專利名稱：Apex1用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl 的應(yīng)用，更具體地說，涉及DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl作為肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分 子標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)第四位常見的惡性腫瘤，我國第二位常見惡性腫瘤，每年 大約有250，000名患者死于肝細(xì)胞癌。肝細(xì)胞癌惡性程度高，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，而 且早期診斷較困難，往往延誤了最佳治療時(shí)期。西方發(fā)達(dá)國家肝癌的發(fā)病率較低，國際上對(duì) 肝癌的基礎(chǔ)研究仍較為薄弱，而我國是肝癌高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且發(fā) 病年齡構(gòu)成年輕化，每年用于肝癌治療的醫(yī)療支出大為增加，肝癌成了嚴(yán)重危害我國人民 生命財(cái)產(chǎn)安全的頭號(hào)敵人，并且是影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一個(gè)重要因素，加大力度進(jìn)行我國 肝癌的基礎(chǔ)研究具有戰(zhàn)略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關(guān)基因是目前肝癌基礎(chǔ)研究中的 前沿課題。到目前為止，已有不下20種的基因異常表達(dá)被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但已 確定的肝癌相關(guān)基因在肝癌中的異常表達(dá)率并不高，肝癌的發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，肝癌 的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統(tǒng)的肝癌手術(shù)加化療以及近年來配合使用的多種基因 治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關(guān)基因、尤其是肝癌高 表達(dá)基因?qū)τ谔接懜伟┑陌l(fā)病機(jī)制具有重要意義。因此，研究和開發(fā)在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白質(zhì)具有重要意義，尋找 新的在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白質(zhì)也具有迫切需要性。DNA 脫嘌呤 / 脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶(DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase, EC4.2.99. 18, Apurinic-apyrimidinic endonuclease 1, AP endonuclease 1，APE nuclease, APE, APEN, APEXl，APE, APX, HAPl，REF-I，REFl，REDOX FACTOR 1)的NCBI的登錄號(hào)為NP_001632，Swissprot登錄號(hào)為P27695，IPI號(hào)為 IPI00215911. 3 (human3. 28version)。已經(jīng)有大量的研究表明DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂 解酶APEXl與很多癌癥有關(guān)。根據(jù)現(xiàn)有研究，在大部分癌癥(例如，生殖細(xì)胞癌、前列腺癌、 卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等)中，APEXl在癌組織中高表達(dá)；而在有些癌癥(例如結(jié)腸腺瘤和 結(jié)腸癌)中，APEXl的表達(dá)水平不變，但其細(xì)胞定位發(fā)生了變化。Di Mas等發(fā)現(xiàn)DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的亞細(xì)胞定位的變化 可以用于人類肝細(xì)胞癌的預(yù)后診斷(Subcellular localization of APEXl/Ref-1 in human hepatocellularcarcinoma:possible prognostic significance. Mol Med. 2007 ； 13(1-2) 89-96)。但現(xiàn)有技術(shù)中尚未見到有關(guān)于采用DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá) 量作為人類肝細(xì)胞癌標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
通過篩選在人類肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，本申請(qǐng)的 發(fā)明人找到了一種在人類肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(在 癌組織中上調(diào)表達(dá))，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl。免疫印跡實(shí)驗(yàn) 證實(shí)，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的確在肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在 差異表達(dá)(在癌組織中表達(dá)上調(diào))。利用人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株IfepG2和人正常肝細(xì)胞株L02 進(jìn)行的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，證明DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在這兩種細(xì)胞株間存在 差異表達(dá)(在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H印G2中表達(dá)上調(diào))。通過對(duì)62對(duì)人肝細(xì)胞癌的癌組織與 癌旁組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在 人類肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)(在癌組織中表達(dá)上調(diào))。基于DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá)量與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性，因此， APEXl可以作為一種蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物，并根據(jù)其在肝細(xì)胞中的表達(dá)量以確定患者是否患 有肝細(xì)胞癌。相應(yīng)的，特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體，包括各種抗 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其能夠用于檢測(cè) DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá)量，因而可以用于檢測(cè)肝細(xì)胞癌，或者用于制 備檢測(cè)肝細(xì)胞癌的制劑或試劑盒。因此，本發(fā)明的首要目的在于，提供一種DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的 應(yīng)用，以用于肝細(xì)胞癌的檢測(cè)，特別是肝細(xì)胞癌的中早期檢測(cè)。本發(fā)明提供的應(yīng)用為用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記，該檢測(cè)是檢測(cè)APEXl 在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明，所述檢測(cè)是檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中是否均存在上調(diào)表達(dá)。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的 抗體的應(yīng)用。本發(fā)明提供的抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體的應(yīng)用為用于制備 檢測(cè)肝細(xì)胞癌的制劑，該檢測(cè)是檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量。本發(fā)明提供的抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體的應(yīng)用為用于制備 檢測(cè)肝細(xì)胞癌的試劑盒，該檢測(cè)是檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明，抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體包括單克隆抗體和 多克隆抗體。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種體外檢測(cè)肝組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn) 裂解酶APEXl的表達(dá)是否異常的方法。本發(fā)明提供的方法為用特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體檢 測(cè)待測(cè)肝組織細(xì)胞中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的數(shù)量，并與正常肝組織中的 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的數(shù)量進(jìn)行比較。


圖1為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道 1-6為肝細(xì)胞癌組織的檢測(cè)結(jié)果，泳道1’ _6’為與泳道1-6對(duì)應(yīng)的癌旁組織的檢測(cè)結(jié)果。圖2為對(duì)圖1的免疫印跡圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)分布圖，其中，HCC為肝細(xì)胞癌患者的癌組織，non-HCC為癌旁組織。圖3為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，Al為 H印G2細(xì)胞中APEXl的分布情況，A2為H印G2的細(xì)胞核，A3為Al和A2的疊加圖，Bl為L(zhǎng)02 細(xì)胞中APEXl的分布情況，B2為L(zhǎng)02的細(xì)胞核，B3為Bl和B2的疊加圖。圖4為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A 為肝細(xì)胞癌的癌組織的檢測(cè)結(jié)果，B為癌旁組織的檢測(cè)結(jié)果，物鏡放大倍數(shù)為20倍。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，尿素、3-[(3_膽酰胺丙基)_ 二乙銨]-1-丙磺酸 (CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三(羥甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙 酰胺(IAA)購自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-13C6,98% )購自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；透 析胎牛血清購自Gibco公司；D9785細(xì)胞培養(yǎng)粉末、β -巰基乙醇、L-GlruL-Lys和L-Met購 自 Sigma 公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencing grade)購自 Promega 公司；SCX 柱禾Π SAX 柱以及PH緩沖液試劑盒購自Column Technology公司；!fepG2細(xì)胞株和L02細(xì)胞株購自中 國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)和細(xì)胞研究所的細(xì)胞庫。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的溶液/培養(yǎng)基配方如下不含谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基5%透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺酰氟 (PMSF)，ImM EDTA,苯甲異惡唑青霉素25mg/mL，慶大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素 100mg/mL,兩性霉素 B 0. 25mg/mL,制霉菌素 50U/mL。裂解液8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris 和 65mmol/L DTT。裂解緩沖液8mol/L尿素，40mmol/L Tris, 65mmol/L DTT。TBST =Tris 2. 42g/L，氯化鈉 8g/L, Tween-20 lml/L，用 HCl 調(diào)節(jié) pH 到 7. 6。本申請(qǐng)的發(fā)明人用非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation, NESP)制備了肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)樣品，并采用CDIT技術(shù)結(jié)合溶液內(nèi)酶 解及陰陽多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)其中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定并 比較其表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌組織中上調(diào)表 達(dá)，另外，免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)均證明DNA脫嘌呤/脫嘧啶位 點(diǎn)裂解酶APEXl的確在肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在差異表達(dá)。實(shí)施例1、肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品的制備從東方肝膽外科醫(yī)院獲取5例肝細(xì)胞癌患者的癌組織及癌旁組織，該5例患者，均 由2名病理科醫(yī)生確診，患有肝細(xì)胞癌，5例患者的病理資料如表1所示。表1、5例肝細(xì)胞癌患者的病理資料
以非酶解樣品制備法制備上述5例患者的肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣 品(所用癌組織及癌旁組織樣品均為取自同一肝細(xì)胞癌患者的成對(duì)樣品)，具體過程如下手術(shù)切除的新鮮組織塊迅速置于冰上，快速切成幾個(gè)肉眼可見、無壞死區(qū)域的小 塊。用預(yù)冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌組織小塊數(shù)次后，在液氮中快速研磨 成細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞沉淀分別溶于裂解液中，然后于冰浴條件下，使用超聲細(xì)胞破碎儀 (JY92-2D，寧波新芝科器研究所)間歇超聲破碎2min后，于15000r/min、4°C離心lh，取上 清，以改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產(chǎn)品說明書)進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量。實(shí)施例2、HepG2和L0213C標(biāo)記的細(xì)胞的培養(yǎng)和樣品制備在含有13C標(biāo)記的CLM-2262L_Leu，10%透析胎牛血清，L_Gln，L-Lys以及L-Met的 D9785培養(yǎng)基的6cr的培養(yǎng)皿中分別培養(yǎng)H印G2或L02細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)到6代后，將H印G2細(xì)胞或L02細(xì)胞轉(zhuǎn)移到IOcm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，用4°C預(yù)冷的PBS洗三遍，加入裂解液進(jìn)行裂解。然 后用刮刀將這兩種13C標(biāo)記的細(xì)胞分別刮下收集，冰浴超聲破碎，15000g離心lh，取上清，用 改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產(chǎn)品說明書)定量其總蛋白質(zhì)含量。實(shí)施例3、癌組織及癌旁組織的差異表汰蛋白的篩誅采用CDIT 技術(shù)(參照 Yasushi Ishihama et al. Nat Biotechnol. 2005 ；23 (5) 617-621)結(jié)合溶液內(nèi)酶解技術(shù)(參照 William Μ. Old et al. Mol Cell Proteomics. 2005 ； 4:1487-1502)與陰陽多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(參照J(rèn)ie Dai et al. J Proteome Res. 2007 ；6(1) 250-262)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的篩選，具體過程如下取實(shí)施例1中獲得的5對(duì)肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品各lOOug，分別將5 例肝細(xì)胞癌組織蛋白質(zhì)樣品以及5例肝細(xì)胞癌的癌旁組織樣品進(jìn)行混合，得到500ug癌組 織蛋白質(zhì)樣品和500ug癌旁組織蛋白質(zhì)樣品。取實(shí)施例2中13C標(biāo)記的H印G2和L02細(xì)胞的蛋白質(zhì)樣品，將二者等比例混合作為內(nèi)標(biāo)。取500ug的肝細(xì)胞癌的癌組織或癌旁組織蛋白質(zhì)樣品分別與500ug13C標(biāo)記的內(nèi)標(biāo) 混合，得到兩種組織_細(xì)胞混合蛋白質(zhì)樣品各lmg。分別向混合蛋白質(zhì)樣品中加入裂解緩沖液至總體積ΙΟΟμ 1，再加入Sul的IM DTT，混勻后37°C反應(yīng)2小時(shí)，然后加入20μ 1的IM ΙΑΑ，混勻后室溫避光反應(yīng)45分鐘。
然后用4倍體積的_20°C預(yù)冷的丙酮進(jìn)行沉淀，_20°C反應(yīng)至少4小時(shí)。25000g離 心45分鐘，去上清，加入50mmol/L的碳酸氫銨200 μ 1，再加入20 μ g胰蛋白酶(蛋白質(zhì)和 胰蛋白酶的比例為50 1)，37°C酶解反應(yīng)4小時(shí)后，補(bǔ)加胰蛋白酶至總蛋白質(zhì)和胰蛋白酶 比例為25 1，酶解過夜至總酶解時(shí)間16小時(shí)。酶解完成后用MilliporelOKD孔徑大小的 超濾膜超濾，收取濾過液，真空冷凍干燥。酶解后的每份肽段混合物首先用SCX/SAX柱進(jìn)行分析，然后用完全自動(dòng)化的多維 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀LTQTM0rbitrapTM(購自Thermo Firmigan公司)進(jìn)行分析，得到的原始 數(shù)據(jù)采用SEQUEST軟件(Thermo Finnigan公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，并采用Census定量分 析軟件(http://fields, scripps. edu/census/index. php)對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分 析，定量結(jié)果如表2和表3所示。表2、肝細(xì)胞癌組織/13C標(biāo)記細(xì)胞含有定量信息肽段的定量結(jié)果 表3、肝細(xì)胞癌的癌旁組織/13C標(biāo)記細(xì)胞含有定量信息肽段的定量結(jié)果 根據(jù)表2和表3的結(jié)果，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌組織 /13C標(biāo)記細(xì)胞和癌旁組織/13C標(biāo)記細(xì)胞中的定量結(jié)果分別為1. 802481252和0. 687241904， 在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)2. 5倍以上，肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，其中，DNA脫嘌呤/ 脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌組織/13C標(biāo)記細(xì)胞中有3條非重復(fù)肽段(共鑒定到9 次)包含定量信息，而在癌旁組織/13C標(biāo)記細(xì)胞中有3條非重復(fù)肽段(共鑒定到18次)包 含定量信息。實(shí)施例4、DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的驗(yàn)證取6對(duì)NESP法制備的肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織的蛋白質(zhì)樣品，其病理資料如表4所示。表4、6例肝細(xì)胞癌標(biāo)本的病理資料 使用購買的抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl抗體對(duì)上述6對(duì)肝細(xì)胞癌組 織及相應(yīng)的癌旁組織的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行免疫印跡分析，過程如下每個(gè)樣品取IOyg蛋白質(zhì)樣品，用12% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(購自 GEHealthcare 公司)上；一抗使用鼠抗人DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEX 1單克隆抗體(購自 LifeSpanBiosciences公司，1 1000)，4°C孵育過夜，用TBST洗滌三次，每次5分鐘；二抗為抗鼠抗體(購自Santa Cruz公司，1 10000)，室溫孵育1小時(shí)，再用TBST 洗滌三次，每次10分鐘；加入ECL plus試劑(購自GE Healthcare公司)，反應(yīng)5分鐘，X-光片曝光檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，然后對(duì)圖1的免疫印跡圖譜采用Gel-Pro Analyzer凝膠定 量分析軟件(MediaCybemetic公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出蛋白質(zhì)表達(dá)量的相對(duì)分布圖，結(jié)果 如圖2所示。圖1結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的雜交條 帶的濃度都明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，另外，肝細(xì)胞癌組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解 酶APEXl的剪切體雜交條帶的濃度(主條帶下的次條帶)也明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，該 剪切體參與線粒體DNA的修復(fù)。而由于癌細(xì)胞中線粒體DNA遭受活性氧基團(tuán)的損傷的程度 高，因此APEXl的剪切體濃度上升，且HCC和non-HCC在APEXl主條帶下的條帶的濃度變化 是不同的，即APEXl的剪切的變化與HCC是相關(guān)的。圖2結(jié)果顯示，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá) 量均明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，平均比值為1. 955，P值(配對(duì)t檢驗(yàn))為0. 001583。根據(jù)圖1和圖2的結(jié)果，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌的癌 組織中存在高表達(dá)，該結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致。選取H印G2細(xì)胞(人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株)和L02細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞株)進(jìn)行免疫 熒光實(shí)驗(yàn)，過程如下
在圓形蓋玻片上，用含10%透析胎牛血清的DMEM培養(yǎng)L02細(xì)胞和H印G2細(xì)胞；
PBS洗滌兩次后，_20°C預(yù)冷的100%丙酮固定；PBS洗滌兩次，5%脫脂牛奶封閉30分鐘；加入鼠抗人DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl單克隆抗體(購自 LifeSpanBiosciences公司，1 30封閉液稀釋)，室溫孵育lh, TBST洗3遍，每次7分鐘；加入熒光染料Alexa 488標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購自Molecular Probes公司， 1 300封閉液稀釋)，室溫孵育45分鐘，TBST洗3遍，每次7分鐘；加入DAPI溶液(購自Signa公司，1 1000雙蒸水稀釋)，孵育1分鐘，PBS洗10分鐘；封片，4 °C避光保存。使用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)圖3結(jié)果，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)水 平明顯高于其在L02細(xì)胞中的表達(dá)水平，這與從組織中得到的結(jié)果相一致。為了進(jìn)一步證實(shí)DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組 織之間的表達(dá)差異，隨機(jī)選取62對(duì)肝癌的癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本，使用兩張肝癌組 織芯片(分別為0D-CT-DgLiv03-002肝癌組織芯片和0D-CT-DgLiv03-003肝癌組織芯片， 均購自上海芯超生物科技有限公司)進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，其中，選取的樣本的具體資 料分別如表5和表6所示表5、OD-CT-DgLiV03-002肝癌組織芯片資料及打分情況 表6、OD-CT-DgLiV03-003肝癌組織芯片資料及打分情況 免疫組織化學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)過程如下將組織切片置于60°C恒溫箱烘烤約3個(gè)小時(shí)，取出后依次使用二甲苯、二甲苯/乙醇(1 1)、100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和水，進(jìn)行脫蠟水化處理；PBS洗3次，每次5分鐘；0. 3% H2O2 (甲醇稀釋)浸泡半小時(shí)，PBS洗3次，每次5 分鐘；高壓修復(fù)抗原，雙蒸水洗2次，每次5分鐘；PBS洗2次，每次5分鐘；10%血清室 溫封閉20分鐘；加入鼠抗人DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl單克隆抗體(購自 LifeSpanBiosciences 公司，1 200 稀釋)，4°C過夜，PBST 洗 3 次，每次 5 分鐘;加入生物素標(biāo)記的馬抗鼠抗體(來自ABC試劑盒，購自VECTOR公司)，室溫孵育 30分鐘，PBST洗3次，每次5分鐘；PBS洗2次，每次5分鐘；加入ABC溶液(來自ABC試劑盒，購自VECTOR公司)，室溫孵育30分鐘，PBS洗3 次，每次5分鐘；DAB溶液(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)顯色；蘇木精(購自VECTOR 公司，H3404)染色20秒；組織切片依次使用50 %乙醇、70 %乙醇、80 %乙醇、90 %乙醇、100 %乙醇、二甲苯 /乙醇(1 1)、二甲苯，進(jìn)行脫水透明處理。然后使用中性樹脂封片，于顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。對(duì)組織芯片進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示組織芯片中共59對(duì)有效樣本(去掉一對(duì)樣本破 壞嚴(yán)重的和2對(duì)均為癌組織的樣本)，并根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性率打分，其中，染色強(qiáng)度打分 標(biāo)準(zhǔn)為陰性為0分、弱陽性為1分、中等陽性為2分、強(qiáng)陽性為3分；陽性率打分標(biāo)準(zhǔn)為 低于5%為0分，5% 30%為1分，31 % 60%為2分，60%以上為3分。將染色強(qiáng)度的得 分與陽性率的得分相加，獲得組織切片的綜合得分，得分情況分別如表5和表6所示。根據(jù)表5和表6的結(jié)果綜合細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的信息，肝細(xì)胞癌組織的平均綜合 得分為4. 88，癌旁組織的平均綜合得分為2. 66，兩者具有極顯著差異，P值(Wilcoxon rank sumtest)為4· 011E-07，在約75% (44對(duì))的樣本對(duì)中，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶 APEXl在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)。病理分級(jí)I，I-II的樣本組與病理分級(jí)II的樣本組之間存在 顯著差異，P值小于0. 01，病理分級(jí)I，I-II的樣本組與病理分級(jí)II-III的樣本組之間也存 在顯著差異，P值小于0. OLDNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá)水平與細(xì)胞的分 化程度成反比。如果僅利用細(xì)胞核中的信息，肝細(xì)胞癌組織的平均綜合得分為2. 92，癌旁組 織的平均綜合得分為1.03，兩者具有極顯著差異，P值(Wilcoxon rank sum test)為 1. 924E-07，在約75% (44對(duì))的樣本對(duì)中，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì) 胞癌中高表達(dá)。病理分級(jí)I，I-II的樣本組與病理分級(jí)II的樣本組之間存在顯著差異，P值 小于0.01，病理分級(jí)I，I-II的樣本組與病例分級(jí)II-III的樣本組之間也存在顯著差異，P 值小于0. 01，細(xì)胞核中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá)水平與細(xì)胞的分化程 度成反比。如果僅利用細(xì)胞質(zhì)的信息，病理分級(jí)I，I-II的樣本組與病理分級(jí)II的樣本組之 間存在顯著差異，P值小于0.01，病理分級(jí)I，I-II的樣本組與病例分級(jí)II-III的樣本組之 間也存在顯著差異，P值小于0. 01，細(xì)胞質(zhì)中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá) 水平與細(xì)胞的分化程度成反比。
該結(jié)果與前面的質(zhì)譜結(jié)果、免疫印跡結(jié)果以及免疫熒光結(jié)果相一致。因此，可根據(jù)DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌的癌組織和癌旁 組織中存在的明顯的差異表達(dá)，用于肝細(xì)胞癌的中早期診斷，而不僅為預(yù)后的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl在肝細(xì)胞癌的癌組織和癌旁組 織中存在明顯的差異表達(dá)，顯然與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，因此它的表達(dá) 量可以用于檢測(cè)肝細(xì)胞癌。相應(yīng)的，特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗 體，包括各種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其 能夠用于檢測(cè)DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá)量，因而可以用于檢測(cè)肝細(xì)胞 癌，或者用于制備檢測(cè)肝細(xì)胞癌的制劑或試劑盒，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易 見的。雖然有關(guān)DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl動(dòng)態(tài)的生物學(xué)功能及腫瘤相關(guān)機(jī) 制還有待進(jìn)一步研究，但是將它作為檢測(cè)肝細(xì)胞癌的標(biāo)記物卻是肯定的。DNA脫嘌呤/脫嘧 啶位點(diǎn)裂解酶APEXl可作為肝細(xì)胞癌的標(biāo)志物，而它在胞內(nèi)的生物學(xué)功能提示DNA脫嘌呤 /脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl可能作為肝癌的預(yù)后分子標(biāo)記和臨床治療的靶分子。
權(quán)利要求
DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEX1用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)是檢測(cè)APEX1在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量為 檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中是否均存在上調(diào)表達(dá)。
3.—種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備 檢測(cè)肝細(xì)胞癌的制劑，所述檢測(cè)是檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶 APEXl的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量為 檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中是否均存在上調(diào)表達(dá)。
6.一種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備 檢測(cè)肝細(xì)胞癌的試劑盒，所述檢測(cè)是檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶 APEXl的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量為 檢測(cè)APEXl在肝組織細(xì)胞中是否均存在上調(diào)表達(dá)。
9.一種體外檢測(cè)肝組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的表達(dá)是否異常的 方法，其特征在于，所述方法為用特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的抗體檢 測(cè)待測(cè)肝組織細(xì)胞中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的數(shù)量，并與正常肝組織中的 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEXl的數(shù)量進(jìn)行比較。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶 APEXl的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEX1的應(yīng)用。本發(fā)明提供的APEX1的應(yīng)用為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEX1作為檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用，該檢測(cè)是檢測(cè)APEX1在肝組織細(xì)胞中的表達(dá)量。DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)裂解酶APEX1在肝細(xì)胞癌的癌細(xì)胞和癌旁細(xì)胞中存在明顯的差異表達(dá)，因此，可根據(jù)其在肝細(xì)胞中的表達(dá)量檢測(cè)患者是否患有肝細(xì)胞癌。
文檔編號(hào)G01N33/535GK101930004SQ20091005372
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者徐孟杰, 曾嶸, 李辰, 武祎, 阮宏強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院