專利名稱：一種過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫分析檢測試劑盒，尤其涉及一種過敏原特異性IgE抗體免疫分析 檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
過敏反應檢測是進行過敏反應治療的重要的先決條件，可通過檢測患者血清中的 特異性IgE抗體以確定究竟是何種過敏原對患者致敏以及致敏程度。 多年來，檢測血清中特異性IgE抗體普遍采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法。相 應的ELISA檢測試劑盒包括已包被過敏原蛋白的酶標板、人IgE標準品、酶標記抗體和底物 顯色液。特異性IgE抗體在血清中的含量非常低，ELISA檢測試劑盒難以提供足夠高的靈 敏度，尤其是對少量或微量特異性IgE抗體的檢測結(jié)果準確性不高，且所耗費的時間較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于，提供一種靈敏度高、準確性高且反應快速、使用 方便的過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒及其制備方法。 為了解決上述技術問題，本發(fā)明的第一方面提供了一種過敏原特異性IgE抗體免 疫分析檢測試劑盒，包括與過敏原蛋白耦聯(lián)的磁性微珠、與抗人IgE抗體耦聯(lián)的磁性微 珠、人IgE抗體標準品、堿性磷酸酶標記的抗人IgE抗體和堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD。
該檢測試劑盒以磁性微珠為固相載體，相比以酶標板為固相載體可增加吸附和反 應的比表面積，官能團密度及選擇性吸附能力增大，利于抗原和抗體之間充分且快速的結(jié) 合，極大提高了檢測的靈敏度和準確性且縮短了達到吸附平衡狀態(tài)所需要的時間。另外，磁 性微珠可穩(wěn)定地懸浮在溶液中，提高免疫反應之間的結(jié)合效率。通過外加磁場磁性從反應 溶液中磁性分離耦聯(lián)有抗原抗體復合物的磁性微珠，提高了分離效率、速度以及分析方法 的靈敏度。優(yōu)選地，磁性微珠為超順磁性微珠。其內(nèi)部為12nm 15nm的超順磁性四氧化 三鐵。該超順磁性微珠在附加磁場時能具有較強的磁性以利于磁性分離，在去掉外磁場時 磁性很快消失，因此能夠在磁場中不被永久磁化，從而避免因聚集而產(chǎn)生的非特異性誤差。
該檢測試劑盒，進一步可包括不透光微孔板。不透光微孔板板體呈矩形，由不透光 材料制成，一面設置有若干微孔，各微孔間設有隔層。板體底面可為平整板面或不平整板 面，不平整板面涉及由若干圓弧底面構(gòu)成、由若干錐形底面構(gòu)成以及其他不規(guī)則底面構(gòu)成。 其中，微孔用于容納磁性微珠并為整個使用過程提供反應空間，隔層用于防止各微孔內(nèi)的 化學發(fā)光信號影響到周圍微孔內(nèi)化學發(fā)光信號的檢測，進而提高準確性。板狀結(jié)構(gòu)不僅適 用于人工半自動檢測，還適用于全自動儀器分析。該不透光微孔板不同于酶聯(lián)免疫吸附分 析(ELISA)中的酶標板，酶標板自身具有對蛋白的吸附能力，而在本發(fā)明中，不透光微孔板 僅作為一種反應容器，沒有且不能具有吸附蛋白的能力，否則會影響磁性微珠與反應物之 間的結(jié)合。不透光材料可為塑料、陶瓷和木材等，顏色不限。優(yōu)選地，該不透光微孔板為黑色塑料不透光微孔板。 該檢測試劑盒，進一步可包括板式磁性分離器。板式磁性分離器板體呈矩形板狀， 具有磁性，可為磁性微珠提供外加磁場。兩側(cè)邊各向板體的一面彎折成側(cè)壁，側(cè)壁內(nèi)側(cè)外端 垂直延伸出擋板，且側(cè)壁在一側(cè)頂端沿板體邊緣延伸出固定塊。側(cè)壁、擋板和固定塊均無磁 性。不透光微孔板的形狀和大小與板式磁性分離器相匹配，可從一側(cè)滑動地插入其中并固 定地容置在其中，并由側(cè)壁、擋板和固定塊進行固定，以利于方便地從反應溶液中磁性分離 出磁性微珠。 過敏原蛋白和磁性微珠以100iig 300iig過敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦 聯(lián)。過敏原蛋白在該濃度比例下相對磁性微珠是過量的，從而能保證單位重量的磁性微珠 完全被包被。優(yōu)選地，過敏原蛋白和磁性微珠以200ii g過敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦 聯(lián)。 過敏原蛋白可與血清中的特異性IgE抗體相結(jié)合。耦聯(lián)在磁性微珠上的過敏原蛋 白為吸入性過敏原蛋白或食入性過敏原蛋白，來源于以下材料螨類、蟑螂類、動物羽毛類、 動物毛皮類、霉菌類、花粉類、雜草類、植物纖維類、蠶絲、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、 水果類、蔬菜類、水產(chǎn)類、豆類、香料類和蠶蛹。此外，過敏原蛋白還可來源于蜂類、蝶類和蛾類等。 優(yōu)選地，吸入性過敏原蛋白包括屋塵螨過敏原蛋白、粉塵螨過敏原蛋白、腐食酪 螨過敏原蛋白、美洲大蠊過敏原蛋白、德國小蠊過敏原蛋白、東方蜚蠊過敏原蛋白、褐斑蟑 螂過敏原蛋白、雞羽毛過敏原蛋白、鴨羽毛過敏原蛋白、鵝羽毛過敏原蛋白、鴿羽毛過敏原 蛋白、貓毛皮過敏原蛋白、狗毛皮過敏原蛋白、馬毛皮過敏原蛋白、牛毛皮過敏原蛋白、羊毛 皮過敏原蛋白、豬毛皮過敏原蛋白、鼠毛皮過敏原蛋白、交鏈孢菌屬過敏原蛋白、葡萄孢菌 過敏原蛋白、多主枝孢屬過敏原蛋白、新月彎孢屬過敏原蛋白、串珠鐮孢屬過敏原蛋白、蠕 孢菌過敏原蛋白、煙曲霉過敏原蛋白、蜂毛霉屬過敏原蛋白、特異青霉過敏原蛋白、芽霉菌 屬過敏原蛋白、根霉菌屬過敏原蛋白、豚草花粉過敏原蛋白、楊樹花粉過敏原蛋白、柳樹花 粉過敏原蛋白、松樹花粉過敏原蛋白、桃樹花粉過敏原蛋白、茶樹花粉過敏原蛋白、樺樹花 粉過敏原蛋白、柏樹花粉過敏原蛋白、杉樹花粉過敏原蛋白、艾蒿花粉過敏原蛋白、萚草花 粉過敏原蛋白、紫菀過敏原蛋白、菊過敏原蛋白、大麗花過敏原蛋白、康乃馨過敏原蛋白、牡 丹過敏原蛋白、玫瑰過敏原蛋白、勿忘我過敏原蛋白、天鵝草過敏原蛋白、鴨茅過敏原蛋白、 黑麥草過敏原蛋白、梯牧草過敏原蛋白、龍須草過敏原蛋白、牛尾草過敏原蛋白、棉花纖維 過敏原蛋白、亞麻布纖維過敏原蛋白、爪哇棉纖維過敏原蛋白和桑蠶絲過敏原蛋白中的一 種或幾種。 優(yōu)選地，食入性過敏原蛋白包括牛奶過敏原蛋白、羊奶過敏原蛋白、雞蛋過敏原蛋 白、鴨蛋過敏原蛋白、鵝蛋過敏原蛋白、雞肉過敏原蛋白、鴨肉過敏原蛋白、豬肉過敏原蛋 白、羊肉過敏原蛋白、牛肉過敏原蛋白、火雞肉過敏原蛋白、鵝肉過敏原蛋白、驢肉過敏原蛋 白、玉米過敏原蛋白、蕎麥過敏原蛋白、大麥過敏原蛋白、燕麥過敏原蛋白、黑麥過敏原蛋 白、小麥過敏原蛋白、大米過敏原蛋白、小米過敏原蛋白、杏仁過敏原蛋白、花生過敏原蛋 白、芝麻過敏原蛋白、腰果過敏原蛋白、核桃過敏原蛋白、板 過敏原蛋白、蘋果過敏原蛋 白、香蕉過敏原蛋白、檸檬過敏原蛋白、芒果過敏原蛋白、荔枝過敏原蛋白、菠蘿過敏原蛋 白、橙子過敏原蛋白、葡萄過敏原蛋白、梨過敏原蛋白、西瓜過敏原蛋白、桃過敏原蛋白、柚子過敏原蛋白、芹菜過敏原蛋白、菠菜過敏原蛋白、洋蔥過敏原蛋白、大蒜過敏原蛋白、巻 心菜過敏原蛋白、茄子過敏原蛋白、西蘭花過敏原蛋白、馬鈴薯過敏原蛋白、蘑菇過敏原蛋 白、鯽魚過敏原蛋白、鳙魚過敏原蛋白、草魚過敏原蛋白、青魚過敏原蛋白、鰱魚過敏原蛋 白、基圍蝦過敏原蛋白、大閘蟹過敏原蛋白、龍蝦過敏原蛋白、帶魚過敏原蛋白、黃魚過敏原 蛋白、花蛤過敏原蛋白、田螺過敏原蛋白、比目魚過敏原蛋白、三文魚過敏原蛋白、鰻魚過敏 原蛋白、魷魚過敏原蛋白、黃豆過敏原蛋白、豌豆過敏原蛋白、蠶豆過敏原蛋白、扁豆過敏原 蛋白、眉豆過敏原蛋白、綠豆過敏原蛋白、紅豆過敏原蛋白、辣椒過敏原蛋白、胡椒過敏原蛋 白、八角過敏原蛋白和蠶蛹過敏原蛋白中的一種或幾種。 抗人IgE抗體和磁性微珠以10 40 ii g抗人IgE抗體/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)。 抗人IgE抗體在該濃度比例下相對磁性微珠是過量的，從而能保證單位重量的磁性微珠完 全被包被。優(yōu)選地，抗人IgE抗體和磁性微珠以20 ii g抗人IgE抗體/mg磁性微珠的比例 耦聯(lián)。耦聯(lián)在磁性微珠上的抗人IgE抗體可為鼠抗人IgE抗體、兔抗人IgE抗體或羊抗人 IgE抗體。 人IgE抗體標準品來源于人血清，經(jīng)親和色譜純化處理，可與抗人IgE抗體結(jié)合。
本發(fā)明提供的堿性磷酸酶(ALP)和堿性磷酸酶化學發(fā)光底物(AMPPD)組成的化學 發(fā)光免疫分析(CIA)系統(tǒng)，提高了檢測信號的靈敏度和穩(wěn)定性，同時減小背景干擾，從而克 服傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法檢測靈敏度相對較低的缺陷。其中，堿性磷酸酶化 學發(fā)光底物(AMPPD)為3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃 _鄰氧酰苯基)_1， 2-二 氧雜環(huán)丁烷。 該檢測試劑盒，進一步還可包括樣品稀釋液和樣品洗滌液。優(yōu)選地，樣品稀釋液為 含有1% BSA和0. 01% Proclin 300的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4。優(yōu)選地，樣品洗 滌液為含有1% BSA和0. 05% Tween 20的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4。
本發(fā)明提供的檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟 設置實驗組，取與過敏原蛋白耦聯(lián)的磁性微珠置于不透光微孔板的微孔中，加入 待測人血清樣品，室溫孵育以使過敏原蛋白與待測人血清樣品中的過敏原特異性IgE抗體 充分結(jié)合，磁性洗滌分離過量的過敏原蛋白； 同時設置對照組，取與抗人IgE抗體耦聯(lián)的磁性微珠置于不透光微孔板空白的微
孔中，在不同微孔中分別加入經(jīng)系列梯度稀釋的人IgE抗體標準品，室溫孵育以使抗人IgE
抗體與人IgE抗體標準品中的IgE抗體充分結(jié)合，之后進行磁性洗滌分離； 分別在實驗組和對照組中加入堿性磷酸酶(ALP)標記的抗人IgE抗體，待堿性磷
酸酶標記的抗人IgE抗體分別與實驗組和對照組中的IgE結(jié)合后，磁性分離洗滌，在微孔
板中加入堿性磷酸酶化學發(fā)光底物(AMPPD)，室溫反應，使用化學發(fā)光檢測儀讀取光信號強
度； 依據(jù)梯度稀釋后的各個濃度的人IgE抗體標準品的光信號強度，以化學發(fā)光強度 為縱坐標，人IgE抗體濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進而對比定量分析待測人血清樣品中 的過敏原特異性IgE抗體濃度。 本發(fā)明的第二方面提供了一種過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制 備方法，包括以下步驟將過敏原蛋白耦聯(lián)至磁性微珠上、將抗人IgE抗體耦聯(lián)至磁性微珠 上、制備人IgE抗體標準品、制備堿性磷酸酶標記的抗人IgE抗體、制備堿性磷酸酶化學發(fā)
5光底物AMPPD，以及組合包裝。 優(yōu)選地，磁性微珠為超順磁性微珠。其內(nèi)部為12nm 15nm的超順磁性四氧化三 鐵。 將過敏原蛋白耦聯(lián)至磁性微珠上包括制備過敏原蛋白提取液、活化磁性微珠、 將活化的磁性微珠與過敏原蛋白提取液混合反應。將過敏原蛋白和磁性微珠以100i!g 300 ii g過敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)。優(yōu)選地，過敏原蛋白和磁性微珠以200 ii g過 敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)。 將抗人IgE抗體耦聯(lián)至磁性微珠上包括制備抗人IgE抗體、活化磁性微珠、和將 活化的磁性微珠與抗人IgE抗體混合反應。將抗人IgE抗體和磁性微珠以10 40 ii g抗 人IgE抗體/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)。優(yōu)選地，抗人IgE抗體和磁性微珠以20 ii g抗人IgE 抗體/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)。耦聯(lián)在磁性微珠上的抗人IgE抗體可為鼠抗人IgE抗體、 兔抗人IgE抗體或羊抗人IgE抗體。 此外，該檢測試劑盒的制備方法還可包括以下步驟中的一步或幾步
不透光微孔板的制備；
板式磁性分離器的制備；以及
樣品稀釋液和樣品洗滌液的制備。 本發(fā)明的有益效果在于，提供了由磁性微珠化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)組成的過敏原 特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒及其制備方法，其靈敏度高、準確性高且反應快速、使 用方便，具有用量低，成本低的優(yōu)點。本發(fā)明用于對人血清樣品中的過敏原特異性IgE抗體 水平進行精確定量檢測分析，能幫助確定致敏過敏原，預測未來發(fā)生過敏反應的危險并指 導臨床過敏反應治療。


圖1為不透光微孔板一個實施例的剖面圖；
圖2為不透光微孔板另一個實施例的剖面圖
圖3為板式磁性分離器的立體結(jié)構(gòu)圖；以及
圖4為人I gE濃度標準曲線。
具體實施例方式
下面通過具體實施方法對本發(fā)明做進一步闡述，但并不意味著對本發(fā)明保護范圍 的限制。 實施例1 :粉塵螨過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒 粉塵螨過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒，包括(1)與粉塵螨過敏原蛋 白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以100i! g粉塵螨過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混 合；(2)與鼠抗人IgE抗體耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以10 ii g羊抗人IgE抗體/mg超順磁 性微珠的比例耦聯(lián)混合；(3)人IgE抗體標準品，來源于人血清，經(jīng)親和色譜純化后濃度為 100IU/mL(參照世界衛(wèi)生組織公布的人IgE國際參考標準)；(4)堿性磷酸酶標記的兔抗人 IgE抗體；以及(5)堿性磷酸酶化學發(fā)光底物3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃 -鄰 氧酰苯基)-1 ， 2- 二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)。
其中，超順磁性微珠內(nèi)部為12nm的超順磁性四氧化三鐵。
實施例2 :芒果過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒 芒果過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒，包括(1)與芒果過敏原蛋白耦 聯(lián)的磁性微珠，兩者以300i! g芒果過敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(2)與兔抗 人IgE抗體耦聯(lián)的磁性微珠，兩者以40ii g兔抗人IgE抗體/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)混合； (3)人IgE抗體標準品，來源于人血清，經(jīng)親和色譜純化后濃度為100IU/mL(參照世界衛(wèi)生 組織公布的人IgE國際參考標準)；(4)堿性磷酸酶標記的羊抗人IgE抗體；(5)堿性磷酸 酶化學發(fā)光底物3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃 -鄰氧酰苯基)_1，2-二氧雜環(huán) 丁烷(AMPPD);以及(6)黑色塑料不透光微孔板。 如圖1所示，黑色塑料不透光微孔板板體1呈矩形，由黑色不透光塑料制成，一面 設置有若干微孔，板體1底部為平整的板面，微孔21與微孔22之間設有隔層3。隔層3用 于防止微孔21內(nèi)的化學發(fā)光信號影響到周圍微孔22內(nèi)化學發(fā)光信號的檢測。微孔用于容 納磁性微珠并為整個使用過程提供反應空間。 實施例3 :蜜蜂過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒 蜜蜂過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒，包括(1)與蜜蜂過敏原蛋白耦 聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 i！ g蜜蜂過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(2) 與羊抗人IgE抗體耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以30 i！ g兔抗人IgE抗體/mg超順磁性微珠 的比例耦聯(lián)混合；(3)人IgE抗體標準品，來源于人血清，經(jīng)親和色譜純化后濃度為100IU/ mL(參照世界衛(wèi)生組織公布的人IgE國際參考標準)；(4)堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE抗 體；(5)堿性磷酸酶化學發(fā)光底物3-(2'-螺旋金剛烷)_4-甲氧基-4-(3〃 _鄰氧酰苯 基)-l，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD) ;(6)陶瓷不透光微孔板；以及(7)板式磁性分離器。
其中，超順磁性微珠內(nèi)部為15nm的超順磁性四氧化三鐵。 如圖2所示，陶瓷不透光微孔板板體11呈矩形， 一面設置有若干微孔，另一面由若 干微孔的孔底圓弧面構(gòu)成，微孔23與微孔24之間設有隔層31。隔層31用于防止微孔23 內(nèi)的化學發(fā)光信號影響到周圍微孔24內(nèi)化學發(fā)光信號的檢測。微孔用于容納磁性微珠并 為整個使用過程提供反應空間。 如圖3所示，板式磁性分離器板體4呈矩形片狀，具有磁性，可為磁性微珠提供外 加磁場。兩側(cè)邊各向板體的一面彎折成側(cè)壁5，側(cè)壁5內(nèi)側(cè)外端垂直延伸出擋板6，且側(cè)壁 在一側(cè)頂端沿板體邊緣延伸出固定塊7。側(cè)壁5、擋板6和固定塊7均無磁性，僅起固定作 用。不透光微孔板的形狀和大小與板式磁性分離器相匹配，可從一側(cè)滑動地插入其中并固 定地容置在其中，并由側(cè)壁5、擋板6和固定塊7進行固定，以利于從反應溶液中磁性分離出 磁性微珠。 實施例4 :金針菇過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒 金針菇過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒，包括(1)與金針菇過敏原蛋 白耦聯(lián)的磁性微珠，兩者以200ii g金針菇過敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(2) 與兔抗人IgE抗體耦聯(lián)的磁性微珠，兩者以20 ii g兔抗人IgE抗體/mg磁性微珠的比例耦聯(lián) 混合；(3)人IgE抗體標準品，來源于人血清，經(jīng)親和色譜純化后濃度為100IU/mL(參照世 界衛(wèi)生組織公布的人IgE國際參考標準)；(4)堿性磷酸酶標記的羊抗人IgE抗體；(5)堿性 磷酸酶化學發(fā)光底物3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃 -鄰氧酰苯基)_1，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD) ; (6)木質(zhì)不透光微孔板；(7)板式磁性分離器；(8)稀釋液，含有1 % BSA 和O. 01% Proclin 300的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4 ;以及(9)樣品洗滌液，含有1% BSA和0. 05% Tween 20的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4。 木質(zhì)不透光微孔板結(jié)構(gòu)同黑色塑料不透光微孔板。板式磁性分離器如前所述。
實施例5 :吸入組過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒
吸入性過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒，包括(1)與屋塵螨過敏原蛋 白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200i! g屋塵螨過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián) 混合；(2)與美洲大蠊過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 g美洲大蠊過敏原蛋 白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(3)與雞羽毛過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者 以200i！ g雞羽毛過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(4)與貓毛皮過敏原蛋白 耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200ii g貓毛皮過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混 合；(5)與交鏈孢菌屬過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 i！ g交鏈孢菌屬過敏原 蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(6)與豚草花粉過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠， 兩者以200 i！ g豚草花粉過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(7)與大麗花過敏 原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200yg大麗花過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例 耦聯(lián)混合；(8)與梯牧草過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200ii g梯牧草過敏原蛋 白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(9)與樺木過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以 200 i！ g樺木過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(10)與棉花纖維過敏原蛋白 耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 i！ g棉花纖維過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混 合；(11)與桑蠶絲過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 i！ g桑蠶絲過敏原蛋白/mg 超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(12)與羊抗人IgE抗體耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以20 g 羊抗人IgE抗體/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(13)人IgE抗體標準品，來源于人血 清，經(jīng)親和色譜純化后濃度為100IU/mL(參照世界衛(wèi)生組織公布的人IgE國際參考標準)； (14)堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE抗體；以及(15)堿性磷酸酶化學發(fā)光底物3-(2'-螺 旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-鄰氧酰苯基)_1，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)。
實施例6 :食入組過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒
食入組過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒，包括(1)與牛奶過敏原蛋白 耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 i！ g牛奶過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合； (2)與雞蛋過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200i! g雞蛋過敏原蛋白/mg超順磁性 微珠的比例耦聯(lián)混合；(3)與雞肉過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200iig雞肉過 敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(4)與小麥過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠， 兩者以200i! g小麥過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(5)與杏仁過敏原蛋白 耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200ii g杏仁過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合； (6)與荔枝過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 ii g荔枝過敏原蛋白/mg超順磁性 微珠的比例耦聯(lián)混合；(7)與芹菜過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 ii g芹菜過 敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(8)與基圍蝦過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微 珠，兩者以200ii g基圍蝦過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(9)與黃豆過敏 原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 ii g黃豆過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián) 混合；(10)與胡椒過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200i！ g胡椒過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(ll)與蠶蛹過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，兩者以200 g 蠶蛹過敏原蛋白/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(12)與羊抗人IgE抗體耦聯(lián)的超順磁 性微珠，兩者以20 g羊抗人IgE抗體/mg超順磁性微珠的比例耦聯(lián)混合；(13)人IgE抗體 標準品，來源于人血清，經(jīng)親和色譜純化后濃度為100IU/mL(參照世界衛(wèi)生組織公布的人 IgE國際參考標準)；(14)堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體；(15)堿性磷酸酶化學發(fā)光底 物3-(2'-螺旋金剛烷)_4-甲氧基-4-(3"-鄰氧酰苯基)_1，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD); 以及(16)黑色不透光微孔板；以及(17)板式磁性分離器。
黑色不透光微孔板和板式磁性分離器如前所述。 實施例7 :—種粉塵螨過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的使用方法
—種粉塵螨過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的使用方法包括如下步 驟 (1)制備樣品稀釋液，含有1% BSA和0. 01% Proclin 300的10mmol/L磷酸鹽緩 沖液，pH 7. 4。制備樣品洗滌液，含有1% BSA和0. 05% Tween 20的1Ommol/L磷酸鹽緩沖 液，pH 7. 4。 (2)設置實驗組，取與30 L粉塵螨過敏原蛋白耦聯(lián)的磁性微珠置于不透光微孔 板的12個微孔中。取10 L待測人血清樣品加入2個微孔中設為復孔，室溫孵育30分鐘 以使待測人血清樣品中的粉塵螨過敏原特異性IgE抗體與粉塵螨過敏原蛋白充分結(jié)合。磁 性分離洗滌去除過量的人血清樣品。 棋盤法選擇磁性微珠的用量。分別加磁性微珠0 ii L、5 ii L、10 ii L、20 ii L、30 ii L、 40 L、50 L和100 L，當磁性微珠的量超過30 y L時，并不能使發(fā)光信號增加，相反由于 磁性微珠對光的遮蔽作用使發(fā)光信號減弱，因此選取30 L為磁性微珠的用量。
測定不同體積的待測人血清樣品時發(fā)光強度。在取樣量為10 L時，發(fā)光信號與 血清中IgE抗體濃度有較好的線性關系。待測人血清樣品量過少會造成取樣困難，相對誤 差增大，并且在低濃度時可能檢測不到信號，影響到實驗的最低檢測限。待測人血清樣品量 的增加伴隨著反應試劑消耗量的增加，也可能使發(fā)光信號過強而達到飽和狀態(tài)或超出儀器 檢測范圍，并且還可能使非特異性吸附的量增加，增大反應的誤差。因此選取10 L為待測 人血清樣品的用量。 測定分別在粉塵螨過敏原磁性微珠與待測人血清樣品反應10分鐘、20分鐘、30分 鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘后檢測發(fā)光強度，檢測結(jié)果顯示30分鐘后結(jié)合反應趨于完 成，發(fā)光信號趨于穩(wěn)定，因此選擇30分鐘為粉塵螨過敏原磁性微珠與待測人血清樣品反應 的時間。 (3)設置對照組，取30 ii L與羊抗人IgE抗體耦聯(lián)的磁性微珠置于不透光微孔板 的空白微孔中，取濃度為100IU/mL的人IgE標準液加入樣品稀釋液，分別按l : 3、1 : 9、 1 : 27、1 : 81、1 : 243、l : 729和l : 2187梯度稀釋，依次取lOii L未稀釋的標準液以 及上述系列稀釋后的標準液稀釋液分別加入不同的微孔中，室溫孵育30分鐘以使人IgE與 羊抗人IgE抗體充分結(jié)合。磁性分離洗滌。 (4)分別在實驗組和對照組中加入20 ii L堿性磷酸酶(ALP)標記的兔抗人IgE抗 體，室溫反應20分鐘，待堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體分別與實驗組和對照組中的IgE 結(jié)合后，磁性分離洗滌，在微孔板中加入20 ii L堿性磷酸酶化學發(fā)光底物(AMPPD)，室溫反應30分鐘，使用化學發(fā)光檢測儀讀取光信號強度。 棋盤法測定抗人IgE抗體的加入量。分別加入0iiL、10iiL、20iiL、30iiL、40iiL 和50 L堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體，當堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體體積增 加到20 L后，再增加堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體，發(fā)光強度不再顯著增加，因此選 擇20 L作為堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體的加入量。 測定堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體與過敏原特異性IgE抗體分別反應10分 鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘后，結(jié)果顯示反應20分鐘后信號較為穩(wěn)定， 在60分鐘后隨著時間的延長，非特異性吸附隨著增加，信號也有一定的增加，因此選擇20 分鐘為堿性磷酸酶標記的兔抗人IgE抗體的反應時間。 測定加入AMPPD的量在1 20 ii L范圍內(nèi)，發(fā)光強度與AMPPD加入量近似于直線 關系，加入量大于20ii L時發(fā)光強度趨于平緩。因此，本發(fā)明中采用AMPPD的量為20ii L。
在確定的AMPPD濃度下，由發(fā)光底物反應時間_發(fā)光強度的曲線讀出隨著反應時 間的延長，發(fā)光信號增大，約經(jīng)過30分鐘達到平衡，產(chǎn)生較為穩(wěn)定的檢測信號，因此確定發(fā) 光底物AMPPD加入反應體系的最佳反應時間為30分鐘。 (5)依據(jù)梯度稀釋后的各個濃度的人IgE抗體標準品的光信號強度，以化學發(fā)光 強度為縱坐標，人IgE抗體濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進而對比定量分析待測人血清樣 品中過敏原特異性IgE抗體的濃度。 試驗數(shù)據(jù)如圖4顯示，人IgE抗體在0. 05IU/mL 100IU/mL范圍呈良好的線性關 系，其回歸方程為y = 6395. 8x+22602(n = 8)，相關系數(shù)為0. 9786。由此，對比定量分析， 計算得出待測人血清樣品中粉塵螨過敏原特異性IgE抗體的濃度為5IU/mL。對比國際分 級標準進行分級，該數(shù)據(jù)顯示該血清提供者對粉塵螨過敏原呈高度敏感，需要在醫(yī)生的指 導下進行臨床治療。本檢測的檢出限為0. 046IU/mL，比傳統(tǒng)ELISA法降低了一個數(shù)量級以 上。 另由酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對該份待測人血清中粉塵螨過敏原特異性IgE 抗體的濃度進行檢測，與上述磁性微珠化學發(fā)光免疫分析法的檢測結(jié)果進行對比分析，顯 示兩種方法間相關性為0. 89。 實施例8 :德國小蠊過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法
德國小蠊過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法，包括以下步 驟 (1)制備德國小蠊過敏原蛋白提取液 德國小蠊經(jīng)冷凍滅活后，使用高速萬能粉碎機粉碎，稱取一定重量的原材料，按 1 : 5(W/V)比例加入過敏原蛋白提取液(250mmol/L蔗糖、137mmol/LNaCl、5mmol/L EDTA、 2.7mmol/L KC1、1,1/L DTT、10mmol/L Na2HP04、 1. 8,1/LKH2P04、0. 02 %硫柳滎，pH 7. 4)，將其放置于4t:環(huán)境下提取24小時。以12000rpm/min高速冷凍離心20分鐘，收集上 清液。取5iiL上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。使用德國小 蠊過敏病人陽性血清進行免疫印跡反應，確認上清液中含有該過敏原的過敏原蛋白組份。 將上清液裝在透析袋(截留分子量1萬)中對1Ommol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)透析48 小時，期間使用自動磁力攪拌器緩慢攪動液體，每隔12小時更換液體一次。經(jīng)孔徑0. 22 ii m 濾膜過濾后，冷凍干燥，測定蛋白濃度并稀釋為50ug/mL，保存于-S(TC冰箱。
(2)活化超順磁性微珠 超順磁性微珠表面連接有醛基基團。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌后，加入20 倍體積含有5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液，室溫避光振蕩反應16小時后，進行磁性分離，多次 清洗后獲得活化的超順磁性微珠。 經(jīng)試驗表明，將不同粒徑(0. 2iim、liim、2iim、5iim)的超順磁性微珠在相同的 條件下制備成與德國小蠊過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠，用棋盤滴定法確定5ym粒徑 的磁性微珠反應發(fā)光值最高且本地發(fā)光值最低，適宜作為過敏原蛋白耦聯(lián)的固相載體。 0. 2 ii m和1 ii m粒徑的磁性微珠在手工半自動化操作過程中容易出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，不利于反 應的重復性和準確性。2 ii m禾P 5 y m粒徑的磁性微珠反應較好，既可全自動操作也可以手工 操作，重復性達到質(zhì)量控制要求。 (3)將德國小蠊過敏原蛋白耦聯(lián)至超順磁性微珠上 超順磁性微珠與德國小蠊過敏原蛋白質(zhì)提取液以200 ii g德國小蠊過敏原蛋白/ mg超順磁性微珠的比例混合，4t:攪拌24小時，磁性分離器分離超順磁性微珠，用磷酸鹽緩 沖液(PBS， pH 7.4)洗滌三次，加入過量的5%牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽溶液室溫反應2 小時，以封閉未結(jié)合德國小蠊過敏原蛋白的游離醛基，即得到德國小蠊過敏原蛋白包被的 免疫活性超順磁性微珠。 經(jīng)試驗表明，分別加入與不同濃度的德國小蠊過敏原蛋白耦聯(lián)的超順磁性微珠 (50 ii g德國小蠊過敏原蛋白/mg超順磁性微珠、100 ii g德國小蠊過敏原蛋白/mg超順磁性 微珠、200 y g德國小蠊過敏原蛋白/mg超順磁性微珠和300 y g德國小蠊過敏原蛋白/mg超 順磁性微珠)，用棋盤滴定法確定反應發(fā)光值。當每mg超順磁性微珠包被的德國小蠊過敏 原蛋白達到100 ii g時，發(fā)光信號清楚可測，在100 ii g 200 ii g時，發(fā)光強度持續(xù)增強并在 最強處進入平穩(wěn)狀態(tài)，在超過300 ii g時，發(fā)光信號不再加強，因此，取德國小蠊過敏原蛋白 與超順磁性微珠耦聯(lián)的比例為200 ii g德國小蠊過敏原蛋白/mg超順磁性微珠。德國小蠊 過敏原蛋白在該濃度比例下相對超順磁性微珠是過量的，從而能保證單位重量的超順磁性 微珠完全被包被。 (4)將鼠抗人IgE抗體耦聯(lián)至超順磁性微珠上 超順磁性微珠與鼠抗人IgE抗體以20 ii g鼠抗人IgE抗體/mg超順磁性微珠的比 例混合，4t:攪拌24小時，磁性分離器分離超順磁性微珠，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗 滌三次，加入過量的5%牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽溶液室溫反應2小時，以封閉未結(jié)合鼠 抗人IgE抗體的游離醛基，即得到鼠抗人IgE抗體包被的免疫活性超順磁性微珠。
經(jīng)試驗表明，分別加入與不同濃度的鼠抗人IgE抗體耦聯(lián)的超順磁性微珠(10 ii g 鼠抗人IgE抗體/mg超順磁性微珠、20 ii g鼠抗人IgE抗體/mg超順磁性微珠、30 y g鼠抗 人IgE抗體/mg超順磁性微珠和40 ii g鼠抗人IgE抗體/mg超順磁性微珠)，用棋盤滴定法 確定反應發(fā)光值。當每mg超順磁性微珠包被的鼠抗人IgE抗體達到10 ii g時，發(fā)光信號清 楚可測，在10 i！ g 20 i！ g時，發(fā)光強度持續(xù)增強并在最強處進入平穩(wěn)狀態(tài)，在超過30 i！ g 時，發(fā)光信號不再加強，因此，取鼠抗人IgE抗體與超順磁性微珠耦聯(lián)的比例為20 ii g鼠抗 人IgE抗體/mg超順磁性微珠。鼠抗人IgE抗體在該濃度比例下相對超順磁性微珠是過量 的，從而能保證單位重量的超順磁性微珠完全被包被。
(5)制備人IgE抗體標準品
人IgE抗體標準品來源于人血清，經(jīng)親和色譜純化。
(6)制備堿性磷酸酶標記的羊抗人IgE抗體 將400 ii L羊抗人IgE抗體(500 y g/mL)與400 y L堿性磷酸酶(500 y g/mL)溶液 充分混勻后加入到透析袋中，在0. lmol/L的PB緩沖液(pH 6. 8)中透析24小時，每隔8小 時換透析液一次，再加入1%的戊二醛5011 L，室溫反應24小時。向混合液中加入lmol/L的 甘氨酸100 ii L以封閉游離醛基，室溫反應2小時，在0. Olmol/L的PBS緩沖液(pH 7. 4)中 透析24小時，期間換液4次。最后，以12000rpm/min高速冷凍離心30分鐘后，收集上清，
加等體積甘油4t:保存。 (7)制備堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD將20 ii L化學發(fā)光底物AMPPD溶解在50mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6)中。
(8)組合包裝。 實施例9 :艾蒿花粉過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法
艾蒿花粉過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法，包括以下步 驟 (1)制備艾蒿花粉過敏原蛋白提取液 艾蒿花粉經(jīng)高壓破碎機破壁之后，稱取一定重量，按l : 10(W/V)比例加入過敏原 提取液(250mmol/L蔗糖、137mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA、2. 7mmol/L KCl、lmmol/L DTT、 10,1/L Na2HP04、l. 8,1/L KH2P04、0. 02%硫柳滎，pH 7. 4)，將其放置于4"環(huán)境下提取 48小時。以12000rpm/min高速冷凍離心20分鐘，收集上清液。取5 y L上清液進行聚丙烯 酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。使用艾蒿花粉過敏病人陽性血清進行免疫印 跡反應，確認上清液中含有艾蒿花粉過敏原的過敏蛋白組份。將上清液裝在透析袋(截留 分子量1萬)中對1Ommol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)透析48小時，期間使用自動磁力攪拌 器緩慢攪動液體，每隔12小時更換液體一次。經(jīng)孔徑0.22ym濾膜過濾后，測定艾蒿花粉 過敏原蛋白濃度并稀釋為50ug/mL，保存于-S(TC冰箱。
(2)活化超順磁性微珠 超順磁性微珠表面連接有醛基基團。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌后，加入20 倍體積含有5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液，室溫避光振蕩反應16小時后，進行磁性分離，多次 清洗后獲得活化的超順磁性微珠。 (3)將艾蒿花粉過敏原蛋白耦聯(lián)至超順磁性微珠上 超順磁性微珠與艾蒿花粉過敏原蛋白質(zhì)提取液以200iig艾蒿花粉過敏原蛋白/ mg超順磁性微珠的比例混合，4t:攪拌24小時，磁性分離器分離超順磁性微珠，用磷酸鹽緩 沖液(PBS， pH 7.4)洗滌三次，加入過量的5%牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽溶液室溫反應2 小時，以封閉未結(jié)合艾蒿花粉過敏原蛋白的游離醛基，即得到艾蒿花粉過敏原蛋白包被的 免疫活性超順磁性微珠。 (4)將鼠抗人IgE抗體耦聯(lián)至超順磁性微珠上、(5)制備人IgE抗體標準品、(6) 制備堿性磷酸酶標記的羊抗人IgE抗體和(7)制備堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD均同實 施例8中所述。 (8)黑色塑料不透光微孔板的制備 使用黑色不透光塑料一次性注塑形成微孔板。如圖l所示，黑色塑料不透光微孔板板體1呈矩形，一面設置有若干微孔，另一面為平整的板面，微孔21與微孔22之間設有 隔層3。 (9)板式磁性分離器的制備 取呈矩形片狀的具有磁性的板體4，在其兩側(cè)邊各向板體的一面彎折設置側(cè)壁5， 側(cè)壁內(nèi)側(cè)外端垂直延伸出擋板6，且側(cè)壁在一側(cè)頂端沿板體邊緣延伸出固定塊7。側(cè)壁5、擋 板6和固定塊7均無磁性，僅起固定作用。設置不透光微孔板的形狀和大小與板式磁性分 離器相匹配，可從一側(cè)滑動地插入其中并固定地容置在其中，并由側(cè)壁5、擋板6和固定塊7 進行固定。 (10)樣品稀釋液和樣品洗滌液的制備 配制1 % BSA和含0. 01 % Proclin 300的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合得樣品稀 釋液，調(diào)節(jié)為pH 7. 4。配制1% BSA和0. 05% Tween 20的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合得 樣品洗滌液，調(diào)節(jié)為pH 7.4。
(11)組合包裝。 實施例10 :吸入組過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法
吸入組過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟
(1)分別制備吸入組過敏原蛋白提取液 吸入性過敏原蛋白提取液包括腐食酪螨過敏原蛋白提取液、東方蜚蠊過敏原蛋 白提取液、鴨羽毛過敏原蛋白提取液、狗毛皮過敏原蛋白提取液、特異青霉過敏原蛋白提取 液、萚草花粉過敏原蛋白提取液、勿忘我過敏原蛋白提取液、天鵝草過敏原蛋白提取液、榆 科過敏原蛋白提取液、亞麻布纖維過敏原蛋白提取液和桑蠶絲過敏原蛋白提取液。
(2)活化超順磁性微珠 (3)分別將吸入性過敏原蛋白耦聯(lián)至不同的超順磁性微珠上 (4)將鼠抗人IgE抗體耦聯(lián)至超順磁性微珠上、(5)制備人IgE抗體標準品、(6) 制備堿性磷酸酶標記的羊抗人IgE抗體和(7)制備堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD均同實 施例8中所述。 (8)樣品稀釋液和樣品洗滌液的制備 配制1 % BSA和含0. 01 % Proclin 300的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合得樣品稀 釋液，調(diào)節(jié)為pH 7. 4。配制1% BSA和0. 05% Tween 20的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合得 樣品洗滌液，調(diào)節(jié)為pH 7.4。
(9)組合包裝。 實施例11 :食入組過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法
食入組過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟
(1)分別制備食入組過敏原蛋白提取液 食入組過敏原蛋白提取液包括羊奶過敏原蛋白提取液、鴨蛋過敏原蛋白提取液、
豬肉過敏原蛋白提取液、燕麥過敏原蛋白提取液、核桃過敏原蛋白提取液、菠蘿過敏原蛋白
提取液、大蒜過敏原蛋白提取液、鰱魚過敏原蛋白提取液、蠶豆過敏原蛋白提取液、辣椒過
敏原蛋白提取液和蠶蛹過敏原蛋白提取液。
(2)活化超順磁性微珠 (3)分別將食入性過敏原蛋白耦聯(lián)至不同的超順磁性微珠上
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(4)將鼠抗人IgE抗體耦聯(lián)至超順磁性微珠上、(5)制備人IgE抗體標準品、(6) 制備堿性磷酸酶標記的羊抗人IgE抗體和(7)制備堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD均同實 施例8中所述。 (8)陶瓷不透光微孔板的制備 燒制陶瓷一次性形成不透光微孔板。如圖2所示，陶瓷不透光微孔板板體11呈矩 形，一面設置有若干微孔，另一面由若干微孔的孔底圓弧面構(gòu)成，微孔23與微孔24之間設 有隔層31。 (9)板式分離器的制備 同實施例9中所述。
(10)樣品稀釋液和樣品洗滌液的制備 配制1 % BSA和含0. 01 % Proclin 300的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合得樣品稀 釋液，調(diào)節(jié)為pH 7. 4。配制1% BSA和0. 05% Tween 20的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合得 樣品洗滌液，調(diào)節(jié)為pH 7.4。
(11)組合包裝。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視 為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒，其特征在于，包括與過敏原蛋白耦聯(lián)的磁性微珠、與抗人IgE抗體耦聯(lián)的磁性微珠、人IgE抗體標準品、堿性磷酸酶標記的抗人IgE抗體和堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述磁性微珠為超順磁性微珠。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，進一步包括不透光微孔板。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，進一步包括板式磁性分離器。
5. 如權(quán)利要求1 4中任一權(quán)利要求所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述過敏原蛋 白和所述磁性微珠以lOOii g 300ii g過敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)，所述抗人IgE 抗體和所述磁性微珠以20 ii g抗人IgE抗體/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)。
6. 如權(quán)利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述過敏原蛋白來源于以下材料螨 類、蟑螂類、動物羽毛類、動物毛皮類、霉菌類、花粉類、雜草類、植物纖維類、蠶絲、奶類、蛋 類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、水產(chǎn)類、豆類、香料類和蠶蛹。
7. —種過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟將過敏原蛋白耦聯(lián)至磁性微珠上； 將抗人IgE抗體耦聯(lián)至磁性微珠上；制備人IgE抗體標準品； 制備堿性磷酸酶標記的抗人IgE抗體；制備堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD ;以及組合包裝。
8. 如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述磁性微珠為超順磁性微珠。
9. 如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，進一步包括制備不透光 微孔板和板式磁性分離器。
10. 如權(quán)利要求7 9中任一權(quán)利要求所述的檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，將 所述過敏原蛋白和所述磁性微珠以100 ii g 300 ii g過敏原蛋白/mg磁性微珠的比例耦 聯(lián)，將所述抗人IgE抗體和所述磁性微珠以20ii g抗人IgE抗體/mg磁性微珠的比例耦聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫分析檢測試劑盒，提供了一種過敏原特異性IgE抗體免疫分析檢測試劑盒及其制備方法。該檢測試劑盒包括與過敏原蛋白耦聯(lián)的磁性微珠、與抗人IgE抗體耦聯(lián)的磁性微珠、人IgE抗體標準品、堿性磷酸酶標記的抗人IgE抗體和堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD。其制備方法包括將過敏原蛋白耦聯(lián)至磁性微珠上、將抗人IgE抗體耦聯(lián)至磁性微珠上、制備人IgE抗體標準品、制備堿性磷酸酶標記的抗人IgE抗體、制備堿性磷酸酶化學發(fā)光底物AMPPD及組合包裝。本檢測試劑盒具有靈敏度高、準確性高且反應快速、使用方便、用量低和成本低的優(yōu)點，能幫助精確定量測定致敏過敏原，指導臨床過敏反應治療。
文檔編號G01N33/543GK101696973SQ200910110298
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者何素華, 和水祥, 薛曉英, 趙振軍, 邱于斌, 雷均平, 黃志堅 申請人:深圳市博卡生物技術有限公司;