專利名稱：：一種重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白懸浮芯片及其制備方法與應(yīng)用，尤其涉及同時檢測幾種引起發(fā)熱的感染性病原抗體的檢測如結(jié)核抗體、流感抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體等的蛋白懸浮芯片及其制備方法與應(yīng)用，屬于免疫技術(shù)及臨床檢測技術(shù)領(lǐng)咸
背景技術(shù)：
：2003年全球SARS流行、亞洲各國頻頻爆發(fā)的禽流感、登革熱、中緬邊境的惡性痗疾、此起彼伏的腦炎、流感、又進(jìn)入活3夭期的鼠疫、美國的西尼羅熱、非洲的埃博拉出血熱等，引起民眾對傳染病的廣泛恐懼。世界衛(wèi)生組織2002年關(guān)于傳染病的分析報(bào)告中指出，全世界每小時有1500人死于傳染病。而發(fā)熱是傳染病最常見最為突出的臨床癥狀之一。目前已知能引M熱的物質(zhì)有許多種，但與發(fā)熱最相關(guān)的是生物源的，如結(jié)核分枝桿菌、流感病毒、禽流感病、鼠疫菌、SARS、毒炭疽桿菌、登革病毒、西尼羅病毒、肺炎衣原體、支原體感染等。由于每一個感染者都是一個快速流動、難以控制的傳染源，實(shí)施快速檢測，及時、快速鑒別病原是傳染病防控早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)警、早處置的基礎(chǔ)和前提。目前病原的快速檢測技術(shù)發(fā)展很快，針對不同的生物標(biāo)識物分別發(fā)展了不同的快速檢測方法。如檢測核酸的各類PCR、原位雜交、DNA芯片、NASBA等技術(shù)，檢測蛋白質(zhì)等抗原、抗體物質(zhì)的ELISA、免疫層析技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)等，都具有各自的特點(diǎn)。針對病原核酸的PCR等快速檢測技術(shù)需依賴儀器的基因擴(kuò)增和電泳過程，也依賴操作人員的技術(shù)水平，難以滿足口岸現(xiàn)場簡便快速篩查需要。一般的方法主要檢測單種病原或傳染病，面對一個發(fā)熱患者，難以實(shí)現(xiàn)多病因的同時篩查?？焖俸Y查是早期識別傳染病的關(guān)鍵，傳染病的快速檢測技術(shù)水平不僅關(guān)系人民的生命健康，也關(guān)系著中國的檢疫水平在國際上的可信程度和聲譽(yù)影響著我國對外的人員交流活動和國家的國際形象，也影響著能否控制傳染病的傳入傳出避免外事糾紛。因此，快速檢測技術(shù)的提高是傳染病防控工作非常重要的環(huán)節(jié)，加強(qiáng)快速檢測技術(shù)應(yīng)用基礎(chǔ)研究刻不容統(tǒng)具有非常重要的意義既是提高我國衛(wèi)生檢疫防疫整體工作水平和質(zhì)量的需要又維護(hù)我國公共衛(wèi)生安全的需要。懸浮芯片(suspensionarray)^稱'液相芯片(liquidarray,liquidchip),是20世紀(jì)70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞儀作為沖企測平臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測定。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨(dú)特的色彩編號，每顆樣"求大小約5.5nm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機(jī)器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細(xì)管檢測通逸每次僅允許一個微球通過檢測通道，檢測通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項(xiàng)目；一道為綠色，激發(fā)報(bào)告分子的顏色，記錄信號強(qiáng)弱以檢測待測物的含量。當(dāng)待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的纟效球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標(biāo)物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。與以往的技術(shù)相比，當(dāng)今發(fā)展的生物芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)把幾種發(fā)熱病原一次性聯(lián)合檢測的目的，目前產(chǎn)生的懸浮芯片技術(shù)還是生物芯片的一種，它除了可以檢測多種病原以外，還具有比ELISA反應(yīng)更加充分的液相環(huán)境，且具有省時省力，特異性強(qiáng)，靈敏度高，并且無創(chuàng)傷的優(yōu)點(diǎn)。因此研制和開發(fā)一種重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)對我國出入境人員的快速檢測其有無攜帶傳染病原的監(jiān)測有重要的研究意義
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于為人們提供一種重要感染病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片檢測方法，實(shí)現(xiàn)能在短時間內(nèi)同時檢測幾種？1M熱的病原抗體，從而得出被檢測人員有沒被相應(yīng)病原感染，有無疫情的發(fā)生，為出入境人員能夠快速通過出有無攜帶外來傳染病原的出入境體檢的需要節(jié)約了時間，又能有效保障我國公共衛(wèi)生安全。本發(fā)明涉及一種重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片檢測方法針對一種或多種引M熱的感染性病原制備出相應(yīng)診斷抗原，分別與不同編號的微球偶聯(lián)，制備出可對上述病原抗體檢測的蛋白懸浮芯片，在應(yīng)用時，加入待檢血清，使血清中的抗體被微球上的抗原捕恭再與生物素標(biāo)記的二抗(生物素化羊抗人IgG)共同孵育，然后與鏈霉親和素-藻紅蛋白反應(yīng)，通過Bio-PlexSystem檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對上述病原抗體一次性;險測。下面對本發(fā)明所述的重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片檢測方法進(jìn)行詳細(xì)的描述本發(fā)明的重要發(fā)熱病原包括，例如結(jié)核分枝桿菌、流感病毒、禽流感病毒、鼠疫桿菌、SARS病毒。本發(fā)明確定了用于捕獲相應(yīng)抗體的抗原分別使結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白、16KD蛋白、LAM抗原，流感NP蛋白、禽流感H5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoVN蛋白；所要捕獲的抗體分別是兔抗TBIgG、結(jié)核抗體、鼠抗流感NPIgG、兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;相應(yīng)的生物素化抗體分別是Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗鼠IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗人IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗兔IgG,檢測人血清是所用生物素化抗體為Biotin羊抗人的二抗。本發(fā)明涉及一種快速篩查重要引起發(fā)熱感染性病原的蛋白懸浮芯片，主要由微球，包被抗原，捕獲抗體，生物素化抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其特征是，所述微球是27,31，32，33，43，44號羧基微球；所述包被抗原是結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、禽流感H5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoV6N蛋白；所述捕獲抗體是兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、結(jié)核抗體兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;所述生物素化抗體是Biotin(即生物素)羊抗兔IgG、Biotin羊抗鼠IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗人IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗兔IgG;所述包被抗原均與對應(yīng)的抗體特異性的結(jié)合，所述捕獲抗體均與對相應(yīng)生物素化二抗(即生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊羊抗鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊抗人IgG、生物素化羊抗兔IgG、)特異性結(jié)合；其中結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白與27號羧基微球形成偶聯(lián)體，流感NP蛋白與31號羧基微球形成偶聯(lián)體，LAM抗原與33號羧基微球形成偶聯(lián)體，禽流感H5抗原與32號M微球形成偶聯(lián)體，鼠疫菌Fl抗原與43號羧基微球形成偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白與44號羧基微球形成偶聯(lián)體，以紅色激光激發(fā)其微球基質(zhì)上的紅色分類熒光依據(jù)其微球基質(zhì)的色彩不同確定類型；所述生物素化抗體于鏈霉親和素-藻紅蛋白結(jié)合，以綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，測定微球基質(zhì)上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定微球基質(zhì)上結(jié)合的捕獲抗體。在上述的重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片中，所述捕獲抗體是兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、結(jié)核抗體兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;所述生物素化抗體是生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗鼠IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗人IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG;所述適用于人血清的檢測項(xiàng)目分別是結(jié)核抗體、流感抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體。本發(fā)明所述重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)蛋白懸浮芯片的制備方法，其步驟是(1)活化編碼微球分取27,31，32，33，43,44號編碼微球到離心管中，10000g14000g離心后小心吸出上清并棄去。加入孩t球洗滌緩沖液懸浮，震蕩30秒，超聲30秒，10000g14000g離心，小心吸出上清并棄去。加入微球活化緩沖液，接著先加入新鮮配置的EDC，緊接著加入新鮮配置的Sulfo-NHS，高速震蕩后用鋁箔包裹，在室溫震搖20min40min。加入PBS，震蕩后，10000g14000g離心，小心吸出上清并棄去(重復(fù)此步驟一次)。加入的PBS懸浮編碼微球，中速震蕩后，超聲。(2)抗原包被編碼微球M目應(yīng)的抗原加入到活化后的編碼微球中，用PBS(pH7.4)定溶至500pL，鋁箔包裹在室溫震搖30min-2h。10000g~14000g離心后，小心吸出上清，棄去。用500(oL的PBS(pH7.4)洗一次，10000g~14000g離心后，小心吸出上清，棄去。加入封閉緩沖液懸浮編碼微球，中速震蕩，用鋁箔包裹，在室溫震搖10min60min,lOOOOg-14000g離心后，小心吸出上清，棄去。加入儲備緩沖液洗滌編碼微球，10000g~16000g離心后，小心吸出上清，棄去。最后用儲備緩沖液懸浮編碼微球，于4。C避光保存?zhèn)溆谩?3)包被微球的計(jì)數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板在普通顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算微球數(shù)量。本發(fā)明所述重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片方法，其所述樣品的懸浮芯片檢測具體步驟如下采用間接法的免疫學(xué)檢測模式，檢測過程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行。(1)每孔加入4企測緩沖液預(yù)濕孔，用真空泵抽濾；(2)每孔加入含相應(yīng)編碼孩U求的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；(3)加入稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min，洗液洗滌并抽濾三)夂；(4)加入適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化二抗混勻后室溫避光震搖30min60min，洗液洗滌3-6次，并真空泵抽濾；(5)加入SA-PE，混勻后室溫避光震搖10~30min,洗液洗滌3-6次，并真空泵抽濾；(6)加入檢測緩沖液，經(jīng)振蕩使小球重懸均勻；(7)用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀耳又FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明的方法不但可以快速篩查多種病原的抗體而且，由于多個包被病原菌的抗原的微球在同一體系中，不同的抗原可以和不同的目的分子結(jié)合，反應(yīng)后通過激光檢測微球基質(zhì)的色彩編號可以對不同的檢測反應(yīng)加以區(qū)分，因而更加省時省力，同時節(jié)約了4企測的成本。圖1、本發(fā)明的多重體系微^M企測兔抗TB的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2、本發(fā)明的多重體系微^M企測鼠抗流感NP的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3、本發(fā)明的多重體系微球檢測鼠抗禽流感H5N1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度為69.4ng/ml;圖4、本發(fā)明的多重體系微珎驗(yàn)測兔抗鼠疫F1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈壽丈度為6.29475ng/ml;圖5、本發(fā)明的多重體系微球檢測兔抗SarsN13的標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度為15.5265ng/ml。上述附圖為抗體濃度一一編碼微球表面的焚光強(qiáng)度劑量反應(yīng)曲線。編碼微球表面焚光強(qiáng)度與加入的抗體量在一定的范圍內(nèi)成正相羌其中橫坐標(biāo)為多重微球體系中加入的抗體的量，縱坐標(biāo)代表相應(yīng)編碼《效球表面的焚光強(qiáng)度?？梢酝ㄟ^擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對檢測抗體的半定量分析。AE分別為兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、結(jié)核抗體兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG熒光強(qiáng)度劑量反應(yīng)曲線。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:包被抗原與已知編號微球的偶聯(lián)1.分別取27，31,32,33,43，44號編碼微球，用凝渦振蕩器振蕩微球懸液，時間30s，超聲30秒，使微球混合均勻；2.分別取上述各編碼微球1.25x106個到1.5mL離心管中，10000g~14000g離心4min，小心吸出上清并棄去；3.加入100joL的珠球洗滌緩沖液(PBS，pH7.4,0.05%TWEEN-20)9懸浮微球，震蕩30秒，超聲30秒，lOOOOg—14000g離心4min,小心吸出上清并棄去；4.加入80jiL的珠球活化緩沖液(3gNaH2P04，5NNaOH40drops/250mLH20)，用旋渦振蕩器振蕩微球懸氣5.加入10pL新鮮配置的EDC(50mg/mL)，緊接著加入10|aL新鮮配置的Sulfo-NHS(50mg/mL)，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20min;6.加入150^L的PBS(pH7.4)，震蕩10秒后，10000g-14000g離心4min,小心吸出上清并棄去；7.重復(fù)上步驟一次；8.加入100^iL的PBS(pH7.4)懸浮編碼」微球，中速震蕩30秒后，超聲15秒；9.分別取抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、禽流感H5抗原、鼠疫菌F1抗原、SARS-CoVN蛋白l-10嗎加入到活化后的編碼微球中，用PBS(pH7.4)定溶至500^L;10.鋁箔包裹在室溫震搖2h，lOOOOg-14000g離心4min，小心吸出上清，棄去；11.用500jiL的PBS(pH7.4)洗一次，10000g~14000g離心4min,小心吸出上清，棄去；12.加入250jjL的封閉緩沖液(PBS(pH7.4),1%BSA,0.05%Azide)懸浮編碼微球，中速震蕩15秒，用鋁箔包裹，在室溫震搖30min，10000g~14000g離心4min，小心吸出上清，棄去；13.加入500|iiL的儲備緩沖液(PBS(pH7.4),0.1%BSA，0.02%TWEEN，0.05%疊氮化物)洗滌編碼微球，lOOOOg-16000g離心6min,小心吸出上清，棄去；14.最后用1501iL的儲備緩沖液懸浮編碼微球，即得結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白與27號J^微球形成偶聯(lián)體，流感NP蛋白與31號羧基微球形成偶聯(lián)體，LAM抗原與33號羧基微球形成偶聯(lián)體，禽流感H5抗原與32號羧基微球形成偶聯(lián)體，鼠疫菌Fl抗原與43號羧基微球形成偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白與44號羧基微球形成偶聯(lián)體；15.吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)，換算出每種微球的濃度；16.把偶聯(lián)號得微球放在4'C避光保存，一般每種抗原偶聯(lián)體的微球單獨(dú)保存，使用時，依據(jù)檢測項(xiàng)目選擇混合。實(shí)施例2:樣品的懸浮芯片檢測采用間接法的免疫學(xué)檢測模式檢測過程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行。1.每孔加入150(iL檢測緩沖液預(yù)濕孔，用真空泵抽濾；2.每孔加入50jiL含相應(yīng)編碼孩t球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；3.加入50(iL稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min,洗液洗滌并抽濾三次；4.加入50(iL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化二4^混勻后室溫避光震搖30min，洗液100pL洗滌3次，并真空泵抽濾；5.加入50(iL的SA-PE,混勻后室溫避光震搖10min。洗液100|aL洗滌3次，并真空泵抽濾；6.加入125jiL的檢測緩沖泉經(jīng)振蕩使小球重懸均勻；7.用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例3:多重微球體系對不同濃度兔抗TBIgG的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯(lián)，具體操作方法如實(shí)施例1,得到不同抗原與編碼微:昧的偶聯(lián)體；2.取包被有抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯(lián)體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯(lián)體，鼠疫菌F1抗原的43號羧基微球偶聯(lián)體,SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯(lián)體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50pL作為多重微球體系的檢測工作溶液；3.將兔抗TBIgG用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，兔抗TBIgG的濃度分別是0.147ng/ml、0.588ng/ml、2.354ng/ml、9.418ng/ml、37.672ng/ml、150.687ng/ml、602.75ng/ml、2.411jig/ml;4.具體的檢測操作步驟如實(shí)施例2;5.各微球檢測兔抗TB的得到的MFI值見下表1,多重體系微球檢測兔抗TB的標(biāo)準(zhǔn)曲線FI=2.32671+(5582.99-2.32671)/((l+(Conc/331.934)A-1.42723))A0.78545檢測靈敏度為1.5815ng/ml。表1多重體系微^^r測兔抗TB的MFI值兔抗TBIgGMFI值濃度(ng/ml)N13(44)TB(27)FlAg(43)H5(32)048.75127.584.30.1476514.5101100.5885620101032.3545538.591079.41858107810737.672635119105150.6878118468,5103602.75118.542338992411.321535511117實(shí)施例4:多重W體系對不同濃度鼠抗流感NP抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯(lián)，具體操作方法如實(shí)施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯(lián)體；2.取包被有抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯(lián)體，流感NP蛋白的31號羧基微球偶聯(lián)體，鼠疫菌Fl抗原的43號羧基微球偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯(lián)體，12各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50(xL作為多重微球體系的檢測工作溶液；3.將鼠抗流感NP抗體用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，鼠抗流感NP抗體的濃度分別是3.052ng/ml、12.207ng/ml、48.828ng/ml、195.312ng/ml、781.25ng/ml、3125ng/ml、12500ng/ml、50000ng/ml;4.具體的檢測操作步驟如實(shí)施例2;5.各微球4企測鼠抗流感NP抗體得到的MFI值見下表2,多重體系微J^險測鼠抗禽流感NP的標(biāo)準(zhǔn)曲線FI-20.3844+(583.981-20.3844)/((1+(Conc/6113.06)A-2.38124))A0.349701靈敏度為968.8ng/ml。表2多重體系微^M^r測鼠抗禽流感NP的MFI值鼠抗流感MFI值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例5:多重微球體系對不同濃度鼠抗禽流感H5N1抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯(lián)，具體操作方法如實(shí)施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯(lián)體；2.取包被有抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯(lián)體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯(lián)體，鼠疫菌Fl抗原的43號羧基微球偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯(lián)體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50nL作為多重微球體系的檢測工作溶液；3.將鼠抗禽流感H5N1抗體用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，鼠抗禽流感H5N1抗體的濃度分別是0.305ng/ml、1.2nng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.Ong/ml、5000.Ong/ml、20000ng/ml;4.具體的檢測操作步驟如實(shí)施例2;5.各微^J險測檢測鼠抗禽流感H5N1抗體的MFI值見下表3，多重體系微Jl^r測鼠抗禽流感H5Nl的標(biāo)準(zhǔn)曲線FI=11.2281+(1516.12-11.2281)/((1+(Conc/628.306)A—1.0296))A1.06526靈敏度為69.4ng/ml。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例6:多重微球體系對不同濃度兔抗鼠疫F1抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯(lián)，具體操作方法如實(shí)施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯(lián)體；2.取包被有抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯(lián)體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯(lián)體，鼠疫菌Fl抗原的43號羧基微球偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基樣t球偶聯(lián)體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50/aL作為多重微J求體系的4全測工作溶液；3.將兔抗鼠疫F1抗體的用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，兔抗鼠疫Fl抗體的濃度分別是0.305ng/ml、1.221ng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.Ong/ml、5000.Ong/ml、20000.Ong/ml、80000.Ong/ml;4.具體的檢測才喿作步驟如實(shí)施例2;5.各微球檢測檢測兔抗鼠疫F1抗體的MFI值見下表4，多重體系微球檢測兔抗鼠疫F1抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線FI=4.423+(4130.55-4.423)〃1+(Conc/1853.93)八-0.986615)靈敏度為6.29475ng/ml。表4多重體系微^M企測兔抗鼠疫Fl抗體的MFI值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6420000.015.510338356180000.018984137.570實(shí)施例7:多重微球體系對不同濃度兔抗SarsN13抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯(lián)，具體操作方法如實(shí)施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯(lián)體；2.取包被有抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯(lián)體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯(lián)體，鼠疫菌Fl抗原的43號^4微球偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯(lián)體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50|uL作為多重微球體系的檢測工作溶氣3.將兔抗SarsN13抗體的用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，兔抗SarsN13抗體的濃度分別是0.034ng/ml、0.137ng/ml、0.549ng/ml、2.197ng/ml、8.789ng/ml、35.156ng/ml、140.625ng/ml、562.5ng/ml、2250.0ng/ml;4.具體的檢測操作步驟如實(shí)施例2;5.各微^M企測檢測兔抗SarsN13抗體的MFI值見下表5，多重體系微球4企測兔抗SarsNl3抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線FI=8.9686+(2204.42—8.9686)/((1+(Conc/287.286)A-1.2352))Al.10117靈敏度為15.5265ng/ml。表5多重體系微球檢測兔抗SarsN13的MFI值兔抗SarsN13MFI值抗體濃度(ng/ml)TB(27)H5(32)FlAg(43)N13(44)012.884.2512.25450.0341388.51350.50.137161001455160.5491811317562.19716110.513.5598.78915941472.535.156138012169140.625169614627562.518821215182250.02967112079.5實(shí)施例8:本發(fā)明所述重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白,辯芯片在檢測人血清中結(jié)核抗體的應(yīng)用。1.取結(jié)核LAM抗原與33號編碼微球偶聯(lián)，具體操作方法如實(shí)施例1;得到LAM抗原與33號編碼微球的偶聯(lián)體；2.將被診斷為結(jié)核病人的35份血清和53份正常健康人血清分別用樣品稀釋液估支l:io倍梯稀釋；3.取96孔濾板，在每孔加入150iiiL檢測緩沖液預(yù)濕孔，用真空泵抽濾；4.每孔加入50jaL含3500個包被有LAM抗原的33號編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；5.加入50jliL稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min，洗液洗滌并抽濾三次；6.加入50(iL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人IgG,混勻后室溫避光震搖30min，洗液100|iL洗滌3次，并真空泵抽濾；7.加入50pL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10min。洗液100jaL洗滌3次，并真空泵抽濾；8.加入125jiL的檢測緩沖液,經(jīng)振蕩使小球重懸均勻；9.用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)進(jìn)行檢測；10.同樣的血清樣本用于市售ELISA試劑盒;f企測。檢測結(jié)果見表6、7，由此可見由lam抗原檢測的結(jié)核抗體的檢測靈敏度為68.57%、特異度為83.02%、準(zhǔn)確度為77.27%;ELISA試劑盒^r17測血清中結(jié)核抗體的檢測靈敏度為62.86%、特異度為94.34%、準(zhǔn)確度為81.82%,lam抗原包被的微球用懸浮芯片檢測結(jié)核抗體的靈敏度比市售ELISA法的靈敏度高，檢測率也較高。表6lam抗原檢測人樣本中結(jié)核抗體的檢測結(jié)果血清類型例數(shù)陽性陰性陽性檢出率結(jié)核病人35241168.57%正常人5394416.98%合計(jì)88335537.50%表7EILSA試劑盒檢測人血清中結(jié)核抗體的檢測結(jié)果血清類型例數(shù)陽性陰性陽性檢出率結(jié)核病人35221362.86%正常人533505.66%合計(jì)88256328.41%實(shí)施例9:本發(fā)明所述重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片在檢測人血清中結(jié)核抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體的應(yīng)用。1.各抗原與不同編碼微球偶聯(lián)，具體操作方法如實(shí)施例1;得到不同抗原與編碼微5求的偶聯(lián)體；2.取包被有抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯(lián)體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯(lián)體，鼠疫菌Fl抗原的43號M^微球偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白的44號氣基微球偶聯(lián)體，各3500個，加入同一離心管中，加孩O求稀釋液至總體積50iuL作為多重微球體系的檢測工作溶泉3.將94份人血清分別用樣品稀釋液做1:1G倍梯稀釋；4.取96孔濾板，在每孔加入150jiL檢測緩沖液預(yù)濕孔，用真空泵抽濾；5.每孔加入50uL上述步驟2中的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；6.加入50mL稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min，洗液18洗滌并抽濾三次；7.加入50iaL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人IgG,混勻后室溫避光震搖30min,洗液100nL洗滌3次，并真空泵抽濾；8.加入50jaL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10min。洗液100jaL洗滌3次，并真空泵抽濾；9.加入125juL的檢測緩沖液，經(jīng)振蕩使小球重懸均勻；10.用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)進(jìn)行4企測。結(jié)果判定單個檢測項(xiàng)目中94個人檢測熒光值MFI的平均值與3倍的94個Ai企測焚光值MFI的標(biāo)準(zhǔn)差的和作為該;險測項(xiàng)目的cutoff值，如果檢測的MFI值>cutoff值為陽性，反之為陰性。檢測結(jié)果見下表8。表8多重微球體系4企測人血清結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權(quán)利要求1.一種重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片，其特征是，由編碼微球，包被抗原，檢測抗體，生物素化抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成。2.如權(quán)利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，所述包被抗原選自下列的一種或多種結(jié)核16KD和38KD蛋白，流感NP蛋白，禽流感H5抗原，結(jié)核LAM抗原，鼠疫菌F1抗原，SARS-CoVN蛋白。3.如權(quán)利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，所述檢測抗體選自兔抗TBIgG，鼠抗流感NPIgG，兔抗H5N1血清，結(jié)核抗體，兔抗鼠疫IgG，兔抗SARSIgG中的一種或多種。4.如權(quán)利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，所述生物素化抗體選自Biotin羊抗兔IgG,Biotin羊抗鼠IgG，Biotin羊抗兔IgG，Biotin羊抗人IgG,Biotin羊抗兔IgG,Biotin羊抗兔IgG中的一種或多種。5.如權(quán)利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，可以檢測結(jié)核抗體，流感抗體，禽流感抗體，鼠疫抗體，SARS抗體中的一種或多種。6.—種采用蛋白懸浮芯片快速篩查重要發(fā)熱病原抗體的檢測方法，其特征是針對一種或多種重要發(fā)熱病原制備出相應(yīng)抗原，分別與不同編號的微球偶聯(lián)，制備出可對上述病原抗體檢測的蛋白懸浮芯片，在應(yīng)用時，加入待檢血清，使血清中的抗體被微球上的抗原捕獲，再與生物素標(biāo)記的二抗(即生物素化羊抗人IgG)共同孵育，然后與鏈霉親和素-藻紅蛋白反應(yīng)，通過Bio-PlexSystem檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對上述病原抗體一次性檢測。7.如權(quán)利要求6所述的蛋白懸浮芯片檢測方法，其特征是選取27，31,,33，43,44號羧基微球作為編碼微球，洗滌；活化g微球；分別對應(yīng)27,31，32，33，43，44號羧基微球順序加入結(jié)核16KD和38KD蛋白，流感NP蛋白，禽流感H5抗原，結(jié)核LAM抗原，鼠疫菌F1抗原，SARS-CoVN蛋白抗原；混勻；在室溫下。以300-900rpm的轉(zhuǎn)速放在搖床上孵育30120分鐘；用封閉緩沖液封閉；用儲備緩沖液洗滌；得結(jié)核16KD和38KD蛋白與27號微球得偶聯(lián)體，流感NP蛋白與31號微球得偶聯(lián)體，禽流感H5抗與32號微球得偶聯(lián)體，結(jié)核LAM抗原與33號微球得偶聯(lián)體，鼠疫菌F1抗原與43號微球得偶聯(lián)體，SARS-CoVN蛋白抗原與44號微球得偶聯(lián)體；計(jì)數(shù)每種微球偶聯(lián)體的單位體積數(shù)，確定濃度，分別于4。C條件下避光保存；使用時，依據(jù)檢測項(xiàng)目選擇混合。8.如權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)所述的重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的蛋白懸浮芯片檢測在檢測人血清樣本中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)的檢測方法，主要涉及檢測血清中結(jié)核抗體、流感抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體。芯片主要由編碼微球，包被抗原，檢測抗體，生物素化抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，該方法包括包被抗原與編碼微球的偶聯(lián)，檢測抗體將分別特異性的與相應(yīng)的各號微球偶聯(lián)，以紅色激光激發(fā)其球形基質(zhì)上的分類熒光，依據(jù)其球形基質(zhì)色彩不同確定類型；其中的生物素化抗體將與檢測抗體結(jié)合；所述的鏈霉親和素-藻紅蛋白與微球上捕獲檢測抗體的生物素結(jié)合，以綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，測定球形基質(zhì)上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球形基質(zhì)上結(jié)合的檢測抗體的含量，從而來確定是否被病原感染，達(dá)到快速篩查發(fā)熱病原的目的。文檔編號G01N33/546GK101504414SQ20091008025公開日2009年8月12日申請日期2009年3月17日優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日發(fā)明者孫肖紅,宇楊,楊永莉,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院