專利名稱：棉花花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域中花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
花粉管作為有花植物受精過程中雄性生殖單位的載體，它的萌發(fā)及其伸長等一系列生理活動(dòng)，直接影響著受精過程能否順利完成，花粉管的生長與其它植物細(xì)胞不同，它具有極性頂端生長，并依賴于生長的花粉管中微絲正常聚合。因此，利用花粉管系
統(tǒng)研究微絲骨架及其在生物體內(nèi)的功能是目前最活躍的研究領(lǐng)域之一，也是當(dāng)今植物生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。近年來的研究表明，微絲是細(xì)胞骨架的重要組成部分，它在花粉萌發(fā)和花粉管生長中執(zhí)行著多種功能，其中包括維持和建立細(xì)胞極性，參與細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)與細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)，以及對各種環(huán)境刺激做出反應(yīng)等。
微絲是由肌動(dòng)蛋白單體G-actin組成的直徑約7nm-9nm的骨架纖維，又稱肌動(dòng)蛋白纖維(actin filament, AFs)。目前利用熒光標(biāo)記法觀察微絲的方法，主要有抗體間接標(biāo)記和鬼筆環(huán)肽直接染色兩種。由于微絲抗體在標(biāo)記F-actin的同時(shí)也能標(biāo)記G-actin，因此標(biāo)記后得到的圖像常有較高的背景。而鬼筆環(huán)肽的優(yōu)點(diǎn)在于能專一性地標(biāo)記F-actin，相比之下，鬼筆環(huán)肽直接染色法能提供相對理想的結(jié)果。迄今為止，由于實(shí)驗(yàn)材料自身的局限性和檢測方法的局限性，對陸地棉花粉管中微絲骨架進(jìn)行標(biāo)記的有效方法和技術(shù)還未見報(bào)道。本方法探索了用TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染料進(jìn)行檢測陸地棉花粉管內(nèi)微絲骨架的試驗(yàn)，建立了完整可行的試驗(yàn)方法，操作步驟簡單，試驗(yàn)效果穩(wěn)定、清晰，因此無論是在科研、檢測以及學(xué)生試驗(yàn)中都能得到很好的應(yīng)用。
三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種較快速、有效的的棉花花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法。技術(shù)方案
一種棉花花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法，包括以下步驟1)載玻片打孔
將載玻片(25.5X76. 2mm， lmm-l. 2mm thick)中間用電鉆打出直徑為lcm的圓孔，其中孔的一邊用將蓋玻片封住，形成小室，粘附劑為指甲油；
2) 培養(yǎng)花粉管
晴天上午收集剛開放花朵上的成熟花粉，使其充分混合；將花粉灑在半固體培養(yǎng)基表面(培養(yǎng)基成分0.01%硼酸+ 0.03%四水硝酸鈣+ 0.02%七水硫酸鎂+ 15%聚乙二醇8000+20%蔗糖+1%低熔點(diǎn)瓊脂糖，pH6.2)， 28"光照培養(yǎng)2-3h;
3) 熒光標(biāo)記
培養(yǎng)好的花粉管用含有4%多聚甲醛(質(zhì)量百分濃度)的50mM Pipes緩沖液(pH6.9)室溫條件下固定l一2h;用Pipes緩沖液洗滌花粉管；將花粉管置于0.1 —0.2%的甘油或0.1—0.2%濃度的Triton X-100中室溫滲透3—4h或4。C冰箱過夜；用pH7-9的磷酸緩沖液洗滌花粉管；花粉管用濃度為l-2.5pg/ml的TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽避光染色2-4h，微絲骨架被熒光標(biāo)記；用pH7-9的磷酸緩沖液洗滌花粉管；熒光標(biāo)記過的花粉管在共聚焦掃描顯微鏡下觀察。上述的方法中所述棉花為陸地棉。
有益效果
本發(fā)明提供了一種對棉花花粉管微絲骨架進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法。本發(fā)明的標(biāo)記方
法具有以下優(yōu)點(diǎn)
1) 簡單，快速省略了常規(guī)標(biāo)記方法中對細(xì)胞壁進(jìn)行酶解的步驟；
2) 用甘油或TritonX-100作為滲透試劑，使得熒光染色效率更高；
3) 標(biāo)記效果好，可在共聚焦掃描顯微鏡下清晰觀測到微絲骨架均呈較長的、密集的平行束狀或表現(xiàn)出較為隨機(jī)的以較短的、纖細(xì)的交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布。研究的方法和結(jié)果為開展與棉花受精有關(guān)的生殖生物學(xué)研究提供了新的途徑和依據(jù)，為棉花花粉的開發(fā)應(yīng)用提供相關(guān)技術(shù)參考。
四

圖1棉花花粉管內(nèi)的微絲骨架結(jié)構(gòu)
A)呈較長的、密集的平行束狀的微絲骨架，Bar=1(Him; B)呈隨機(jī)的、較短的、纖細(xì)的交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布的微絲骨架Bar-10nm
五具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分含量如無特別說明
均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、魯棉21花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記及其顯微鏡觀測首先用本發(fā)明的方法對魯棉21 (生產(chǎn)用種)花粉管進(jìn)行熒光標(biāo)記，包括以下步驟
1) 載玻片打孔，將載玻片(25,5X76.2mra， lmm-l. 2mm thick)中間用電鉆打出 直徑為lcm的圓孔，其中孔的一邊用將蓋玻片封住，粘附劑為指甲油，室溫靜置至 指甲油風(fēng)干，蓋玻片與載玻片粘在一起成一小室，備用；
2) 配制半固體花粉管培養(yǎng)基，分別稱取0.01g硼酸、0.03g四水硝酸鈣、0.02g 七水硫酸鎂、15g聚乙二醇8000和20g蔗糖，用去離子水溶解后調(diào)pH至6.2，再定 容至100ml，再加入1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，加熱溶解后，用移液槍吸取加滿載玻片上 的小室，室溫凝固后備用。
3) 培養(yǎng)花粉管，晴天上午收集剛開放花朵上的成熟花粉，使其充分混合(避免 個(gè)體植株和花藥不同引起的花粉生活力差異)；將花粉灑在半固體培養(yǎng)基表面，28°C 光照培養(yǎng)2.5h;
4) 培養(yǎng)好的花粉管用含有4X多聚甲醛的50mM Pipes緩沖液(pH6.9)室溫條件下 固定1.5h;
5) 用不含多聚甲醛的Pipes緩沖液洗滌花粉管3次，每次漂洗10min后用吸水 紙輕輕將洗液吸去；
6) 將花粉管置于0.15%的甘油(pH為8的磷酸緩沖液配制)中滲透3h;
7) pH為8的磷酸緩沖液洗滌花粉管，每次漂洗10min后用吸水紙輕輕將洗液吸
去；
8) 花粉管用濃度為2pg/ml的TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Sigma公司，USA)避光 染色3h，微絲骨架被熒光標(biāo)記；
9) pH為8的磷酸緩沖液洗滌花粉管，每次漂洗10min后用吸水紙輕輕將洗液吸
去；
10) 熒光標(biāo)記過的花粉管在共聚焦掃描顯微鏡下觀察。
結(jié)果表明，花粉管內(nèi)具有完整的微絲網(wǎng)絡(luò)，微絲骨架均呈較長的、密集的平行束狀(圖 1-A)或表現(xiàn)出較為隨機(jī)的以較短的、纖細(xì)的交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布，但均交錯(cuò)平行于花 粉管的長軸(圖1-B)。微絲束在距花粉管頂端10-20wn處不再往前延伸，在花粉管 的頂端不存在微絲束。
上述步驟7)中將花粉管置于0.15%的甘油(pH為8的磷酸緩沖液配制)中滲透 3h;用TritonX-100代替甘油，4。C冰箱過夜代替室溫滲透3h都能起到同樣的效果。
權(quán)利要求
1、一種棉花花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法，包括以下步驟1)載玻片打孔將25. 5×76.2mm，1mm-1.2mm厚的載玻片中間用電鉆打出直徑為1cm的圓孔，其中將孔一邊用蓋玻片封住，形成小室，粘附劑為指甲油；2)培養(yǎng)花粉管晴天上午收集剛開放花朵上的花粉，使其充分混合；將花粉灑在半固體培養(yǎng)基表面，半固體培養(yǎng)基質(zhì)量比成分0.01％硼酸、0.03％四水硝酸鈣、0.02％七水硫酸鎂、15％聚乙二醇8000、20％蔗糖和1％低熔點(diǎn)瓊脂糖，pH6.2，28℃光照培養(yǎng)2-3h；3)熒光標(biāo)記培養(yǎng)好的花粉管用含有質(zhì)量百分濃度4％多聚甲醛、pH為6.9的50mM Pipes緩沖液室溫條件下固定1—2h；用Pipes緩沖液洗滌花粉管；將花粉管置于體積比為0.1—0.2％的甘油或體積比為0.1—0.2％濃度的Triton X-100中室溫滲透3—4h或4℃冰箱過夜；用pH7-9的磷酸緩沖液洗滌花粉管；花粉管用濃度為1-2.5μg/ml的羅丹明TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽避光染色2-4h，微絲骨架被熒光標(biāo)記；用pH7-9的磷酸緩沖液洗滌花粉管；熒光標(biāo)記過的花粉管在共聚焦掃描顯微鏡下觀察。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述棉花為陸地棉。
全文摘要
本發(fā)明是對棉花花粉管微絲骨架進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括載玻片打孔做成培養(yǎng)花粉管的小室；將花粉在小室中培養(yǎng)，萌發(fā)出花粉管；培養(yǎng)好的花粉管用含4％多聚甲醛的50mm Pipes緩沖液(pH6.9)固定1-2h；洗滌后再置于0.1-0.2％的甘油(或0.1-0.2％濃度的Triton X-100)中室溫滲透3-4h(或4℃冰箱過夜)；洗滌后用濃度為1-2.5μg/ml的TRITC(羅丹明)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽避光染色2-4h；洗滌后在共聚焦掃描顯微鏡下觀察。本發(fā)明操作簡單，標(biāo)記效果好，將在棉花花粉管細(xì)胞的骨架以及受精生殖研究中發(fā)揮重要作用，有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號G01N1/30GK101477000SQ20091002861
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日
發(fā)明者吳李君, 吳躍進(jìn), 唐燦明, 岳潔瑜 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)