專利名稱：：一種復(fù)合檢測多種類病原體的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種復(fù)合檢測多種類病原體的蛋白質(zhì)懸浮芯片制備及其才企測方法，所述的病原體包括細(xì)菌、細(xì)菌芽；包、細(xì)菌毒素、才直物毒素和病毒，分別選以鼠疫耶爾森菌(fem'//a/e^/s)、炭疽芽胞桿菌(勘"7/iA^a/2^rac/力、葡萄球菌腸毒素B(staphylococcalenterotoxinB,SEB)、蓖麻毒素(ricin)和重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)為代表。
背景技術(shù)：
：進(jìn)入20世紀(jì)以后，生物威脅有增無減。1996年日本EHEC0157:H7疫情、2003年全球SARS疫情、2001年美國炭疽郵包事件、1995年美國明尼蘇達(dá)州蓖麻毒素事件等，人類面臨生物威脅的事例多不勝數(shù)。人為生物恐怖事件隨時有發(fā)生的可能，更引起人們對生物威脅的恐懼。而新發(fā)傳染病種類繁多，生物恐怖因子多種多樣，包含細(xì)菌、病毒、毒素等，威脅人類健康的生物因子至少有30多種。由于針對不同病原體襲擊的防護(hù)和處理各不相同，一線工作者既要保護(hù)自身安全，也要做到科學(xué)處置，因此病原體的快速鑒定識別是應(yīng)對生物威脅的首要任務(wù)。目前，基于微生物學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論發(fā)展起來的病原體快速檢驗方法可以分別對環(huán)境樣本中的生物威脅因子進(jìn)行定性和定量檢測。定性檢測技術(shù)有常規(guī)的分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法等，鑒定結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但耗時長，每次只能確定或排除一種病原;徵生物，往往延誤緊急突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處置?？焖贆z測技術(shù)主要是以病原體遺傳物質(zhì)核酸為基礎(chǔ)的檢測方法如核酸分子雜交、PCR、多重PCR等，和基于病原體核酸或抗原檢測的生物傳感器技術(shù)，如光纖傳感器、電化學(xué)傳感器、上轉(zhuǎn)換磷光生物傳感器、納米傳感器等。其中，利用多重PCR方法進(jìn)行單一或多種致病菌的試驗屢有報道。微生物定量檢測方法包括常規(guī)的平板法、最大可能數(shù)(MPN)法、細(xì)胞計數(shù)法和阻抗計法等，也存在耗時長，每次只能對一種病原體進(jìn)行定量檢測的缺陷；微生物定量檢測的新技術(shù)主要是實時定量PCR,近年來在多種病原微生物的定量檢測中得到廣泛應(yīng)用，但缺陷是只能檢測病原菌的核酸，不能檢測毒素蛋白。炭疽芽孢桿菌a/^力rac/力是引起人獸共患病-炭疽的病原菌，為革蘭氏陽性可形成芽孢的需氧菌，芽孢可以通過呼吸道、消化道、皮膚接觸感染人類，一般在接觸后7天出現(xiàn)感染癥狀，以皮膚型炭疽最常見。吸入大量炭疽芽孢(大于8000個)可引起吸入型炭疽，也稱肺炭疽。由于炭疽芽孢具有對外界環(huán)境極強(qiáng)的抵抗力，致污染可持續(xù)存在，在軍事上一直被列為是頭號生物戰(zhàn)劑之一。在一些國家曾生產(chǎn)并作為武器儲存，而今又成為恐怖襲擊選用劑，對人類造成新的更大的威脅。炭疽芽孢桿菌的抗原包括菌體抗原和芽孢抗原。炭疽芽孢桿菌的生存、增殖不需特殊條件設(shè)備及環(huán)境，在土壤中就可增殖，人工大量培養(yǎng)及使之變?yōu)檠挎呤秩菀?。由于芽孢獨特的生物學(xué)性狀和危害，對炭疽芽孢的快速定量檢測意義重大。本發(fā)明選擇炭疽芽孢作為產(chǎn)芽孢的細(xì)菌及其芽孢的代表建立懸浮芯片檢測模型。鼠疫耶爾森菌(/e"/z7/a/es"s)可引起動物疫源性烈性傳染病-鼠疫，其天然宿主是嚙齒類動物。鼠疫往往是由于接觸帶菌的嚙齒類動物或被染菌的蚤類嚇咬而發(fā)病。歷史上記載過三次鼠疫的世界性大流行，造成人類生命和財產(chǎn)的巨大損失。在我國鼠疫被列為曱類傳染病。作為一種烈性傳染病，鼠疫具有傳播快、病死率高等特點，是經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑。目前，以生物武器形式出現(xiàn)的鼠疫最有可能發(fā)生的是肺鼠疫，該病人間傳播更為迅速。鼠疫菌的快速檢測對控制鼠疫的擴(kuò)散蔓延至關(guān)重要。本發(fā)明選擇鼠疫菌作為細(xì)菌的代表建立檢測模型。蓖麻毒素(ricintoxin，以下簡稱ricin)是蓖麻籽中含有的一種高毒性的糖蛋白，蓖麻毒素經(jīng)呼吸道吸入、消化道攝入和肌肉注射均可致人中毒。人經(jīng)口致死量0.15-0.2g，靜脈注射致死量20mg，小鼠腹腔LD50約為3.Opg/kg。ricin毒性大，性質(zhì)穩(wěn)定，來源較廣，提取成本低廉。隨著多個恐怖組織和極端分子研制和使用蓖麻毒素的消息接連進(jìn)入媒體，這種致命的、毒性極強(qiáng)的生物毒素被美國等國列為最有可能被用做恐怖襲擊的生物恐怖因子。在蓖麻毒素的快速偵檢方面，美國、歐盟等國家一直十分重視，已建立了供實驗室和現(xiàn)場使用的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、化學(xué)分析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)以及膠體金免疫層析方法等；我國臺灣地區(qū)也建立了檢測蓖麻毒素的ELISA和膠體金免疫層析方法及其配套診斷試劑。建立蓖麻毒素的快速定量試劑具有重要現(xiàn)實意義。同時，本發(fā)明選擇ricin作為植物毒素的代表建立檢測模型。金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcalenterotoxinBSEB)是引起食物中毒的主要致病因素，也是重要的生物恐怖戰(zhàn)劑。SEB的檢測研究在平時和戰(zhàn)時都有重要意義。本發(fā)明選擇SEB作為細(xì)菌毒素的代表建立檢測模型。重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)引起本世紀(jì)第一種在全球^暴發(fā)的烈性傳染病，SARS引起的恐慌至今人們?nèi)杂洃洩q新。SARS-CoV為單股正鏈RNA病毒，屬巢狀病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬。根據(jù)血清型，冠狀病毒屬主要分為3個型，包括多種哺乳動物冠狀病毒和鳥感染性支氣管炎病毒。雖然2002年爆發(fā)的SARS已被成功控制，但由于病毒的變異及其高度的傳染性，SARS存在著再度復(fù)發(fā)的可能，因此對SARS的研究不容忽視。發(fā)明選擇SARS-CoV作為病毒的代表建立檢測模型。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(1iquidarray,liquidchip),是20世紀(jì)70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領(lǐng)域。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5jam，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機(jī)器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細(xì)管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發(fā)報告分子的顏色，記錄信號強(qiáng)弱以檢測待測物的含量。當(dāng)待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。再通過機(jī)器與計算機(jī)自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標(biāo)物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至^:十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應(yīng)等對反應(yīng)動力學(xué)的影響，同時利用激光檢測技術(shù)，大大提高了樣品檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復(fù)性好等特點。目前發(fā)展的懸浮芯片技術(shù)應(yīng)用于病原微生物和毒素的檢測研究主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優(yōu)化，以縮短4企測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮芯片是否能夠同時檢測多種類病原體，是否適合從粉末、液體等環(huán)境樣品中快速直接檢測，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。本發(fā)明選擇鼠疫菌、炭疽芽胞桿菌、SEB、ricin、SARS-CoV為代表病原體和生物威脅因子，建立包括細(xì)菌、細(xì)菌芽月包、病毒、細(xì)菌毒素、植物毒素在內(nèi)的幾種重要生物恐怖因子的多病原體蛋白懸浮芯片的復(fù)合檢測方法，評價其敏感性與特異性；并應(yīng)用于人工污染的包括如奶粉、面粉、淀粉、果珍等粉末樣品中的直接檢測，評價其在實際檢測中的適用性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種復(fù)合檢測不同種類病原體的蛋白質(zhì)懸浮芯片。本發(fā)明還提供一種復(fù)合檢測鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌芽孢、葡萄球菌腸毒素B(SEB)、蓖麻毒素(ricin)、重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)中的一種或多種病原體或生物恐怖因子的蛋白懸浮芯片-險測方法。本發(fā)明提供一種制備上述復(fù)合檢測鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞、SEB、ricin、SARS-CoV中的一種或多種病原體或生物恐怖因子的蛋白懸浮芯片的制備方法，包括不同編號的編碼微球、不同病原體的特異性捕獲抗體、生物素標(biāo)記的不同病原體的特異性檢測抗體、熒光染料鏈親和素—藻紅蛋白(SA-PE)及相關(guān)緩沖溶液。本發(fā)明還提供一種復(fù)合檢測不同種類病原體的蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測方法，其特征在于，該方法采用雙抗體夾心免疫學(xué)檢測才莫式，檢測過程中全部反應(yīng)可在96孔濾板上進(jìn)行也可在微量離心管中進(jìn)行。包括下列步驟(1)每孔加入含已包被目標(biāo)病原體捕獲抗體的編石馬孩i球工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入檢測樣品，孵育后清洗；(3)加入生物素化目標(biāo)病原體檢測抗體，孵育后清洗；(4)加入SA-PE,孵育后清洗，(5)加入檢測緩沖液后混勻，(6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值(平均熒光強(qiáng)度)并分析數(shù)據(jù)判定檢測結(jié)果。本發(fā)明人通過大量和深入的研究，開創(chuàng)性開發(fā)出本發(fā)明的一種復(fù)合檢測不同種類病原體的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其檢測方法，具有以下優(yōu)點(1)高通量、多種類病原體檢測；(2)蛋白質(zhì)懸浮芯片制備方法筒單、快速；(3)具有高敏感度和寬動態(tài)范圍；(4)對粉末狀環(huán)境樣品中目標(biāo)病原體的檢測具有很好的適用性；(5)具有高特異性；(6)為進(jìn)一步將所述蛋白懸浮芯片應(yīng)用于其他細(xì)菌、細(xì)菌芽孢、細(xì)菌毒素、植物毒素、病毒等建立技術(shù)模型。圖1:復(fù)合檢測方法的特異性測試結(jié)果1;X軸表示樣品編號，Y軸表示檢測項目，Z軸表示檢測萸光信號MFI。白色代表鼠疫菌檢測，斜紋代表炭疽芽孢檢測，橫紋代表蓖麻毒素檢測，灰色代表SEB檢測，網(wǎng)點代表SARS-CoV檢測。XI:空白(PB)，X2:ltfcfu/mL鼠疫菌，X3:105cfu/mL炭疽芽孢，X4:50ng/mLSEB,X5:蓖麻毒素100ng/mL，X6:200ng/mLSARS-CoV。為了圖示的視覺平衡，SARS-CoV的表示信號為實測MFI的1/5。圖2:復(fù)合檢測方法的特異性測試結(jié)果2示意圖；X軸表示樣品編號，Y軸表示檢測項目，Z軸表示檢測熒光信號MFI。系列圖案代表項目見圖注。X1:空白(PB)，X2:ltfcfu/mL炭疽芽孑包+50ng/mLSEB+100ng/mL蓖麻毒素+200ng/mLSARS"CoV,X3:105cfu/mL鼠疫菌+105cfu/ml^疽芽孢50ng/mLSEB+100ng/mL蓖麻毒素，X4:105cfu/mL鼠疫菌+105cfu/mL炭疽芽孢+50ng/mLSEB+200ng/mLSARS"CoV,X5:105cfu/mL鼠疫菌+50ng/mLSEB+100ng/mL蓖麻毒素+200ng/mLSARS-CoV，X6:105cfu/mL鼠疫菌+l()5cfu/mL炭疽芽孑包+100ng/mL荒8麻毒素+200ng/mLSARS"CoV。為了圖示的視覺平衡，SARS-CoV的表示信號為實測MFI的1/3。具體實施例方式本發(fā)明對涉及的復(fù)合檢測鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞、SEB、ricin、SARS-CoV的蛋白質(zhì)懸浮芯片、其制備方法、4企測方法通過下面的具體實施方式并模擬環(huán)境樣品檢測作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不以任何方式受這些具體實施方式的限定。一、材料1.抗原抗體表1蛋白質(zhì)懸浮芯片多元復(fù)合檢測體系中目標(biāo)分析物所涉及抗原抗體目標(biāo)分析物捕獲抗體檢測抗體鼠疫菌兔抗鼠疫F1抗原的抗體兔抗鼠疫F1抗原單抗炭疽芽孢羊抗炭疽芽孢兔抗炭疽芽孢SEB鼠抗SEB兔抗SEB蓖麻毒素兔抗蓖麻毒素A鼠抗蓖麻毒素SARS-CoV兔抗SARS-CoVN32兔抗SARS-CoVN132.相關(guān)緩沖液(1)0.03MPB緩沖液(pH7.2):2.83gNa2HP04,1.36g〖1^04定容至1L。(2)0.01MPB緩沖液(pH7.2):由0.03MPB緩沖液稀釋而成。(3)PBS緩沖液(pH7.4):NaCl137mmol/L;KC12.7mmol/L;Na2HP04lOmmol/L;KH2P042mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04。用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L。分裝后在15psi(1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過濾除菌，保存于室溫o(4)微球清洗液PBS(pH7.4)，0.05%TWEEN-20。(5)微球活化緩沖液IOOmMNaH2PO".3gNaH2P04，5NNaOH1.5mL，定容于250mL，pH6.2。(6)微球包被緩沖液0.05MMES，pH5.0:2.44gMES,5NNaOH0.15mL，定容于250mL。9(7)微球保存液PBS-TBN:PBS，0.1%BSA，0.02%TWEEN，0.05%疊氮化物，pH7.4。(8)孩t球封閉液PBS-BN:PBS，1%BSA，0.05%疊氮化物，pH7.4。(9)檢測緩沖液PBS,1°/。BSA,pH7.4。(10)抗體稀釋液0.01mmol/LPB(pH7.2)。(11)微球稀釋液:PBS，簡A,pH7.4。(12)樣品稀釋液0.01MPB，pH7.2。(13)生物素化抗體稀釋液PBS-TBN(PBS，0.1%BSA，0.02%TWEEN-20,0.05%NaN3,pH7.4)。(14)SA-PE稀釋液PBS(pH7.4),1%BSA。二、待測樣品的制備1.單組分分析樣品的制備鼠疫菌儲備液濃度為108cfu/mL，炭疽芽孢儲備液濃度為107cfu/mL,蓖麻毒素、SEB、SARS-CoVN蛋白的儲備液濃度均為lmg/mL。毒素和蛋白質(zhì)樣品在臨用前稀釋。菌懸液的濃度范圍為10Ll()Scfu/mL，芽孢的濃度范圍為102-107cfu/mL，毒素和蛋白質(zhì)的濃度范圍為lOpg/mL-5|ig/mL。待分析的細(xì)菌用PB稀釋成IO倍不同梯度，毒素及蛋白質(zhì)用PB稀釋成4倍不同梯度，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)。2.混合樣品的制備混合樣品包含炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB其中的兩種到五種，分別自相應(yīng)的儲備液用樣品稀釋液稀釋、混合配制?；旌蠘悠钒ú≡w多重測試的樣品，各種組分含量不同、比例不同，隨4幾組合。3.模擬污染樣品的制備分別將0.5g奶粉、玉米淀粉、小麥面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL樣品稀釋液(PB緩沖液)中，將不同濃度的炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB的其中一種或幾種，摻入到粉末樣品中，經(jīng)充分振搖混勻，靜置2h以上，使目標(biāo)分析物與模擬白色粉末充分吸附。再用脫脂棉、薄濾紙、厚濾紙、0.45pm濾膜濾紙過濾或4氐速離心(1000rpm，lmin)后，上清液作為待檢樣品進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測。104、盲樣的制備抽取制備的單分析物樣品、混合樣品和不同介質(zhì)中模擬污染樣品共46份，打亂順序和編號，作為盲樣進(jìn)行檢測。盲樣包括空白或其它干擾樣品8份，含測試物的樣品38份，其中樣品處理液中單因子分析物11份，混合樣品13份；模擬污染樣品14份(含5份混合樣品)。實施例l、蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備A、編碼微球的活4匕選取5種微球分別標(biāo)記鼠疫菌抗體(028號)、炭疽芽孢抗體(025號)、SEB抗體(043)、蓖麻毒素抗體(027)、SARS-CoVN蛋白抗體(044號)，取100juL(1.25x106個)編碼微球到1.5mL離心管中，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100pL的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100jaL的孩U求活化緩沖液，接著先加入10iaL新鮮配置的EDC(50mg/mL)，再加入10juL新鮮配置的50mg/mL的羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)，在室溫震搖20分鐘。加入150pL的PBS(pH7.4)，震蕩后，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100"的PBS(pH7.4)懸浮編碼微球。B、抗體包被編碼微球分別取各目標(biāo)檢測物捕獲抗體(如表1所示)各10jag加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩沖液定容至500/aL，室溫震搖2小時。14000g離心，小心吸出并棄去上清液。用500|aL的PBS緩沖液洗一次，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入250|aL的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入500jaL的孩t球保存液洗滌編碼微球，16000g離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150jaL的微球保存液懸浮編碼微球，于4。C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計數(shù)分別取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(O.10mm;1/400mm"在普通顯微鏡下計數(shù)。根據(jù)公式(每個大格數(shù)x104x稀釋倍數(shù)x體積(mL))計算微球數(shù)量。D、檢測抗體的生物素化配制濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標(biāo)記各目標(biāo)檢測物檢測抗體溶液(如表1所示)，將計算好體積的生物素加入到待標(biāo)記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分裝，-2(TC凍存?zhèn)溆??？贵w用量計算過程如下以標(biāo)記2mg/mL的IgG(分子量150，000)1mL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27ial。_2mgIgG1mmolIgG20mmoSBbtin,..1mlIgGx~-^——x-=0000266mmolBiot，n1mlIgG150,000mgIgG1mmolIgG1000■yl1_0.000266mmolBiotinx~^——^——^~x-=26.6BiotinReagentL10mmol其中，biotin為生物素。實施例2、目標(biāo)病原體的靈敏度與動態(tài)檢測范圍的改進(jìn)A.待測樣本制備分別將鼠疫菌儲備液(108cfU/mL)和炭疽芽孢儲備液(107cfU/mL)用PBIO倍倍比稀釋為系列濃度梯度樣品，蓖麻毒素、SEB、SARS-CoVN蛋白(儲備液lmg/mL)用PB4倍倍比稀釋為系列濃度梯度樣品。使鼠疫菌懸液的濃度范圍為1(y10ScfU/mL，炭疽芽孢的濃度范圍為102~107cfU/mL，蓖麻毒素、SEB、和SARS-CoVN蛋白質(zhì)的濃度范圍為1Opg/mL~5pg/mL。B.才羊品的檢測檢測過程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行，檢測過程如下(l傳孔加入50pL含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；(2)加入50pL檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；(3)加入50^L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；12(4)加入50pL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；(5)加入125pL的檢測緩沖液，經(jīng)振搖重懸混勻；(6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、目標(biāo)病原體岸企測靈敏度與檢測范圍的確定蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測方法的最低檢出限(LOD值)為檢測熒光強(qiáng)度臨界值(Cutoff)對應(yīng)的檢測物濃度。其中，Cutoff的定義是釆用空白對照樣品(Blank)焚光檢測信號MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即Cutoff值為=MFIBlank+3xSD。若檢測結(jié)果高于LOD對應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為目標(biāo)檢測物檢測結(jié)果陽性；若檢測結(jié)果低于LOD對應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為目標(biāo)檢測物檢測結(jié)果陰性。最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃度，即隨樣品濃度增加檢測所得MFI值開始進(jìn)入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測目標(biāo)病原體的靈敏度與動態(tài)檢測范圍，檢測結(jié)果如表3所示。表3蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測五種病原體的靈敏度分析物最低檢出限-險測范圍鼠疫67.5cfu/mL67.5-108cfu/mL炭疽芽孢4210cfu/mL4210-107cfu/mLSEB0.203ng/mL0.203-100852.Ing/mL蓖麻毒素29.Ing/mL29.1-1653.4ng/mLSARS-CoV4.86ng/mL4.86-25600ng/mL結(jié)論，本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片對上述五種病原體的檢測靈敏度和檢測范圍相對于ELISA方法有顯著改進(jìn)。實施例3、復(fù)合檢測目標(biāo)病原體的特異性測試在懸浮芯片多重檢測方法特異性實驗中，選用與目標(biāo)待測菌近緣的或環(huán)境常見的假結(jié)核菌、臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、覃狀芽孢桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、陰溝腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌等菌抹，以及BONT、fflVP24蛋白、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等13毒素、病毒和蛋白質(zhì)，考核所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片方法對樣品檢測的特異性。捕獲抗體工作液為五種編碼微球按工作濃度混合均勻的混合物；陽性檢測樣品分別為鼠疫菌1.6xl04cfU/mL、炭疽芽孢1.36xl04cfWmL、SEB75ng/mL、蓖麻毒素75ng/mL、SARS-CoVN蛋白256ng/mL。生物素化檢測抗體分別為①生物素化抗體稀釋液(blank),②Biotin-兔抗F1Ag2F6/1:1000稀釋，③Biotin-羊抗BA+170044/1:200稀釋，Biotin-RCA2/l:200稀釋，⑤Biotin-SEBpAb/1:200稀釋，⑥Biotin國兔抗SARS-COVN蛋白/1:200稀釋。表4蛋白質(zhì)懸浮芯片方法對不同菌和蛋白質(zhì)的測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>24胰蛋白胨通過特異性測試(檢測方法同實施例2),結(jié)果顯示(如表4所示)，在檢測鼠疫菌、炭疽芽孢、SEB、蓖麻毒素、SARS-CoV的系統(tǒng)中，假結(jié)核耶爾森菌、蠟樣芽胞桿菌及其芽孢、覃狀芽孢桿菌及其芽孢、枯草芽孢桿菌及其芽孢、巨大芽孢桿菌及其芽孢、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門菌、陰溝腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、禽流感病毒HA、禽流感病毒NH、AIDS病毒、酪蛋白、BSA、BONT、胰蛋白胨等MFI值與空白對照的MFI值均低于最低檢出限對應(yīng)MFI值，說明以上細(xì)菌、病毒、毒素及其它蛋白質(zhì)均不與目標(biāo)4企測物發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異性反應(yīng)。實驗僅發(fā)現(xiàn)檢測SEB時，與高濃度的金黃色葡萄球菌中毒性休克毒素(SEF或TSST-1)略有交叉反應(yīng)，但與其他病原體沒有交叉反應(yīng)和非特異性反應(yīng)。圖1實驗結(jié)果顯示，在多重沖企測體系中，加入目標(biāo)分析物所對應(yīng)的微球檢測信號明顯增高，其它微球熒光檢測信號沒有顯著增強(qiáng)，或者相對于自身的本底熒光信號而言沒有明顯增高。圖2實驗結(jié)果顯示，在多重檢測體系中，加入多種目標(biāo)分析物所對應(yīng)的相應(yīng)微球檢測信號均明顯增高，未加入目標(biāo)分析物對應(yīng)微球熒光4企測信號沒有顯著增強(qiáng)，或者相對于自身的本底熒光信號而言沒有明顯增高，說明捕獲抗體、檢測抗體與目標(biāo)檢測物特異性結(jié)合，捕獲抗體、檢測抗體與非目標(biāo)檢測物之間不存在非特異性結(jié)合、無交叉反應(yīng)。綜上特異性測試，證明各捕獲抗體與其它檢測抗體、各捕獲抗體與其它檢測物、各檢測抗體與其它檢測物之間均不存在交叉反應(yīng)，檢測具有很好的特異性。實施例4、"白色粉末"盲樣的檢測A.模擬污染"白色粉末"樣品的制備分別將0.5g奶粉、玉米淀粉、小麥面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL樣品稀釋液(PB緩沖液)中，將不同濃度的炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB的其中一種或幾種及空白樣品(樣品稀釋液)，摻入到粉末樣品中，經(jīng)充分振搖恩勻，靜置2h以上，使目標(biāo)分析物與模15擬白色粉末充分吸附。B.盲樣的制備抽取制備的單分析物樣品、混合樣品和不同介質(zhì)中模擬污染樣品共46份，打亂順序和編號，作為盲樣進(jìn)行檢測。盲樣包括空白或其它干擾樣品8份，含測試物的樣品38份，其中樣品處理液中單因子分析物11份，混合樣品13份；模擬污染樣品14份(含5份混合樣品)。C.盲樣的處理與檢測將待測樣品按0.1g/mL溶解粉末樣品，再用脫脂棉、薄濾紙、厚濾紙、0.45nm濾膜濾紙過濾或低速離心(1000rpm，lmin)后，上清液作為待檢樣品按照實施例2中方法進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測。表5蛋白質(zhì)懸浮芯片盲樣檢測結(jié)果編號盲樣樣本檢測結(jié)果鼠疫炭疽芽孢SEB蓖麻毒素SARS-CoV1BSA4mg/mL-----2奶粉添加SARS-CoVN蛋白320ng/mL----3炭疽芽孢1.36xl06dWmL-+--一4SEB25ng/mL--+-面粉添加SARS-CoVN蛋白320ng/mL----+6鼠疫菌1.36xl04cfti/mL+----速溶果珍添加鼠疫1.6xl()ScfU/mL+炭疽芽孢1.36xl05cfWmL+SEB150ng/mL+荒麻毒素100ng/mL+SARS-CoVN蛋白256ng/mL+++++8SARS-CoVN蛋白256ng/mL---—+9淀粉添加鼠疫1.6xl()Scfti/mL+炭疽芽孢1.36xl05cfWmL+SEB150ng/mL+荒麻毒素100ng/mL+SARS-CoVN蛋白256ng/mL+++++10SEB75ng/mL--+-一11PBS-----12蓖麻毒素75ng/mL---+-13鼠疫1.6xl(^cfli/mL+炭疽芽孢2.18xl()6cfti/mL+荒麻毒素75ng/mL+SARS-CoVN蛋白256ng/mL++-++16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*+:陽'性，-:陰'性檢測結(jié)果如表5所示，46個盲樣中的結(jié)果全部正確，充分證明了本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)懸浮芯片多元目標(biāo)檢測物的復(fù)合檢測方法可以快速、準(zhǔn)確、高效檢測出吸附于白色粉末樣品中的目標(biāo)檢測物，本方法對于炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB等病原體污染的"白色粉末"樣品的實際檢測工作具有很好的適用性。權(quán)利要求1、一種利用微球懸浮芯片復(fù)合檢測炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB多種類病原體中的一種或多種的檢測方法，其特征在于，檢測過程中全部反應(yīng)可在96孔濾板或者微量離心管中進(jìn)行，該方法包括下列步驟(1)向孔加入含已包被捕獲抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入待測樣品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化的檢測抗體，孵育后清洗；(4)加入SA-PE，孵育后清洗；(5)加入檢測緩沖液后混勻；(6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強(qiáng)度(FMI)數(shù)值并分析數(shù)據(jù)判定檢測結(jié)果。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于用于包被微球的捕獲抗體分別為鼠疫菌的捕獲抗體為抗鼠疫菌抗體；炭疽芽孢的捕獲抗體一抗炭疽芽孢抗體；SEB的捕獲抗體為抗SEB抗體抗；蓖麻毒素的捕獲抗體為抗蓖麻毒素A抗體；SARS-CoVN蛋白的捕獲抗體為抗SARS-CoVN32抗體。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于采用生物素標(biāo)記的檢測抗體分別為鼠疫菌的檢測抗體為抗鼠疫菌抗體；炭疽芽孢的檢測抗體為兔抗炭疽芽孢抗體；SEB的檢測抗體為抗SEB抗體；蓖麻毒素的檢測抗體為抗蓖麻毒素抗體；SARS-CoV的檢測抗體為抗SARS-CoVN13抗體。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于捕獲抗體與生物素標(biāo)記的檢測抗體組成雙抗夾心檢測體系進(jìn)行病原體4企測。5、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕獲抗體用量為10pg/1.25x106個編碼微球或20-40ng/250O5000個微球/測試。6、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的標(biāo)記檢測抗體的生物素為羧基活性的生物素。7、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測抗體工作液稀釋倍數(shù)為1:50-1:5000稀釋。8、一種復(fù)合檢測炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB多種類病原體中的一種或多種的蛋白質(zhì)微球懸浮芯片，其特征在于包括編碼微球、包被的捕獲抗體、生物素標(biāo)記的編碼微球、鏈親和素-藻紅蛋白；用于包被微球的捕獲抗體分別為鼠疫菌的捕獲抗體為兔抗鼠疫F1抗原抗體；炭疽芽孢的捕獲抗體一羊抗炭疽芽孢抗體；SEB的捕獲抗體為兔抗SEB單抗；蓖麻毒素的捕獲抗體為兔抗蓖麻毒素A抗體；SARS-CoVN蛋白的捕獲抗體為兔抗SARS-CoVN32抗體。9、權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)微球懸浮芯片，其特征在于用生物素標(biāo)記的檢測抗體分別為鼠疫菌的檢測抗體為兔抗鼠疫F1抗原單抗2F6;炭疽芽孢的檢測抗體為兔抗炭疽芽孢抗體；SEB的檢測抗體為兔抗SEB多抗；蓖麻毒素的檢測抗體為蓖麻毒素單抗RCA;SARS-CoV的檢測抗體為SARS-CoVN13抗體。全文摘要本發(fā)明涉及一種復(fù)合檢測多種類病原體的蛋白質(zhì)懸浮芯片制備及其檢測方法，所述的病原體包括鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)、炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)、葡萄球菌腸毒素B(staphylococcalenterotoxinB，SEB)、蓖麻毒素(ricin)和重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)。通過大量試驗證明蛋白質(zhì)懸浮芯片制備方法簡便、快捷；檢測效果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、檢測范圍寬、特異性強(qiáng)；對于實際環(huán)境樣品適用性好。同時本發(fā)明為建立多功能、多指標(biāo)、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化的病原體復(fù)合檢測要求奠定了基礎(chǔ)。文檔編號G01N21/76GK101498733SQ200910080258公開日2009年8月5日申請日期2009年3月17日優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日發(fā)明者孫肖紅,張曉龍,宇楊,楊瑞馥,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院