專利名稱：一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種總菌數(shù)測定方法，具體涉及一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定 方法，該方法能快速檢測食品加工企業(yè)各個車間設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)。
背景技術(shù)：
目前，國標(biāo)法對生產(chǎn)設(shè)備上微生物總量的估計采用擦拭法、瓊脂覆蓋法或接觸板法。 擦拭法通過人工擦拭設(shè)備表面將菌體采集而后選用合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，瓊脂覆蓋法和 接觸板法則是通過培養(yǎng)基與生產(chǎn)設(shè)備的直接接觸對菌體進(jìn)行培養(yǎng)。但是，擦拭法因擦拭方 式的不同及取樣人員用力強(qiáng)度的差異造成結(jié)果不夠準(zhǔn)確，影響結(jié)果的可比性。同時，由于 細(xì)菌以生物被膜這種特殊的形式生長于設(shè)備表面，且難于徹底剝離，人工擦拭的方法不足 以將生物被膜中的絕大多數(shù)微生物收集到。甚至可能因為棉拭本身吸附部分微生物，從而 降低了該方法的檢測靈敏度。瓊脂覆蓋法和接觸板法由于與設(shè)備表面接觸時間短、作用力 弱，難以將生物被膜內(nèi)包裹的各種菌吸附到培養(yǎng)基上，更不能準(zhǔn)確反映實(shí)際菌量，造成較 大誤差。這三種方法不能準(zhǔn)確完全的反應(yīng)生產(chǎn)中設(shè)備表面的總菌數(shù)狀況。除此之外，傳統(tǒng) 方法需要對菌體進(jìn)行培養(yǎng)，耗時較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點(diǎn)，提供一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方 法，這種方法無需培養(yǎng)，短時間內(nèi)即可測出設(shè)備表面的總菌數(shù)，并且可以區(qū)分出活菌與死 菌，結(jié)果更準(zhǔn)確，檢測效率更高。
一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方法，其技術(shù)方案如下將內(nèi)徑為1.60-1.96 cm的橡膠圈下沿直接與平坦的設(shè)備表面接觸，橡膠圈上再放置一個與其內(nèi)徑相同的圓柱形 硬塑料管，人工向下壓塑料管，使橡膠圈、設(shè)備表面和硬塑料管形成一個密閉的可以盛裝 液體的容器，向容器內(nèi)部注入含0.5-1.5 %吐溫-80的無菌PBS緩沖液5-10 mL，緩沖液pH 是7.35至7.40，將超聲波細(xì)胞破碎儀的變幅桿插入液面以下0.5-1.3 cm，其中，處理功率 80-120 W，處理時間10-20 s，溫度為室溫，將菌懸液充分吸出，置于離心管中，滴入染色 劑500-1000 ^L，染色3-5min后，收集于滅菌注射器中，過濾，將菌體富集于黑色的聚碳 酸酯膜上，用無菌PBS緩沖液清洗2-3次，緩沖液pH是7.4，室溫晾干后，于熒光顯微鏡 觀察，在顯微鏡下隨機(jī)取20-50個視野，拍照，分別計算照片中的菌數(shù)并求平均值，經(jīng)換
3算得到生產(chǎn)設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)。
所述染色劑為吖啶橙(Acridine Orange， AO)和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)的
混合物或DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)和CTC (5-氰基-2， 3-聯(lián)甲苯氯化四氮唑.的
混合物。
所述黑色的聚碳酸酯膜的孔徑為0.22 um。
所述換算方法為設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)(個/cm2)=[(計數(shù)平均值/顯微鏡視野面 積)x濾膜總面積]/取樣面積。
所述超聲波細(xì)胞破碎儀為便攜式超聲波細(xì)胞破碎儀。
本發(fā)明的有益效果是可以在準(zhǔn)確測定食品企業(yè)生產(chǎn)車間設(shè)備表面的微生物總量的同 時，縮短檢測時間，及時反映生產(chǎn)加工鏈上的微生物生長情況，為保證及時有效的殺菌消 毒提供依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過以下具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。實(shí)施例中使用的超聲波細(xì)胞破碎儀均為 德國Bandelin超聲波破碎儀，型號HD2070;所用黑色的聚碳酸酯膜的孔徑為0.22 um， 直徑25mm，購自美國MILLIPORE。
磷酸緩沖液(PBS)的配制為137 mmol/LNaCl; 2.7 mmol/L KC1; 10 mmol/LNa2HP04; 2 mmol/L KH2P04;以HC1調(diào)節(jié)溶液pH。 實(shí)施例l
將內(nèi)徑為1.60 cm橡膠圈(取樣面積為2 cm2)置于生產(chǎn)設(shè)備表面，要求設(shè)備表面平坦， 并且表面上部有充足的空間放置超聲波變幅桿，如傳送帶、操作臺面等。橡膠圈上再放置 一個與其內(nèi)徑相同的圓錐形硬塑料管，人工豎直向下壓塑料管，使橡膠圈、設(shè)備表面和硬 塑料管形成一個密閉的可以盛裝液體的容器，向容器內(nèi)部注入5ml， pH為7.39，含0.5% 吐溫-80的無菌PBS緩沖液，吐溫-80起到促進(jìn)微生物細(xì)胞懸浮的作用，將超聲波細(xì)胞破碎 儀的變幅桿插入，使其浸入液面下0.5 cm。打開超聲波開關(guān)，以保證菌體剝離最多，損失 最少為原則進(jìn)行超聲波處理。處理功率120W，處理時間16s，保持溫度為室溫,以免因溫 度過高導(dǎo)致微生物死亡。用滅菌移液槍將處理液充分吸出，置于離心管中，滴入濃度為1 g/L 吖啶橙-0.5g/L碘化丙啶混合染色液500 pL，染色5min，吸入至滅菌注射器中，過濾，將 菌體富集于孔徑為0.22 u m ,面積為490.6 mm2的黑色的聚碳酸酯膜上。用pH為7.4的 無菌PBS緩沖液清洗2次，室溫晾干后，于熒光顯微鏡觀察。在顯微鏡下隨機(jī)取40個視 野，拍照，應(yīng)用下述方法對生產(chǎn)設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)進(jìn)行換算。換算方法如下設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)(個/cm2)=[(計數(shù)平均值/顯微鏡視野面積)x濾膜總面積]/取樣 面積，
其中，計數(shù)平均值=113.3個/視野；顯微鏡視野面積=23121.9 ym2;濾膜總面積=490.6 mm2;取樣面積=2 cm2;得到的總菌數(shù)為1.20x 106個/cm2 。 實(shí)施例2
將內(nèi)徑為1.96cm橡膠圈(取樣面積為3 cm2)置于生產(chǎn)設(shè)備表面，要求設(shè)備表面平坦， 并且表面上部有充足的空間放置超聲波變幅桿，如傳送帶、操作臺面等。橡膠圈上再放置 一個與其內(nèi)徑相同的圓錐形硬塑料管，使其上端直徑小于超聲波換能器。將超聲波細(xì)胞破
碎儀的變幅桿插入后，使換能器與硬塑料管接觸，人工向下壓換能器使塑料管下端擠壓橡 膠圈下沿與設(shè)備表面緊密接觸，形成一個密閉的可以盛裝液體的容器。向容器內(nèi)部注入10 ml含1%吐溫-80的，pH為7.37無菌PBS緩沖液，吐溫-80起到促進(jìn)微生物細(xì)胞懸浮的作 用，將超聲波細(xì)胞破碎儀的變幅桿插入，使其浸入液面下1.0cm。打開超聲波開關(guān)，以保 證菌體剝離最多，損失最少為原則進(jìn)行超聲波處理。處理功率80W，處理時間10s，保持 溫度為室溫，以免因溫度過高導(dǎo)致微生物死亡。用滅菌移液槍將處理液充分吸出，置于離 心管中，滴入濃度為1 g/L吖啶橙-0.5 g/L碘化丙啶混合染色液1000 ^L，染色3min，吸入 至滅菌注射器中，過濾，將菌體富集于孔徑為0.22 ix m ，面積為4卯.6rm^的黑色的聚碳 酸酯膜上。用pH為7.4的無菌的PBS緩沖液清洗3次，室溫晾干后，于熒光顯微鏡觀察。 在顯微鏡下隨機(jī)取20個視野，拍照，應(yīng)用下述方法對生產(chǎn)設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)進(jìn) 行換算。換算方法如下設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)(個/cm2)=[(計數(shù)平均值/顯微鏡視 野面積)x濾膜總面積]/取樣面積。
其中，計數(shù)平均值=26.3個/視野；顯微鏡視野面積=23121.9 u m2;濾膜總面積=490.6 mm2;取樣面積=3 cm2。得到的總菌數(shù)為1.86x10 5個/cm 2。 實(shí)施例3
將內(nèi)徑為1.96cm橡膠圈(取樣面積為3 cm2)置于生產(chǎn)設(shè)備表面，要求設(shè)備表面平坦， 并且表面上部有充足的空間放置超聲波變幅桿，如傳送帶、操作臺面等。橡膠圈上再放置 一個與其內(nèi)徑相同的圓柱形硬塑料管，人工向下壓塑料管，使橡膠圈、設(shè)備表面和硬塑料 管形成一個密閉的可以盛裝液體的容器，向容器內(nèi)部注入10 ml含1%吐溫-80， pH為7.37 無菌PBS緩沖液，吐溫-80起到促進(jìn)微生物細(xì)胞懸浮的作用，將超聲波細(xì)胞破碎儀的變幅 桿插入，使其浸入液面下1.3cm。打開超聲波開關(guān)，以保證菌體剝離最多，損失最少為原 則進(jìn)行超聲波處理。處理功率100W，處理時間20s，保持溫度為室溫，以免因溫度過高導(dǎo)致微生物死亡。用滅菌移液槍將處理液充分吸出，置于離心管中，滴入濃度為1 g/L吖 啶橙-0.5g/L碘化丙啶混合染色液lOOOpL，染色5min，吸入至滅菌注射器中，過濾，將菌 體富集于孔徑0.22 y m ，面積為490.6 mm2的黑色的聚碳酸酯膜上。用pH為7.4的無菌 的PBS緩沖液清洗3次，室溫晾干后，于熒光顯微鏡觀察。在顯微鏡下隨機(jī)取40個視野， 拍照，應(yīng)用下述方法對生產(chǎn)設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)進(jìn)行換算。換算方法如下設(shè)備表 面總菌數(shù)(個/cm2)=[(計數(shù)平均值/顯微鏡視野面積)x濾膜總面積]/取樣面積。
其中，計數(shù)平均值=38.9個/視野；顯微鏡視野面積=23121.9 u m2;濾膜總面積=490.6 mm2;取樣面積=3 cm2。設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)為2.75><105個/cm 2。 實(shí)施例4
將內(nèi)徑為1.78cm橡膠圈(取樣面積為2.5cm2)置于生產(chǎn)設(shè)備表面，要求設(shè)備表面平 坦，并且表面上部有充足的空間放置超聲波變幅桿，如傳送帶、操作臺面等。橡膠圈上再 放置一個與其內(nèi)徑相同的圓柱形硬塑料管，人工向下壓塑料管，使橡膠圈、設(shè)備表面和硬 塑料管形成一個密閉的可以盛裝液體的容器，向容器內(nèi)部注入8ml含1.5%吐溫-80的，pH 為7.36無菌PBS緩沖液，吐溫-80起到促進(jìn)微生物細(xì)胞懸浮的作用，將超聲波細(xì)胞破碎儀 的變幅桿插入，使其浸入液面下1.2 011。打開超聲波開關(guān)，以保證菌體剝離最多，損失最 少為原則進(jìn)行超聲波處理。處理功率120W，處理時間14 s，保持溫度為室溫，以免因溫 度過高導(dǎo)致微生物死亡。用滅菌移液槍將處理液充分吸出，置于離心管中，滴入濃度為1 g/L 吖啶橙-0.5 g/L碘化丙啶混合染色液800 pL，染色4min，吸入至滅菌注射器中，過濾，將 菌體富集于孔徑為0.22 um ，面積為490.6 mm2的黑色的聚碳酸酯膜上。用pH為7.4的 無菌的PBS緩沖液清洗2次，室溫晾干后，于熒光顯微鏡觀察。在顯微鏡下隨機(jī)取40個 視野，拍照，應(yīng)用下述方法對生產(chǎn)設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)進(jìn)行換算。換算方法如下 設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)(個/ cm2)=[(計數(shù)平均值/顯微鏡視野面積)x濾膜總面積]/
取樣面積。
其中，計數(shù)平均值=77.8個/視野；顯微鏡視野面積=23121.9 w m2;濾膜總面積=490.6 mm2;取樣面積=2.5 cm2。得到的總菌數(shù)為6.61x105個/cm2。
權(quán)利要求
1、一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方法，其特征在于將內(nèi)徑為1.60-1.96cm的橡膠圈下沿直接與平坦的設(shè)備表面接觸，橡膠圈上再放置一個與其內(nèi)徑相同的圓柱形硬塑料管，人工向下壓塑料管，使橡膠圈、設(shè)備表面和硬塑料管形成一個密閉的可以盛裝液體的容器，向容器內(nèi)部注入含0.5-1.5％吐溫-80的無菌PBS緩沖液5-10mL，緩沖液pH是7.35至7.40，將超聲波細(xì)胞破碎儀的變幅桿插入液面以下0.5-1.3cm，其中，處理功率80-120W，處理時間10-20s，溫度為室溫，將菌懸液充分吸出，置于離心管中，滴入染色劑500-1000μL，染色3-5min后，收集于滅菌注射器中，過濾，將菌體富集于黑色的聚碳酸酯膜上，用無菌PBS緩沖液清洗2-3次，緩沖液pH是7.4，室溫晾干后，于熒光顯微鏡觀察，在顯微鏡下隨機(jī)取20-50個視野，拍照，分別計算照片中的菌數(shù)并求平均值，經(jīng)換算得到生產(chǎn)設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方法，其特征在于 所述染色劑為吖啶橙和碘化丙啶的混合物或DAPI和CTC的混合物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方法，其特征在于 所述黑色的聚碳酸酯膜的孔徑為0.22 um。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方法，其特征在于 所述換算方法為設(shè)備表面單位面積的總菌數(shù)=[(計數(shù)平均值/顯微鏡視野面積)x濾膜總面 積]/取樣面積。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于超聲波及熒光觀察的總菌數(shù)測定方法，屬于食品微生物檢測領(lǐng)域。該方法用一定尺寸的圓形橡膠圈與設(shè)備表面組合成密封容器，以超聲波空化效應(yīng)對設(shè)備表面的生物被膜進(jìn)行取樣，熒光染色后過濾，顯微鏡下拍照計數(shù)。此法用于對食品生產(chǎn)車間內(nèi)加工設(shè)備表面總菌數(shù)的測定，誤差小，耗時短，為及時有效的殺菌消毒提供依據(jù)。
文檔編號G01N21/77GK101482512SQ20091007803
公開日2009年7月15日 申請日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者彤 劉, 李春雷, 楊葆華, 陳晶瑜, 韓北忠 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)