后，把柱管1000rpm/lmin空轉(zhuǎn)。(5)加入15ulElutionBuffer到柱中央，靜置23min，10000rpm/lmin離心。(6)重復(fù)上述操作(7)把洗脫下來(lái)的液體輕轉(zhuǎn)至干凈管中，作好標(biāo)記，置于冰箱中。2、測(cè)序前擴(kuò)增反應(yīng)體系DNA5XBufferPrimer(0.2pm)SeqddH20反應(yīng)條件lul1Ul0.5ul0.5ul2ul、Total5ul」96°C96°C50°C60°Clmin15sec10sec斗S6C29個(gè)循環(huán)3、12ul12ul4、盡第二步純化NaAcEDTA混勻后lul/well，25ul無(wú)水乙醇/wel避光保存15min，4100rpm/30min離心。吸干上清液，70。/。乙醇40ul/wdl,4100rpm/10min離心.。吸干上清液，室溫避光保存15min。加入9ul/wdl，避光放置lhour。(三)限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定基因型(1)含rsl1200638的PCR產(chǎn)物采用EagI酶切鑒定G等位基因，含rsl0490924的PCR產(chǎn)物采用PVUII酶切鑒定G等位基因。采用NEB的限制性?xún)?nèi)切酶EagI(5'...CAGGCCG...3')，反應(yīng)體系如下3.9ulH20+5ulPCR產(chǎn)物+lulbuffer3十0.1ulEagl;反應(yīng)條件如下37°C12hour。采用NEB的限制性?xún)?nèi)切酶PVUII(5'...CAGACTG...3')，反應(yīng)體系如下3.9ulH20+5ulPCR產(chǎn)物+lulbuffer2+0.1ulPVUII;反應(yīng)條件如下3713200910127479.4°C12hour。(2)2%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶判讀基因型。圖2為Snapshot檢測(cè)SNPrs2293870、rsl1200638、rsl0490924(的基因型圖(藍(lán)色峰為G，綠色峰為A，紅色峰為T(mén))。rs2293870:TT純合子為紅色單峰；TG雜合子為紅色和藍(lán)色雙峰(如圖示)；GG純合子為藍(lán)色單峰.。rsll200638:AA純合子為綠色單峰；AG雜合子為藍(lán)色和綠色雙峰(如圖示)；GG純合子為藍(lán)色單峰。rsl0490924:TT為紅色單峰；TG雜合子為紅色和藍(lán)色雙峰(如圖示)；GG純合子為藍(lán)色單峰。純合的風(fēng)險(xiǎn)基因型患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于正常基因型，雜合基因型患病風(fēng)險(xiǎn)介于二者之間。(四)其他方法1、基于等位基因特異性寡核苷酸雜交反應(yīng)原理的芯片檢測(cè)流程DNA抽提一--DNA消化--加接頭---擴(kuò)增---產(chǎn)物片段化--生物素標(biāo)記-—芯片雜交--洗滌----染色--掃描---數(shù)據(jù)分析2、Tagman方法流程序列比對(duì)---引物設(shè)計(jì)----引物合成--DNA抽提和定量—PCR_—探針雜交——掃描——分析3、變性高效液相色譜(DenatureHPLC)實(shí)施例4與LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入變異連鎖的一組單核甘酸多態(tài)性的PCR擴(kuò)增和基因型分析，包含rsl1200630，rs36212731，rs3763764等13個(gè)SNP。1、提取AMD患者和對(duì)照組的血液基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增基因組包含目的序列的基因組DNA片段引物序列見(jiàn)下表，反應(yīng)條件95°C3minutes,(94°C30seconds,5257°C30seconds,72。C45seconds)*35cycles3、樣本的基因型分析(一)單堿基引物延伸法基因分型(Snapshot)1.純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物總體積Exol酶SAPbufferddH20SAPTotal12注:PCR產(chǎn)物總體積9u1視PCR反應(yīng)數(shù)量而定,N對(duì)引物的PCR,則每對(duì)引物獲得的產(chǎn)物加樣為9P1/N。反應(yīng)條件37°Clhour;75°C15min2.單堿基引物延伸反應(yīng)體系(SNaPshot引物見(jiàn)下表)純化產(chǎn)物1lU，SNaPshotMultiplex1u1Total5u1SNaPshotprimer0.2XNSDdH20補(bǔ)足5u1反應(yīng)條件96°Clmin4.乂96。C10sec，50°C5sec"25個(gè)循環(huán)60°C30sec丄純化反應(yīng)物反應(yīng)體系0.7lUSAP/well反應(yīng)條件37°Clhour;75°C15min變性反應(yīng)體系純化產(chǎn)物1U1HD9ulTotal10u反應(yīng)條件95°C5min;迅速冰浴冷卻5.ABI3100上機(jī)讀取基因型結(jié)果(見(jiàn)圖2、3、4、5)(二)核苷酸序列測(cè)定;、膠回收(8)將放有膠回收的管中加入BindingBuffer30ulfangru55。C孵育7min。(待完全溶化)(9)膠溶化后，取出柱管，作好標(biāo)記，把液體轉(zhuǎn)入柱管中，10000rpm/lmin離心，完畢后倒掉上清液，再加入700ulSpw，靜置23min，10000rpm/lmin離心，倒掉上清液。(10)重復(fù)上述2操作一次。(11)倒掉上清液后，把柱管1000rpm/lmin空轉(zhuǎn)。(12)加入15ulElutionBuffer到柱中央，靜置23min，10000rpm/lmin離心。(13)重復(fù)上述操作(14)把洗脫下來(lái)的液體輕轉(zhuǎn)至干凈管中，作好標(biāo)記，置于冰箱中。6、7、8、盡-測(cè)序前擴(kuò)增反應(yīng)體系DNA5XBufferPrimer(0.2pm)SeqddH20反應(yīng)條件lul1ul0.5ul0.5ul2ul、Total5ul96°C96°C50°C60°Clmin15sec10sec■4S6C一29個(gè)循環(huán)第二步純化.-NaAc12ulEDTA12ul上機(jī)測(cè)序混勻后lul/well，25ul無(wú)水乙醇/wel避光保存15min，4100rpm/30min離心。:吸干上清液，70。/。乙醇40ul/well,4100rpm/10min離心.。吸干上清液,室溫避光保存15min。加入9ul/we11，避光放置lhoun16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>圖3、圖4、圖5分別為Snapshot檢測(cè)SNPrsll200630(包含T—C變異)、ENSSNP6019764(包含G—A變異)、rs36212731(包含G—T變異)、rs36212732(包含A—G變異)、rs36212733(包含T—C變異)、rs3750848(包含T—G變異)、rs3750847(包含C—T變異)、rs3750846(包含T—C變異)、rs2014307(包含G—T變異)、rs3793917(包含C—G變異)、rs3763764(包含A—G變異)、rs58077526(包含A—C變異)以及rs2672593(包含A—G變異)的基因型圖。該檢查結(jié)果為雜合子基因型的個(gè)體，其包含一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因，分別是C、A、T、G、C、G、T、C、T、G、G、C、G;純合的風(fēng)險(xiǎn)基因型患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于正?；蛐停s合基因型患病風(fēng)險(xiǎn)介于二者之間。實(shí)施例5LOC387715/HTRA1間，HTRAl基因上游4340堿基處缺失/插入變異與AMD的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)分析等位基因相關(guān)性，同時(shí)計(jì)算優(yōu)勢(shì)比和95%可信區(qū)間，評(píng)價(jià)純合子和雜合子的患病風(fēng)險(xiǎn)度。表型基因型頻數(shù)風(fēng)險(xiǎn)等位基因頻率P值等位基因ORbom型P值(95%C^ORhet俯乂/凝為濕性(104)DD55ID:4411:574.04%9.70e-125.95e-1217,6(6.422-48.236)4.285(1.611-11.401)干性(99)DD:29ID:6211:860.61%2.05e-42.81e-45.8(2.383-4.115)3.774(1.691-8.421)正常對(duì)照(206)DD:35ID:11511:56)44.90%結(jié)果表明，缺失基因型和等位基因型分布在病人和對(duì)照組間存在顯著差異，缺失型的AMD患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于無(wú)缺失的正?；蛐汀?shí)施例6HTRA1基因1號(hào)外顯子上SNPrs2293870變異AMD的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)分析等位基因相關(guān)性，同時(shí)計(jì)算優(yōu)勢(shì)比和95%可信區(qū)間，評(píng)價(jià)純合子和雜合子的患病風(fēng)險(xiǎn)度。表型基因型頻數(shù)風(fēng)險(xiǎn)等位基因頻率基因型P值等位基ORhorn因型P值(95%CI)ORhet(95%CI)77G濕性(113)TT:66TG:43GG:4)77.4%1.24e-179了e-1了31900y.'e"(10.605-95.957)4.909(1.683-14.321)干性(83)TT:19TG:54GG:1055.4%0.0〗10.00916.047(7.280-35.371)2.466(1.173-5.183)正常對(duì)昭(215)TT:30TG:127GG:5843.5%結(jié)果表明，HTRA1基因1號(hào)外顯子上SNPrs2293870G—T變異與AMD高度相關(guān)，T風(fēng)險(xiǎn)等位基因攜帶者的AMD患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于正常基因型。實(shí)施例7定量RT-PCR檢測(cè)人胎盤(pán)組織中HTRA1和LOC387715基因的mRNA豐度采用實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(Opticon;MJResearch,Watertown,MA)反映HTRA1在插入/缺失不同基因型個(gè)體組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。1、采用RNeasy試劑盒(Qiagen)提取不同基因型個(gè)體胎盤(pán)組織的總RNA(D/D，D/I，1/I三種基因型各7例)。2、使用QuantiTectSYBRGreenRT-PCRkit(Qiagen)RT-PCR一步法擴(kuò)增HTRA1禾QLOC387715mRNA，18HTRA1弓l物正向5'畫(huà)AGCCAAAATCAAGGATGTGG-3，；反向5，-GATGGCGACCACGAACTC-3，。LOC387715引物正向CGGACTCATCACGTCATC反向GAGGGAATGCAGTGACAGRNA用量100ng。采用0—400ng總RNA，平行擴(kuò)增看家基因GAPDH得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。弓l物正向5，隱CTGCACCACCAACTGCTTAG-3，；反向5，-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。3、計(jì)算缺失/插入基因型相對(duì)于非缺失/插入基因型的HTRA1RNA豐度結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)等位基因攜帶者的HTRA1和LOC387715的mRNA豐度存在顯著差異，前者在風(fēng)險(xiǎn)等位基因攜帶者中表達(dá)上調(diào)，后者則在風(fēng)險(xiǎn)等位基因攜帶者中表達(dá)下調(diào)。結(jié)果如圖6，7。實(shí)施例8Western檢測(cè)LOC387715在胎盤(pán)組織的表達(dá)提取四位缺失變異基因型的濕性AMD患者和六位正常無(wú)缺失基因型對(duì)照的胎盤(pán)組織總蛋白，取25嗎進(jìn)行SDS-PAGE電泳，抗體濃度1.5嗎/ml進(jìn)行Westernblotting。HTRA1蛋白表達(dá)水平以卩-actin為內(nèi)參。采用SPSSversion13.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，計(jì)算其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如圖8，結(jié)果表明，缺失基因型的LOC387715蛋白表達(dá)比正?；蛐偷牡鞍罪@著下調(diào)。實(shí)施例9免疫組化檢測(cè)HTRA1在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的表達(dá)AMD患者眼球多聚甲醛固定，含0.3。/。H202的甲醇滅活內(nèi)源性過(guò)氧物酶活性。HTRA1多抗(由中國(guó)軍事科學(xué)院制備提供的羊抗人多克隆抗體)濃度5嗎/ml。采用VectorStainEliteABCkit試劑盒，采用NikonEclipse80i顯微鏡采集信號(hào)。圖9為熒光免疫化學(xué)結(jié)果，紫紅色為RPE自發(fā)熒光，綠色為HTRA1蛋白表達(dá)。分布于RPE和玻璃膜疣中。結(jié)果表明攜帶D/D風(fēng)險(xiǎn)基因型患者的病變部位HTRA1蛋白表達(dá)上調(diào)。實(shí)施例10試劑盒本試劑盒用于1、AMD患者的早期診斷和分型參考；2、AMD易感人群的基因檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。說(shuō)明本試劑盒的試劑可以由下述第一組至第五組試劑任意一組試劑組成，我們優(yōu)選的試劑由至少第一組試劑組成，或者由第一組試劑與第二組試劑組成，或者由第一組、第二組和第三組試劑組成，或者由上述試劑與第四組或第五組試劑任意組合而成。試劑盒的特異性隨試劑組的增加而提高，但是考慮到靈敏度和使用操作方便，適當(dāng)選擇試劑的多4[試劑]試齊1J盒清單(可進(jìn)行50份測(cè)定)試劑主要成分l組(-4340bp-HTRAl缺失/插入)PCR反應(yīng)混合液D450ul(l瓶)450ulControl腿-D125ul(l瓶.)純和無(wú)缺失PCR片段大小約1000bpControl腿-D225ul(l瓶)雜合缺失/插入變異的PCR片段包括約600bp和1000bp的兩個(gè)條帶ControlDNA-D325ul(l瓶)純和缺失PCR片段大小約600bp2組A:rs2293870-HTRA1B:rs11200638-HTRA1C:rsl0490924PCR反應(yīng)混合液A,B，C450ul(l瓶)特異性引物，PCR反應(yīng)混液SNaPshotMultiplexKit50ul(l瓶)熒光標(biāo)記dNTP，SNaPshot引物，反應(yīng)液SNaPshotPurifyKit50ul(2瓶)核酸外切酶，堿性磷酸酶Control腿-Al25ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-A225ul(l瓶)T/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-A325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Bl25ul(l瓶)A/A基因型的對(duì)照DNAControlDNA-B225ul(l瓶)A/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-B325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Cl25ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-C225ul(l瓶)T/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-C325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNA3組E:rsl1200630F:ENSSNP6019764G:rs3750847H:rs36212731PCR反應(yīng)混合液E，F(xiàn)，G，H450ul(l瓶)特異性引物，PCR反應(yīng)混液SNaPshotMultiplexKit50ul(l瓶)熒光標(biāo)記dNTP,SNaPshot引物，反應(yīng)液SNaPshotPurifyKit50ul(2瓶)核酸外切酶，堿性磷酸酶ControlDNA-El25ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-E225ul(l瓶)T/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA-E325ul(l瓶)C/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Fl25ul(l瓶)A/A基因型的對(duì)照DNAControlDNA-F225ul(l瓶)A/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-F325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Gl25ul(l瓶)C/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA-G225ul(l瓶)C/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-G325ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Hl25ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-H225ul(l瓶)G/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-H325ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNA204組I:rs2014307J:rs3750846K:rs36212732L:rs58077526PCR反應(yīng)混合液I,J,K，L450ul(l瓶)特異性引物，PCR反應(yīng)混液SNaPshotMultiplexKit50ul(l瓶)熒光標(biāo)記dNTP，SNaPshot引物，反應(yīng)液SNaPshotPurifyKit50ul(2瓶)核酸外切酶，堿性磷酸酶ControlDNA-I125ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-I225ul(l瓶)G/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-1325ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Jl25ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-J225ul(l瓶)T/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA-J325ul(l瓶)C/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA-K125ul(l瓶)A/A基因型的對(duì)照DNAControlDNA-K225ul(l瓶)A/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-K325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Ll25ul(l瓶)A/A基因型的對(duì)照DNAControlDNA-L225ul(l瓶)A/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA-L325ul(l瓶)C/C基因型的對(duì)照DNA5組M:rs3763764N:rs362127330:rs3793917P:rs3750848Q:rs2672593PCR反應(yīng)混合液M，N，0,P，Q450ul(l瓶)特異性引物，PCR反應(yīng)混液SNaPshotMultiplexKit50ul(l瓶)熒光標(biāo)記dNTP，SNaPshot引物，反應(yīng)液SNaPshotPurifyKit50ul(2瓶)核酸外切酶，堿性磷酸酶ControlDNA-Ml25ul(l瓶)A/A基因型的對(duì)照DNAControlDNA-M225ul(l瓶)A/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-M325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Nl25ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControlDNA-N225ul(l瓶)T/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA—N325ul(l瓶)C/C基因型的對(duì)照DNAControl醒-Ol25ul(l瓶)C/C基因型的對(duì)照DNAControlDNA-0225ul(l瓶)C/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-0325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Pl25ul(l瓶)T/T基因型的對(duì)照DNAControl賺-P225ul(l瓶)T/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-P325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Ql25ul(l瓶)A/A基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Q225ul(l瓶)A/G基因型的對(duì)照DNAControlDNA-Q325ul(l瓶)G/G基因型的對(duì)照DNA21[操作步驟]2,3，4,5組的PCR擴(kuò)增和基因型分析:l取樣取患者全血(EDTA抗凝)lml，提取認(rèn)D患者的血液基因組DNA。2.PCR操作:基因組DNAlul+9ulPCR混合液反應(yīng)條件1、95。C預(yù)變性5minutes2、95。C變性30seconds3、55'C退火30seconds4、72。C延伸45seconds5、步驟24共35個(gè)循環(huán)6、4'C保存3、PCR產(chǎn)物純化反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物總體積l一9u1SNaPshotPurifyKit3ulddH20補(bǔ)足總體積12u1注PCR產(chǎn)物總體積視PCR產(chǎn)物濃度決定用量。反應(yīng)條件1、37'C酶切1hour2、75。C滅活15minutes3、4'C保存4、單堿基引物延伸反應(yīng)體系純化產(chǎn)物1-2u1SNaPshotMultiplex2u1DdH20補(bǔ)足5li1反應(yīng)條件:1、96°C1minutes2、96°C10seconds3、50°C5seconds4、60°C30seconds5、步驟24共25個(gè)循環(huán)6、4'C保存5、純化反應(yīng)物反應(yīng)體系0.7HiSAP/well反應(yīng)條件37°Clhour;75°C15min6、ABI遺傳分析儀讀取結(jié)果反應(yīng)體系純化產(chǎn)物1u1+HD9u1反應(yīng)條件95°C5min;迅速冰浴冷卻。ABI3100上機(jī)讀取基因型結(jié)果[結(jié)果判定]L0C387715/HTRA1基因間的缺失/插入變異PCR擴(kuò)增和基因型分析:[操作步驟]1、取樣取患者全血(EDTA抗凝)lml，提取AMD患者的血液基因組DNA。2、PCR操作基因組DNAlul+9ulPCR混合液反應(yīng)條件1、95'C預(yù)變性5minutes2、95。C變性30seconds3、55。C退火30seconds4、72。C延伸45seconds5、步驟24共35個(gè)循環(huán)6、4'C保存3、1%瓊脂糖凝膠電泳分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，泳道A、B:無(wú)缺失PCR擴(kuò)增片段(大小約1000bp)泳道C:雜合缺失/插入變異的PCR片段包括約600bp和1000bp的兩個(gè)條帶泳道D:純合缺失/插入變異的PCR擴(kuò)增片段(大小約600bp)老年黃斑.ST25SEQUENCELISTING<110>四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(四川省人民醫(yī)院)〈120>檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒<130>CD537-09P106325〈160〉4<170〉Patentlnversion3.2<210〉1<211〉343<212>艦<213>HTRAl基因上游4340堿基處443bp缺失/54bp插入變異序列〈400〉1gagggagtccctcacaacctagactggtccccttccctccagctgcctcaactgtccaca60ggactctcttccceicctgcggccacactgtgcaacctggaatttccccacctgggcggac120tcatcacgtcggatgcatcttctgctctgtgcagctggtgaaatctttct180caacccttgagatgcagcccaatcttctcctaacatctggattcctctctgtcactgcat240tccctcctgtcatcctgcctttgtutcttgccctcctttctctcccggttattaattaa300tt犯ct幼aat3gtt犯tttaattaactaaact343<210〉2<211>732<212>DNA<213>HTRA1基因上游4340堿基處無(wú)缺失的正常序列<400>2g鄉(xiāng)gagtccctcacaacct3g3CtggtCCccttccctccagctgcctcaactgtccaca60ggactctcttcccacctgcggccacactgtgc犯cctggaatttccccacctgggcggac120tcatxacgtcatcaccaattggeitgc^itcttctgctctgtgcagctggtgaaatctttct180caacccttgagettgcagcccaatcttctcctaacatctggattcctctctgtcactgcat240tccctcctgtcatcctgcctUgtmcttgccctcctttctctcccgggtgataggcst300taacta犯atttcagatcatccttgcacttgctgcatttcaaatgcttgg360cagtcacatgteigmgtggctaccctcttgatagagattatttccatca420ctgcagaaaattctagactttgagcttcttg鄉(xiāng)acaggggcttgatxattcgacactgc480ttt3C3gtgtctaccctgtggcaggggctcagg3幼tttttcctgaaccg540站cctaactgaactgstgtgggtttgtcatcagggtgtacctgctgttaa600gacctctgatgctggggtggcc卿ggggatgggagtgggtctggcactctgaggaaagg660gggtgaaaccagctg卿agtcatcttttacctgctggcatggccccagccagggUctg720ttgctatggg紹732<2iO>3<2il〉54<212>瞧<213>HTRAl基因上游4340堿基處443bp缺失后插入的54bp働>3ttagttaatttaattaacta54<210>4<211>44324<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>權(quán)利要求1、用于檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，包括任選的用于檢測(cè)LOC387715基因與HTRA1基因間缺失/插入(Deletion/Insertion，D/I)變異的用于AMD篩選診斷的相關(guān)試劑。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括任選的用于檢測(cè)HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)rs2293870變異用于AMD篩選診斷的相關(guān)試劑。3、權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入(D/I)以及HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)rs2293870的G—T變異的試劑；以及任選的用于擴(kuò)增包含LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入(D/I)變異以及HTRAl基因rs2293870基因片段的試劑。4、權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入(D/I)變異以及HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)rs2293870的G—T變異的試劑為測(cè)序用試劑。5、權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入(D/I)變異以及HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)rs2293870的G—T變異的試劑為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法用試劑。6、權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)LOC387715基因與HTRAl基因間缺失/插入(D/I)變異以及HTRAl基因1號(hào)外顯子內(nèi)rs2293870的G—T變異的試劑為Snapshot試劑。7、權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于進(jìn)一步包括檢測(cè)HTRAl基因rsl1200638變異的試劑，和/或任選的用于檢測(cè)10q26上rsl0490924變異的試劑。8、權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于進(jìn)一步包括檢測(cè)LOC387715基因與HTRA1基因之間的一組SNP:rs11200630、ENSSNP6019764、rs36212731、rs36212732、rs36212733、rs3750848、rs3750847、rs3750846、rs2014307、rs3793917、rs3763764、rs58077526和/或rs2672593變異的試劑。9、用于檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，包括任選的檢測(cè)HTRAl和LOC387715蛋白表達(dá)用于AMD篩選診斷的試劑。10、權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測(cè)HTRAl和LOC387715蛋白表達(dá)的試劑包括HTRAl和LOC387715蛋白的抗體；以及任選的檢測(cè)蛋白表達(dá)量的試劑。11、用于檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，包括任選的檢測(cè)HTRAl和LOC387715的mRNA用于AMD篩選診斷的試劑。12、權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)HTRAl和LOC387715mRNA的試劑為定量RT-PCR試劑。全文摘要本發(fā)明提供了檢測(cè)老年黃斑變性疾病的試劑盒，可用于早期監(jiān)控和檢測(cè)AMD高危人群，實(shí)施早期預(yù)防和治療，減少其視力損害。本發(fā)明試劑盒以L(fǎng)OC387715基因與HTRA1基因間缺失/插入變異(位于HTRA1基因上游4340堿基處，包含LOC387715基因的部分3′UTR區(qū)域的443堿基序列缺失、54堿基序列插入的變異)，以及HTRA1基因1號(hào)外顯子G→T突變，及其相關(guān)連鎖位點(diǎn)/基因?yàn)槟繕?biāo)，與AMD的關(guān)聯(lián)度高，協(xié)同HTRA1基因啟動(dòng)子區(qū)域的G→A變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrs11200638)、HTRA1基因上游序列的G→T變異(單核苷酸多態(tài)性SNPrs10490924)的分析，更可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。文檔編號(hào)G01N33/573GK101550451SQ200910127479公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日發(fā)明者康張,楊正林,嬰林,芳魯申請(qǐng)人:四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(四川省人民醫(yī)院)