專利名稱：用于分析具有不同拓?fù)鋱D的表面與環(huán)境之間相互作用的高通量篩選方法和設(shè)備的制作方法
用于分析具有不同拓?fù)鋱D的表面與環(huán)境之間相互作用的高
通量篩選方法和設(shè)備本發(fā)明涉及一種用于分析材料表面與其環(huán)境之間的相互作用的高通量篩選方法， 還涉及一種用于進(jìn)行高通量篩選的設(shè)備。以往對能夠用于臨床的材料已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究。在臨床應(yīng)用中普遍使用的材 料的重要示例是鈦植入體、汞合金牙齒植入體以及塑料心臟瓣膜。大多數(shù)材料能夠成功應(yīng) 用的關(guān)鍵在于它們的生物惰性，即材料與周圍組織之間的最小的相互作用。盡管具有這些優(yōu)勢特性，通?？梢越邮艿氖抢硐氲难a救方法是對正常組織的完 全修復(fù)。比較有利的方法是植入能夠提供臨時的機械性支持，但最終會降解，從而被已恢復(fù) 的正常組織取代的材料。一個示例是可降解的縫合線。在傷口愈合之后，縫合線不再被需 要并將降解。有許多可降解的聚合物體系可用。在特定的領(lǐng)域，例如在骨重建領(lǐng)域，也使用 可降解的陶瓷材料，以及聚合物/陶瓷復(fù)合材料?？山到獾闹踩塍w在骨科和軟骨手術(shù)領(lǐng)域也是有利的。在該領(lǐng)域中主要的手術(shù)治療 依靠金屬醫(yī)用植入體與骨或骨替代物結(jié)合使用。這些植入體必須被成功地納入骨組織，以 取得良好的臨床效果。在過去幾十年中，在這一領(lǐng)域已取得了關(guān)鍵進(jìn)展和成果，但隨著時間 的推移，對于成功的長期關(guān)節(jié)置換來說，植入體松動仍然是一個重要問題。目前的材料無 法實現(xiàn)較大的骨缺損的橋接，并單獨保持長期穩(wěn)定。若使用取自患者自身的骨移植物來解 決這些問題，則供區(qū)的發(fā)病率相對較高，為15-30%。多達(dá)20%經(jīng)受髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患 者在初次手術(shù)后的10至15年內(nèi)發(fā)生假體周圍骨質(zhì)流失，在進(jìn)行脊柱融合手術(shù)的患者中， 20-30%發(fā)生融合不良。此外，在不久的將來，患病人群將包括大量的年輕患者，預(yù)計與長期 無菌性植入體松動相關(guān)的問題將大幅度增加。體內(nèi)植入體的生物相容性/生物結(jié)合非常復(fù)雜，涉及傳統(tǒng)上屬于醫(yī)學(xué)科學(xué)、表面 科學(xué)、材料科學(xué)和分子生物技術(shù)的過程。在植入體被植入身體之后的幾毫秒之內(nèi)，由來自生 理液的水、蛋白質(zhì)和其它生物分子組成的生物膜層形成于植入體表面。來自周圍組織的細(xì) 胞遷移到植入體周圍的區(qū)域。植入體表面的特性嚴(yán)重影響其與細(xì)胞的相互作用。為了優(yōu)化 生物相容性，植入體表面對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響變得至關(guān)重要。此外，細(xì)胞的特性，例如， 它們通過信號分子穿過細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行溝通的能力對良好的生物相容性來說是很重要的。 所有這些機制都有助于組織對植入體的響應(yīng)，和確定植入體是否以足夠的機械強度成功地 固定在患者的骨頭內(nèi)，或者是否對植入體發(fā)生炎癥反應(yīng)，這些最終都將導(dǎo)致無菌性松動和 手術(shù)失敗。人們普遍承認(rèn)，醫(yī)療器材或植入體的材料與其周圍組織或細(xì)胞之間的相互作用可 以通過調(diào)節(jié)表面拓?fù)鋱D來加以改善，參見例如W0-A-2006/114098。已經(jīng)表明，表面拓?fù)鋱D可以例如影響細(xì)胞定位、細(xì)胞粘附和增殖，和/或細(xì)胞分 化?？梢酝ㄟ^在例如所述的用于肌腱修復(fù)(Curtis等，Eur.Cell Mater. 2005，9， 50-57)和心肌細(xì)胞定位(Deutsch 等，J Biomed. Mater. Res. B2000, 53 (3), 267-275)的生物 材料上制造圖形來控制細(xì)胞定位。最近，本發(fā)明人還通過微圖案聚合物設(shè)計證實了 C2C12小鼠前成肌細(xì)胞與MC3T3小鼠前成骨細(xì)胞的排列(Papenburg等，Biomaterials 2007， 28(11)，1998-2009)。細(xì)胞對材料的粘附在例如骨外科領(lǐng)域中可能是一種理想的特性，因為它增強了材 料與鄰近骨組織之間的接觸。相反，在其它應(yīng)用中，例如當(dāng)植入人工主動脈瓣膜時，它可 能是不可取的。如文獻(xiàn)中大量描述的(參見例如Den Braber等，J. Biomed. Mater. Res. A1998，40 (2)，291-300 ；Van Kooten 等，J. Biomed. Mater. Res. B1998，43 (1)，1-14 ；和 Thapa 等，J. Biomed. Mater. Res. A2003，67 (4)，1374-1383)，細(xì)胞粘附可以由生物材料表面的拓 撲設(shè)計來控制。例如，表面粗糙度對細(xì)胞表面受體的整合素家族的性質(zhì)有影響(Luthen
Biomaterials 2005，26 (15)，2423-2440)。此外，本發(fā)明人最近描述了聚合物纖維直 徑和表面拓?fù)鋱D對人間質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響(Moroni等，Biomaterials 2006,27(28), 4911-4922)。而且，表面拓?fù)鋱D可影響細(xì)胞分化。對于用幾何學(xué)定義的形狀的細(xì)胞圖形化 已廣泛用于研究細(xì)胞形狀對細(xì)胞命運決定的影響(Chen等，Science 1997,276(5317), 1425-1428)。在闡述了細(xì)胞形狀可以控制干細(xì)胞分化的經(jīng)典實驗中，微圖形化被用于創(chuàng)建 不同大小的多片粘合表面(McBeath等，2004，6 (4)，483-495)。生長在小片上的人間充質(zhì)干 細(xì)胞(hMSCs)保持聚集且優(yōu)先分化為脂肪細(xì)胞，而生長在大片上的hMSCs擴散，且分化為成 骨細(xì)胞。在這種思路下，能夠操縱細(xì)胞形態(tài)的生物材料會潛在地控制細(xì)胞分化。生物材料 研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)在于為所需的應(yīng)用確定合適的拓?fù)鋱D。然而，到目前為止，為了通過表面拓?fù)鋱D操縱醫(yī)療器材與其周圍組織的相互作用 所進(jìn)行的生物材料的設(shè)計，主要通過合理的設(shè)計或反復(fù)試驗來實施，它具有變量數(shù)量少的 特點。在植入體和醫(yī)療器械中使用的生物材料，不僅要經(jīng)受反復(fù)試驗設(shè)計。而且在許多 其它應(yīng)用中，材料與其環(huán)境間的相互作用在材料的有效性和/或適用性方面起主要作用。 在很多情況下，由于材料通過表面拓?fù)鋱D與環(huán)境接觸，因此材料的拓?fù)鋱D是影響該種相互 作用的重要因素。本發(fā)明的目的是提供用于分析拓?fù)鋱D文庫與特定環(huán)境間相互作用的篩選方法，該 方法能夠高通量篩選大量變量。本發(fā)明再一個目的是提供一種材料和表面拓?fù)鋱D的細(xì)胞和/或組織相容性的高 通量篩選方法。本發(fā)明另一個目的是提供一種可用于制備醫(yī)療器材且在應(yīng)用中要與人體接觸的 材料的篩選方法，例如支架、縫合線、心律調(diào)整器等等。本發(fā)明另一個目的是提供一種高通量篩選方法，用于分析在生物醫(yī)學(xué)、藥劑學(xué)、腫 瘤學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、神經(jīng)學(xué)和家用工具中使用的材料和/或拓?fù)鋱D的適用性。本發(fā)明另一個目的是提供一種用作軟骨和/或骨骼替代物的適用材料的篩選方法。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過使用具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列，可以實現(xiàn) 上述一個或多個目的。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種用于分析材料表面和環(huán)境間相互作用的高通量 篩選方法，包括
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-提供包括所述材料并具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；-使至少部分所述大量單元與所述環(huán)境接觸；和-篩選所述微陣列以得出一個或多個所述單元與所述環(huán)境間的相互作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明可以篩選大量的不同材料和/或不同表面拓?fù)鋱D得到 其與環(huán)境間的特異性相互作用。為了找到好的候選，本發(fā)明允許對可能的材料和表面拓?fù)?圖進(jìn)行快速和有效地篩選?？梢詫@些候選進(jìn)行更仔細(xì)的研究。例如，這為開發(fā)在應(yīng)用期 間要與細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基和/或組織接觸的更好的醫(yī)用器材提供了巨大的可能性。根據(jù)本發(fā)明的方法，各種環(huán)境都是可以的。例如，所述環(huán)境可包括組織、細(xì)胞、復(fù)合 分子混合物(例如體液、土壤、海水、空氣、細(xì)胞裂解液、器官或完整的有機體、廢品、尿、糞 便)。然而，所屬環(huán)境還可包括特異性分子。如果環(huán)境包括細(xì)胞、復(fù)合分子混合物或特異性 分子，則本發(fā)明包含將微陣列分別與所述細(xì)胞、所述復(fù)合分子混合物或所述特異性分子接 觸。通過每天對材料的構(gòu)造和/或表面特性進(jìn)行有益的改變，材料(例如生物材料) 僅通過改變拓?fù)鋱D就可加以應(yīng)用。因此，參與的重組蛋白或復(fù)雜的化學(xué)便不再需要了。材 料拓?fù)鋱D的策略設(shè)計能夠改善其與環(huán)境的相互作用。在一個實施方案中，微陣列包括生物相容性材料，例如生物相容性聚合物。材料可 以是生物可降解的。生物可降解聚合物的合適的示例包括聚氧乙烯/聚對苯二甲酸丁二醇 酯(ΡΕ0/ΡΒΤ)，聚酯家族的聚合物例如聚(乳酸)(PLA)和聚(乙醇酸)(PGA)，以及它們的 共聚物，聚內(nèi)酯(例如聚(ε-己內(nèi)酯))，聚碳酸酯(例如三亞甲基碳酸酯)，聚酸酐，聚原 酸酯，聚氨酯，及其衍生物(Gunati 1 lake et al. Eur. CelIMater. 2003，5，1-16)。而且，不同 聚合物的共聚物和/或共混物也可用于本發(fā)明的微陣列。其它可包含于本發(fā)明微陣列的適用的材料包括陶瓷、半導(dǎo)體、金屬、金屬氧化物、 金屬氮化物、合金、聚合物/陶瓷復(fù)合材料、碳、及其共聚物和/或共混物。如果需要，這些 材料可以結(jié)合適當(dāng)?shù)木酆衔?。微陣列包括大量的拓?fù)鋱D單元。這些拓?fù)鋱D單元的數(shù)量可以在較大范圍內(nèi)變化。 拓?fù)鋱D單元的數(shù)量大是有利的，這樣可以一次性篩選大量的拓?fù)鋱D單元以檢測細(xì)胞相容 性。例如微陣列可以包含至少100個拓?fù)鋱D單元，優(yōu)選至少10000萬個拓?fù)鋱D單元，更優(yōu)選 至少30000萬個拓?fù)鋱D單元。由于實際操作的原因，拓?fù)鋱D單元的上限為約300000個拓?fù)?圖單元，或250000個拓?fù)鋱D單元，但實質(zhì)上不限于此。這與專利W0-A-02/02794不同。前 述發(fā)明限于使用96、384或1536孔的裝置。此外，它還具有不同幾何形狀的絕熱孔。在本 發(fā)明中，孔具有相同的幾何形狀并可一致變化。單個拓?fù)鋱D單元的大小可以根據(jù)應(yīng)用情況而變化。例如，單個拓?fù)鋱D單元具有 100-50000 μ m2 或更大，例如 500-25000 μ m2，或 1000-10000 μ m2 的表面積。例如，至少部分單元的拓?fù)鋱D可在表面孔隙度、表面粗糙度和/或形狀方面不同。 本專利一個更重要的方面是，可對表面形貌進(jìn)行設(shè)計，并且對制備工藝進(jìn)行很好的控制，以 復(fù)制設(shè)計的拓?fù)鋱D。這與專利US-A-2006/0240058不同，該專利描述了一種方法，其中應(yīng)用 組合化學(xué)而非微加工通過混合聚合物來創(chuàng)造不同的表面粗糙度。在該申請中，表面拓?fù)鋱D 的幾何結(jié)構(gòu)不可控。單元的表面孔隙度在0-90%，如20-70%的范圍內(nèi)變動。孔的平均大 小為50 μ m或更小，例如lnm-50 μ m。表面粗糙度在5_50納米至5_10 μ m范圍內(nèi)變動。而
6且，至少部分單元的疏水性/親水性可以改變。此外，至少部分單元的表面可具有特異性官 能團。在由微陣列表面限定的平板內(nèi)，全部或部分單元可以包括一維或多維微米或納米 級形貌。本文使用的術(shù)語“微米級”是指1-ΙΟΟΟμπι的長度范圍。本文使用的術(shù)語“納米 級”是指Ι-lOOOnm，尤其是I-IOOnm的長度范圍。所述形貌可以是例如結(jié)構(gòu)形貌，例如微陣 列表面延伸出的突起。該突起可以具有不同的橫截面幾何外形，例如圓形突起(例如圓形 或橢圓形)以及具有包括多角形，例如多邊形、三角形、長方形、正方形、六邊形、星角形狀、 平行四邊形等的突起。拓?fù)鋱D單元的其它形狀可見于例如W0-A-2006/114098，其以參閱的 方式全文并入于此。微陣列的拓?fù)鋱D單元可全是人工地或者可以模擬自然界中觀察到的表 面結(jié)構(gòu)。形貌至少在一個橫向上的橫向尺寸為1-100 μ m,例如1-5 μ m、5_10 μ m、 10-25μπι、25-50μπι或50-100μπι。優(yōu)選地，至少一個橫向尺寸的范圍為1_10 μ m。從形貌 的橫截面區(qū)域內(nèi)的任一給定點到橫截面邊緣的最短距離優(yōu)選至多為20 μ m,更優(yōu)選至多為 10 μ m，甚至更優(yōu)選至多為5 μ m，例如，至多2 μ m。任何微米級形貌與其最近形貌間的最大距離，或空隙至少在一個橫向上的橫向尺 寸可為 1-50 μ m,例如 1-5 μ m、5—10 μ m、10—15 μ m、15—20 μ m、20—30 μ m、或 30—50 μ m。優(yōu)選 地，一個形貌與其最近形貌間的最大橫向距離優(yōu)選至多30 μ m,更優(yōu)選至多10 μ m,甚至更 優(yōu)選至多5 μ m，例如至多2 μ m。形貌的深度/高度，例如其在一個方向上投射出微陣列表面的線性尺寸可為納米 級或微米級。因此，形貌的高度/深度可為至少lnm。該高度/深度可為50 μ m，或甚至 100 μ m。相應(yīng)的，形貌的高度/深度可在lnm-50 μ m的范圍內(nèi)，例如在50_100nm、100_500nm、 500-1000nm、1-2 μ m、2_5 μ m、5_10 μ m、10-20 μ m、20_30 μ m、30_40 μ m 或 40-50 μ m 的范圍。
在一些實施方案中，所有形貌具有基本相同的高度，而在另一些實施方案中，形貌可能具有 不同的高度。在環(huán)境包括細(xì)胞的情況下，可根據(jù)突起的相對尺寸和/或與細(xì)胞尺寸相關(guān)的表面 粗糙度，為每個單元提供一個或多個細(xì)胞并使細(xì)胞定位在相對粗糙的表面，但也可使細(xì)胞 定位在特定形狀的孔內(nèi)。對于孔而言，重要的是使細(xì)胞保持在不同的孔中并避免細(xì)胞蔓延 到孔脊。這可以例如通過將細(xì)胞粘附性或?qū)剐缘鞍缀?或使細(xì)胞保持在某一期望的形狀 內(nèi)或其上的化學(xué)物質(zhì)涂覆于形貌上來控制。這些蛋白和/或化學(xué)物質(zhì)可通過模版印刷技術(shù) 和 / 或微流體(參見 Dusseiller 等，LabChip 2005，5 (12)，1387-1392)提供。此外，孔脊 的尺寸和/或縱橫比也有助于控制細(xì)胞附著。形貌的上表面和/或側(cè)面基本上是平的，但是，也可以存在具有包括納米級形貌 表面的微米級形貌。這是考慮到微米級或納米級拓?fù)鋱D的協(xié)同效應(yīng)。優(yōu)選大量單元規(guī)則地分布在微陣列上。這便于大量單元與環(huán)境的接觸和篩選，例 如，微陣列上的細(xì)胞應(yīng)用以及細(xì)胞篩選。然而，也可以將這些單元在微陣列上隨機分布。本發(fā)明的微陣列可通過本領(lǐng)域公知的方法制得。制備微陣列方法的一個實例是結(jié)合了光刻和刻蝕的傳統(tǒng)微加工。電子束刻蝕，可 直接應(yīng)用在金屬(硅)的表面。這些技術(shù)能夠制備出微米級的高精密結(jié)構(gòu)。然而，對材料 的選擇是有限的，因為該項技術(shù)要求硅或硅基材料占大部分?？蛇x地，實施后處理步驟例如
7涂覆，以增強這些材料與特定環(huán)境的接觸。涂覆材料例如包括蛋白、硅烷、碳、膠原蛋白、生 物聚合物(例如肝素、透明質(zhì)酸)等等。較少受到材料性質(zhì)限制的其它刻蝕技術(shù)為可適應(yīng) 于微圖形聚合物的氣體等離子刻蝕，和(微)立體光刻，其可被用作直接制備帶結(jié)構(gòu)的聚合 物的光聚合工藝。制備微陣列的方法的其它實例為復(fù)制法，例如熱壓或軟光刻技術(shù)。這些方法比傳 統(tǒng)微加工要求的材料范圍更廣。熱壓技術(shù)采用能從熔體中處理得到的材料，而軟光刻技術(shù) 主要采用彈性體如聚(二甲基)_硅氧烷(PDMS)。在軟光刻中，制造一個模具以在支架表面 上創(chuàng)建油墨微圖形。隨后在部分無油墨表面進(jìn)行涂覆。為了通過軟光刻精確制圖，優(yōu)選采 用剛性表面。一種制備微陣列的簡便方法是澆鑄制膜法。通過將材料(聚合物、陶瓷、聚合物/ 陶瓷復(fù)合材料、或聚合物共混物等)溶解在合適的溶劑中制備溶液。將溶液澆鑄在帶結(jié)構(gòu) 的表面/模具上(其通常通過傳統(tǒng)潔凈室技術(shù)制備)并靜置使溶劑揮發(fā)。表面的復(fù)制品因 此被復(fù)制在材料上，參見例如，M. Mulder，Basic principles of MembraneTechnology, 2nd ed. , Dordrecht,The Netherlands, Kluwer academicpublishers, 1996。包含至少部分具有不同孔隙度的大量單元的微陣列(其在組織工程學(xué)領(lǐng)域被有 趣的用于將養(yǎng)分?jǐn)U散到細(xì)胞)可通過相分離法制備。用于制備微陣列的合適的相分離法描 述于W0-A-02/43937，其以參閱的方式全文并入于此。相分離微成模(PSyM)是基于相分離法的復(fù)制技術(shù)，其主要用于制備合成膜。該 方法涵蓋的聚合物范圍很廣。在PSy M中，相分離與亞微米級的結(jié)構(gòu)復(fù)制相結(jié)合，參見 W0-A-02/43937。首先，基于來源于微電子技術(shù)和光刻技術(shù)的公知技術(shù)制備微米到納米結(jié)構(gòu) 的母模。然后，將理想的聚合物溶液澆鑄在母模上?？赏ㄟ^下述方式誘導(dǎo)相分離，例如，對 與溶劑不相混溶的聚合物，通過將澆鑄的聚合物溶液浸泡在非溶劑中(液誘導(dǎo)相分離)進(jìn) 行，或通過降溫(熱致相分離)進(jìn)行。相分離導(dǎo)致澆鑄聚合物固化成母模的微米到納米級 的三維結(jié)構(gòu)。此后聚合物微結(jié)構(gòu)可從母模中釋放出來。聚合物濃度例如可為l_20wt. %。 該方法中使用的溶劑可包括N-甲基-2-吡咯烷酮、二惡烷、氯仿、丙酮、甲苯、烷烴和苯類。 該方法中使用的非溶劑可包括水、醇、烷烴、乙醚等。降溫一般是將溫度降至聚合物的T。以 下，例如可減少10°C或更多。根據(jù)聚合物溶液和非溶劑的組成，產(chǎn)生的聚合物膜在相分離后可顯示內(nèi)在孔隙 度，產(chǎn)生多孔的微結(jié)構(gòu)聚合物。此外，該技術(shù)通過采用后處理，例如裂解或焙燒，不僅可用于 在聚合材料上，也可用在無機材料上(例如陶瓷、金屬或碳)制備拓?fù)鋱D形貌。實現(xiàn)這一目 標(biāo)的一種方式是通過使聚合物和陶瓷的共混溶液沉淀?；蛘?，通過溫度處理燒掉聚合物，同 時燒結(jié)陶瓷?？蔀橹辽俨糠中蚊矄卧峁┥锘钚缘幕衔铮?，肽、蛋白質(zhì)、糖類、抗原、抗 體、DNA、RNA、脂類和/或生長激素?？梢岳靡环N或多種這類生物活性化合物的存在及 其與環(huán)境(例如細(xì)胞)間的相互作用，例如，通過為材料施予有益特性以控制傷口愈合反 應(yīng)。在一個實例中，已知Arg-Gly-Asp氨基酸序列能與粘附受體的整合素家族相互作用， 以及涂覆非粘附表面例如聚乙二醇(PEG)，和Arg-Gly-Asp肽能極大地改善細(xì)胞的結(jié)合 及分布?；蛘?，可將參與骨形成的重組蛋白，例如BMP2和IGF-I用于組織再生的控釋策 略(參見例如 Chen 等· Growth Factors 2004，22 (4)，233-241 and Lutolf et al. Nat.Biotechnol. 2005，23(1)，47-55)。在一個實施方案中，與至少部分大量單元接觸的環(huán)境包括細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選為 肝細(xì)胞(如全能、多能或多能性干細(xì)胞)，因為這些細(xì)胞能進(jìn)行自我復(fù)制并生成特化細(xì)胞。 但是，也可以應(yīng)用其它類型的細(xì)胞。在軟骨和骨骼的應(yīng)用中，間充質(zhì)干細(xì)胞是非常合適的， 因為這些細(xì)胞可以產(chǎn)生骨骼和軟骨的所有類型的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選人間充質(zhì)干細(xì) 胞。人間充質(zhì)干細(xì)胞可源于骨髓。在一個優(yōu)選的實施方案中使用細(xì)胞?？稍隗w外使用單一 細(xì)胞將至少部分大量單元與細(xì)胞進(jìn)行接觸，但是，也可例如將微陣列在體外植入器官培養(yǎng) 基，甚或?qū)⑽㈥嚵兄踩塍w內(nèi)。后一種可能性的實例為一種帶有大量拓?fù)鋱D的支架，其可篩選 用于體內(nèi)內(nèi)皮粘附?？紤]到細(xì)胞培養(yǎng)中存在的變異，建議采用相同培養(yǎng)的細(xì)胞篩選材料及其拓?fù)鋱D一 次以上，例如至少10次，優(yōu)選至少100次。此外，如下述實施例所示，各拓?fù)鋯卧?topoimit) (形貌集)可在各拓?fù)湫酒?topochip)上重復(fù)至少4次。根據(jù)本發(fā)明的一個特別實施方案，微陣列上的至少部分大量拓?fù)鋱D單元為成骨細(xì) 胞，成骨細(xì)胞可以是能夠形成骨骼的任何種類的細(xì)胞，包括自然產(chǎn)生的細(xì)胞類型，和/或改 性細(xì)胞類型，例如通過基因工程的方式。環(huán)境與微陣列上至少部分大量拓?fù)鋱D單元的局部接觸可通過微流體實現(xiàn)。例如允 許將細(xì)胞定位在微陣列上。根據(jù)所要進(jìn)行的排列，每個拓?fù)鋱D單元的細(xì)胞數(shù)可下降至每單 元一個細(xì)胞。此外，如果環(huán)境包含細(xì)胞，則較為有利的是對細(xì)胞施以核染色(如Hoechst染色) 或細(xì)胞骨架染色(如鬼筆環(huán)肽(phalloidin)染色)，以在微陣列上沉積后采用顯微技術(shù)確 定細(xì)胞的位置和數(shù)量。這些染色可以顯示哪些單元含有1個細(xì)胞，哪些單元沒有細(xì)胞，以及 哪些單元有一個以上細(xì)胞。根據(jù)所要進(jìn)行的篩選，在篩選微陣列前將大量單元與環(huán)境接觸一段時間。例如，當(dāng) 對細(xì)胞與材料的粘附進(jìn)行評估時，篩選前接觸幾個小時即已充分，但是當(dāng)要對基因表達(dá)分 析更長的時間時，優(yōu)選例如1天或2天。一個或多個拓?fù)鋱D單元與環(huán)境間的相互作用可以包括任何可測量的物理、化學(xué)和 /或生物相互作用。這些相互作用的實例包括化學(xué)反應(yīng)、光譜移動、氫鍵、受體-配體相互作 用、電子轉(zhuǎn)移、能量轉(zhuǎn)移、粘附、靜電相互作用、范德華鍵、親水/疏水相互作用、偶極相互作 用、抗原-抗體結(jié)合、特異性細(xì)胞行為(如細(xì)胞定位、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化，和/或 一種或多種蛋白的表達(dá))。特異性細(xì)胞行為例如包括細(xì)胞分化，例如細(xì)胞譜系特異性分化，例如成骨或軟骨 細(xì)胞系特異性分化。對檢測來講，優(yōu)選一個或多個拓?fù)鋱D單元和環(huán)境間的相互作用包括發(fā)光(例如熒 光或磷光)，例如通過表達(dá)一種或多種發(fā)光蛋白。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，相互作 用包括由一種或多種骨骼特異性啟動子(如BSP、骨鈣素、I型膠原蛋白和/或0SE1)和/ 或一種或多種軟骨特異性啟動子(如2型膠原蛋白、COMP和X型膠原蛋白)控制的一種或 多種熒光蛋白的表達(dá)。該相互作用還包括特異性蛋白放射性標(biāo)記同位素的表達(dá)。可采用適當(dāng)?shù)臋z測手段檢測一個或多個拓?fù)鋱D單元與環(huán)境間的相互作用。實例包 括例如由發(fā)光蛋白(例如綠色熒光蛋白及相關(guān)蛋白、螢火蟲熒光素酶、光素酶等)或發(fā)光
9抗體產(chǎn)生的光學(xué)信號檢測。光學(xué)信號可例如通過顯微鏡(例如熒光顯微鏡)包括其衍生 技術(shù)例如熒光壽命成像，以及使用電荷耦合裝置照相機的冷光成像(luminescentimaging using a charge coupled device camera) ^iJJlJo根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，相互作用包括由反映細(xì)胞行為變化的一種或多 種DNA調(diào)控因子控制的一種或多種熒光蛋白的表達(dá)。實例包括骨骼特異性基因啟動子如 BSP、骨鈣素、I型膠原蛋白和/或0SE1)和/或一種或多種軟骨特異性啟動子(如2型膠 原蛋白、COMP和X型膠原蛋白)。此外，可通過采用熒光或其它標(biāo)記的抗體的免疫組織化學(xué)監(jiān)測一種或多種拓?fù)鋱D 單元與環(huán)境間的相互作用。也可在基因表達(dá)的水平上監(jiān)測該相互作用，為此可采用多種技 術(shù)例如原位雜交和聚合酶鏈反應(yīng)。采用原位雜交可使基因組的變化實現(xiàn)可視化。可使用其它的表面成像光譜測定表面對環(huán)境的效應(yīng)參數(shù)。例如，可從環(huán)境中獲得 核磁共振(NMR)，為此，可使用例如用于基于核磁共振成像的量子點和其它分子體的探針。 此外，光譜成像可用于分子構(gòu)成的環(huán)境的可視化，如拉曼成像和紅外光譜。光學(xué)顯微鏡可用 于檢測形態(tài)特征(例如表面上生長的細(xì)胞或組織的特征)。這可以例如提供細(xì)胞在表面上 的生物學(xué)信息，如細(xì)胞增殖、凋亡、粘附等等。其它檢測方法包括原子力顯微鏡、電子顯微鏡、掃描探針顯微鏡、掃描近場光學(xué)顯 微鏡、X射線光電子顯微鏡、X射線顯微分析、X射線衍射和/或表面等離子體共振。為了篩選，可應(yīng)用用于拓?fù)鋱D單元和細(xì)胞間相互作用的微陣列，可采用熒光報道 基因?qū)?xì)胞進(jìn)行基因工程改造?？刹捎寐《炯夹g(shù)將熒光報道基因引入到細(xì)胞中。例如， 為在單細(xì)胞水平上檢測成骨或軟骨分化，可采用熒光報道基因構(gòu)建體對hMSCs進(jìn)行基因工 程改造。為構(gòu)建報道基因的骨或軟骨特異性表達(dá)，可將熒光蛋白置于啟動子的控制之下，該 啟動子在骨或軟骨組織中具有獨特活性但在未分化的hMSCs中沒有活性。對于骨譜系，可 從由BSP骨鈣素、I型膠原蛋白、OSEl組成的骨特異性啟動子的組中選出一種啟動子。對于 軟骨譜系，可從由2型膠原蛋白、COMP、X型膠原蛋白組成的軟骨特異性啟動子組成的組中 選出一種啟動子。然后，可利用例如共聚焦激光掃描顯微鏡檢測該熒光蛋白。微陣列篩選的結(jié)果是可能與環(huán)境間具有不同相互作用的大量拓?fù)鋱D單元。這些單 元的形貌可大規(guī)模制備，以及可采用一系列分子生物技術(shù)例如qPCR、報道基因檢測、生物監(jiān) 測等等對材料/環(huán)境的相互作用做進(jìn)一步詳細(xì)分析。本發(fā)明的另一方面涉及一種可對材料表面和環(huán)境間的相互作用進(jìn)行高通量篩選 的設(shè)備，包括-包括所述材料和具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；-用于使所述微陣列與所述環(huán)境接觸的接觸裝置；以及_用于監(jiān)測一個或多個所述單元與所述環(huán)境間的相互作用的檢測裝置。


圖1 第一設(shè)計微陣列(拓?fù)湫酒?示意圖。圖2 模具的典型SEM照片。(a)，(b)帶有凸出形貌的模具，在聚合物片中形成支 柱。(c)，(d):帶有凹陷形貌的模具，在聚合物片中形成凹點。每個區(qū)域是100x100 μ m。圖3 :PLLA拓?fù)湫酒牡湫蚐EM照片。(a)，(b)帶有凹陷的拓?fù)湫酒?c), (d)帶有支柱的拓?fù)湫酒?e)，(f)帶有凹陷(e)和支柱(f)的拓?fù)湫酒臋M截面。每個區(qū)域 是ΙΟΟχΙΟΟμπι。注圖3b的拓?fù)湫酒菆D2d中模具的反向復(fù)制。(g)涂覆有磷酸鈣的拓 撲芯片的典型SEM照片。(h)鈦濺射拓?fù)湫酒牡湫蚐EM照片。圖4 細(xì)胞植覆裝置的組件。圖5 帶有連續(xù)流動用附件的改裝植覆裝置。圖6 用轉(zhuǎn)基因中國倉鼠卵巢細(xì)胞株進(jìn)行的均勻高密度細(xì)胞植覆。圖7 用轉(zhuǎn)基因中國倉鼠卵巢細(xì)胞株進(jìn)行的低密度(每個拓?fù)湫酒s8-12個細(xì) 胞)植覆的熒光顯微圖。圖8 (a)采用GeMpix pro 4200AL微陣列掃描儀成像的由AlexaFluor 488鬼 筆環(huán)肽染色的小鼠胚胎干細(xì)胞植覆的拓?fù)湫酒?b)采用BD Pathway 435成像的由AlexaFluor 488鬼筆環(huán)肽染色的人間質(zhì)干細(xì) 胞植覆的拓?fù)湫酒?c)計算機自動細(xì)胞分析期間的細(xì)胞分裂的典型照片。圖9 :(a)拓?fù)鋯卧g的細(xì)胞分布頻率，(b)-(e)細(xì)胞剛植覆后，表示固定的人 間充質(zhì)干細(xì)胞均勻分布的拓?fù)湫酒碾S機光顯微照片，(f)每個拓?fù)鋯卧年栃约?xì)胞計數(shù)。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1微陣列的制備(拓?fù)湫酒?通過在微圖案模具上用溶劑澆鑄聚合物溶液來制備拓?fù)湫酒玫胶喜⒂心＞呶?圖案的反向復(fù)制物的聚合物片。將小鼠ES細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)，并用熒 光顯微鏡進(jìn)行分析。模板設(shè)計和模具制作在此，應(yīng)用硅微加工技術(shù)制作微圖案模具，利用投影模板，將微圖案蝕刻在平整的 娃晶片上。采用市售的軟件 CIe Win layout editor version 4. 0 (WieffebSoftware, Hengelo,The Netherlands)繪制投影模板設(shè)計。該設(shè)計被輸入激光系統(tǒng)并寫入鉻模板。該 模板用于將圖案投影到平整的硅晶片的光阻蝕劑層，然后顯影，圖案就建立在光阻蝕劑上 了。拓?fù)湫酒＞叻謨刹街谱鞯谝?，通過干蝕刻法建立拓?fù)鋯卧谋?；第二，通過濕 化學(xué)蝕刻法建立形貌。在第一步設(shè)計中，將2x2cm的芯片設(shè)計成100x100 μ m(拓?fù)鋯卧?具有不同圖案 特征的區(qū)域；拓?fù)鋯卧g的脊寬為10 μ m。包括以下的圖案形貌-正方形_三角形-圓形-八邊形-五角星形這些形貌的尺寸系統(tǒng)地按比例擴大成兩個范圍。第一個范圍在細(xì)胞尺寸內(nèi)(1-20 μ m)以增加表面粗糙度；第二個范圍在大于細(xì)胞尺寸內(nèi)(ΙΟ-ΙΟΟμπι)以限定細(xì)胞。增 加粗糙度的形貌包括如下尺寸1、2、3、5、10和20μπι。限定細(xì)胞的形貌包括如下尺寸10、 20、30、40、70和100 μ m。所有這些尺寸都可以在特定的范圍內(nèi)互相結(jié)合，使兩個對稱的形 貌變成不對稱的形貌(即正方形變成矩形，或者圓形變成橢圓形)。對于各形貌之間的間距，選擇與形貌尺寸相同的值并在特定范圍內(nèi)應(yīng)用到所有形 貌尺寸的組合。每個拓?fù)鋯卧瑑H有一個參數(shù)設(shè)置(形貌類型、尺寸和間距)的形貌；每 個參數(shù)設(shè)置重復(fù)12或13次。該設(shè)計的示例見圖1?？梢园l(fā)現(xiàn)，對稱的和/或隨機排布的拓 撲形貌特征對細(xì)胞行為產(chǎn)生影響，因此我們在每個拓?fù)鋯卧幸查_發(fā)了設(shè)計隨機圖案的算 法。從拓?fù)湫酒暮Y選中收集的信息可以用于輸入以開發(fā)更多用于芯片新一代設(shè)計的進(jìn)化 算法。為了獲得同時具有凸出的(“柱狀物”)和壓痕的(“凹點”)形貌，采用相同的模 板制作兩個模具。用負(fù)型光阻蝕劑創(chuàng)建柱狀物(在聚合物芯片中)，用正型光阻蝕劑創(chuàng)建凹 點(在聚合物芯片中)。模具的SEM照片見圖2。為了改善拓?fù)湫酒?，繪制了拓?fù)湫酒牡诙€設(shè)計。第二個設(shè)計包括3 μ m或更大 的形貌。除了考慮高分辨率范圍的限制，還要考慮各種新形貌，以及已有形貌的變化。此外， 還需要適合的蝕刻工藝。在第二個設(shè)計中，也設(shè)計了 2x2cm的芯片。在這個設(shè)計中，拓?fù)鋯卧獮?0x90 μ m ； 拓?fù)鋯卧膶挾确秶３衷?0 μ m,在一個芯片上得到總計40000個拓?fù)鋯卧０ㄈ缦聢D
案形貌-正方形_三角形-圓形-八邊形-五角星形_六邊形-三角星形_半月形_有缺角的圓形(“圓角”)-空白區(qū)作為對照增加粗糙度的尺寸范圍3、5、7、10、15和20μπι。限定細(xì)胞的形貌尺寸包括20、 30、40、50、65和80μπι。另外，所有這些尺寸都可以在特定的范圍內(nèi)相互結(jié)合，使兩個對稱 的形貌變成不對稱的形貌。在增加粗糙度的范圍中，選擇與形貌尺寸相同的值，用于形貌之間的間距。對于限 定細(xì)胞的范圍，包括如下間隔值5、10、15、20、25和3(^111。在特定的范圍內(nèi)各間隔值可以 在每個形貌尺寸的結(jié)合中應(yīng)用。此外，在目前所描述的“完整”形貌旁邊，在每個形貌類型中都設(shè)計一個“空心”的 版式；即將第一個形貌與第二個相似形貌合并(第二個形貌為原始大小的50%)，這樣在第 一個形貌內(nèi)就創(chuàng)建出一個空心的布局。在第二個設(shè)計中，通過翻轉(zhuǎn)圖案，將同時具有凸面(“柱狀物”)和凹面的(“凹
12點”)形貌都繪制到一個設(shè)計中，從而創(chuàng)建具有兩種形貌類型的一個模具。每個拓?fù)鋯卧瑑H有一個參數(shù)設(shè)置(形貌類型、尺寸和間距，完整或空心形貌， 柱狀或凹點)的形貌；每個參數(shù)設(shè)置重復(fù)4次。拓?fù)湫酒闹谱鲗⒕?L-乳酸)(PLLA) (Mw ^eTOOOgmoF1)溶于氯仿中(Merck,分析純)得到10% 重量比的溶液。將該溶液以不同的初始鑄型厚度(Cli) 250-1000 μ m澆鑄在微圖案模具上。 為了便于加工，選擇500μπι的尺寸(屯)，得到的最終厚度(df)約為50/80 μ m(帶有/不帶 有形貌)，除另有不同說明外，所得片的厚度以此作為標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果。蒸干溶劑使聚合物固化。在Milli-Q水中濕潤至少1小時后，可從模具中脫模得 到由此產(chǎn)生的結(jié)合有模具微圖形的反向復(fù)制的致密聚合物片。隨后，用Milli-Q水徹底沖 洗聚合物片至少1天，在控制的環(huán)境下干燥(T = 19-20°C )。溶劑澆鑄和蒸發(fā)可成功制得拓?fù)湫酒?。觀察到PLLA的形貌的高復(fù)制品質(zhì)。聚合 物拓?fù)湫酒腟EM照片見圖3。目前尚未用含有第二個拓?fù)湫酒O(shè)計的模具的制作拓?fù)湫?片。拓?fù)湫酒募?xì)胞植覆小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)按照Smith等在Dev. Biol. 1987，121 (1)，1-9中所述的方法培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì) 胞株IB10。簡言之，將密度為5000-10000個細(xì)胞/cm2的細(xì)胞置于涂布明膠組織的培 養(yǎng)瓶中。將小鼠ES細(xì)胞在50% mES的由達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle' sMedium(DMEM, Biowhittaker))組成的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DMEM 培養(yǎng) 基含有4.5mg/ml D-葡萄糖、10 %胎牛血清(用于mES細(xì)胞培養(yǎng)的選擇批次，Greiner)、 0. ImM非必需氨基酸(NEAA，Sigma)，4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)、100U/ml青霉素 (Invitrogen公司)、100μ g/ml鏈霉素(Invitrogen公司)和50%的布法羅大鼠肝細(xì)胞調(diào) 節(jié)的mES增殖培養(yǎng)基。使用前，向培養(yǎng)基中加入1000U/ml白血病抑制因子(Esgro，Chemicon International)和50 μ M 二巰基醇(Gibco)。細(xì)胞在37°C 5%二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中生 長，細(xì)胞覆蓋前用0. 05%胰蛋白酶/EDTA傳代。在置于兩腔室斜面(Lab-tek腔室斜面，Nalge Nunc International)的 2x2cm 拓 撲芯片上植覆640000個細(xì)胞。用腔室斜面中的Viton 75，化合物51414墊片(Eriks NL) 保護芯片。為了達(dá)到細(xì)胞植覆的均勻性，用Park等在Lab Chip 2006，#(8), 988-994中描述 的技術(shù)制作植覆裝置。通過對聚甲基丙烯酸甲酯進(jìn)行微加工制作該裝置。植覆裝置包括一 個0. Imm的溝槽用于放置拓?fù)湫酒Ｆ溥€包括入口和出口儲存器，見圖4。為了保持細(xì)胞的營養(yǎng)，通過對植覆裝置包括入口和出口的改造(如圖5所示)，可 以達(dá)到培養(yǎng)基的連續(xù)層流，使用的流速為140μ 1/分。轉(zhuǎn)基因中國倉鼠卵巢細(xì)胞用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(在結(jié)構(gòu)性激活啟動子CMV的控制下表達(dá)GFP)檢測基于微 陣列掃描儀的成像。在組織培養(yǎng)瓶中用DMEM、10% FBS和100U/ml青霉素(Invitrogen)、 100 μ g/ml鏈霉素(Invitrogen)培養(yǎng)細(xì)胞。用植覆裝置將不同濃度的細(xì)胞植覆到拓?fù)湫酒?，植覆后成?小時，用熒光顯微鏡檢查植覆的均勻性。小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因中國倉鼠卵巢細(xì)胞圖6和圖7顯示采用本技術(shù)在拓?fù)湫酒线_(dá)到了均勻的細(xì)胞植覆密度。圖8證實 采用微陣列掃描儀通過熒光分析可以進(jìn)行拓?fù)湫酒母咄亢Y選。小鼠胚胎干細(xì)胞實驗顯 示這些細(xì)胞對細(xì)胞骨架的形狀改變有響應(yīng)，表面形貌呈現(xiàn)系統(tǒng)和有序的變化。實施例2拓?fù)湫酒闹谱鞑捎霉饪谭ê臀g刻法在面積為2cmX2cm的硅母版(siliconmaster)上創(chuàng)建拓 撲形貌。該設(shè)計由大約8000個不同的表面拓?fù)湫蚊步M成，這些拓?fù)湫蚊卜植荚谝粋€ 90 μ mX 90 μ m的方形區(qū)域，該區(qū)域稱為拓?fù)鋯卧?。每個拓?fù)鋯卧貜?fù)4次，最后由40000個 拓?fù)鋯卧獦?gòu)成一個拓?fù)湫酒?，其余的用空白拓?fù)鋯卧钛a。用Obducat熱壓/納米壓印工 具(Obducat AB公司，瑞典)進(jìn)行熱壓。將PLA片加載到覆有硅母的印跡系統(tǒng)中生產(chǎn)聚合 物微圖案芯片。在接近腔室地方進(jìn)行印跡，以便使壓力與硅母版和主材料底片都能接觸到。 在施加3兆帕的印跡壓力前，將主聚合物底物夾層加熱至80°C，高于PLA的Tg (600C ) 20°C。 經(jīng)過預(yù)定的壓印時間600秒后，使溫度下降到38°C，低于Tg，但維持施加的壓力。在到達(dá)此 溫度時，釋放壓力。將該聚合物慢慢冷卻到室溫，然后將硅母版與聚合物分離。細(xì)胞培養(yǎng)用固定的人類間質(zhì)干細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實驗。在由最少必需培養(yǎng)基 (a MEM Life Technologies)、10 % 胎牛血清(Cambrex 公司)，2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)，100 單位 /ml 青霉素(LifeTechnologies)和 10 μ g/ml 鏈霉素(Life Technologies)組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞。細(xì)胞在37°C 5%二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中 生長，細(xì)胞覆蓋前用0. 05%胰蛋白酶/EDTA傳代。用細(xì)胞在拓?fù)湫酒现哺睬?4小時，將 燒瓶中的培養(yǎng)基用無胎牛血清的培養(yǎng)基代替，使細(xì)胞挨餓，并同時使細(xì)胞周期進(jìn)入GO期。將1. 8 X IO6個細(xì)胞植覆到一個2cmX2cm的拓?fù)湫酒希撏負(fù)湫酒环旁谝粋€定 制的PMMA植覆裝置中，合上蓋子，從而使細(xì)胞平均分布在整個芯片表面。這些細(xì)胞被固定 并附著2小時，然后用植覆裝置繼續(xù)以100μ Ι/min的速度(使用蠕動泵)連續(xù)灌注培養(yǎng)基。免疫染色培養(yǎng)8小時后，在室溫下用PBS沖洗細(xì)胞，用4wt%多聚甲醛固定15min。再用 PBS沖洗，用0.01%曲拉通-X 100溶液滲透4分鐘。再用PBS漂洗樣品，用3%牛血清白 蛋白封閉30分鐘。然后用1 200倍稀釋的一級抗體抗人Ki-67(sc-15402 SantaCruz Biotechnology，Inc.)在保濕箱中培養(yǎng)樣品2小時。洗滌樣品，隨后用1 1000的山羊二 抗兔Alexa 488 (Molecular Probes)結(jié)合抗體在黑暗的保濕箱中培養(yǎng)1小時。再次洗滌樣 品，用 1 40 Alexa 568 鬼筆環(huán)Jft (Molecular Probes)和 1 μ g/ml DAPI 染色 20 分鐘。成像采用共聚焦高通量篩選系統(tǒng)(BD Pathway 435)對樣品進(jìn)行成像。短時間內(nèi)，通過 用3個探針循環(huán)創(chuàng)建一個宏，制作出整個芯片的蒙太奇(剪輯)圖像。圖像分析采用CellProf iler軟件進(jìn)行圖像分析。簡言之，將成像轉(zhuǎn)換為.png格式后，得到 蒙太奇圖像。然后通過包括網(wǎng)格算法的自定義通道(custom pipeline)運行這些圖像來鑒
14別拓?fù)鋯卧?。隨后，用DAPI和Alexa 488圖像來量化細(xì)胞數(shù)量和每拓?fù)鋯卧鲋臣?xì)胞的數(shù)目。結(jié)果熱壓印工藝生產(chǎn)的拓?fù)湫酒哂薪缦耷宄拇罅繌?fù)制一致的表面拓?fù)湫蚊病４?外，區(qū)分拓?fù)湫蚊矆D案的區(qū)域的精確陣列使我們可以對細(xì)胞行為進(jìn)行自動的高通量分析。 我們通過拓?fù)鋯卧軌蛞恢碌貐^(qū)分細(xì)胞。圖9a顯示了拓?fù)鋯卧g細(xì)胞的分布頻率。簡 言之，超過80%的拓?fù)鋯卧畛淞?6-14個細(xì)胞。此外，我們分析了 Ki-67的抗體染色的圖 像，我們能夠量化1467個拓?fù)鋯卧獏^(qū)域中每個拓?fù)鋯卧蠯i-67陽性細(xì)胞的數(shù)量。這些結(jié) 果說明了該技術(shù)的效果和可行性。
權(quán)利要求
用于分析材料表面和環(huán)境間相互作用的高通量篩選方法，包括 提供包括所述材料并具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列； 使至少部分所述大量單元與所述環(huán)境接觸；和 篩選所述微陣列以得出一個或多個所述單元與所述環(huán)境間的相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量篩選方法，其中所述環(huán)境包括組織、細(xì)胞、復(fù)合分子混 合物(例如體液、土壤、海水、空氣、細(xì)胞裂解液、器官或完整的有機體、廢品、尿、糞便)或特 異性分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量篩選方法，其中所述相互作用包括化學(xué)反應(yīng)、光譜移 動、氫鍵、受體_配體相互作用、電子轉(zhuǎn)移、能量轉(zhuǎn)移、粘附、靜電相互作用、范德華鍵、親水/ 疏水相互作用、偶極相互作用、抗原_抗體結(jié)合和/或特異性細(xì)胞行為。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量篩選方法，其中所述特異性細(xì)胞行為包括細(xì)胞定位、 細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和/或一種或多種蛋白的表達(dá)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述材料為生物可降解和/ 或生物可容性材料。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述材料選自下組聚氧乙 烯/聚對苯二甲酸丁二醇酯共聚物、聚酯家族的聚合物及其共聚物、聚內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚 酸酐、聚原酸酯，聚氨酯及其共聚物和/或共混物。
7.根根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的高通量篩選方法，其中所述材料選自陶瓷、金屬、 聚合物/陶瓷復(fù)合材料、碳及其共混物和/或復(fù)合物。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述微陣列包括至少100個 拓?fù)鋱D單元，優(yōu)選至少10000個拓?fù)鋱D單元，更優(yōu)選至少30000個單元，例如40000-300000 個單元。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述微陣列中單個拓?fù)鋱D單 元的表面積為 100-50000 μ m2，例如 500-25000 μ m2，或 1000-10000 μ m2。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述大量單元包括在垂直 于微陣列表面的方向上具有l(wèi)nm-100 μ m，優(yōu)選50nm-50 μ m尺寸的結(jié)構(gòu)形貌。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中至少部分所述單元的拓?fù)?圖在表面孔隙度、表面粗糙度、疏水性和/或形狀方面不同。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中給至少部分所述單元提供 生物活性化合物，例如肽、蛋白質(zhì)、糖類、抗原、抗體、DNA、RNA、脂類和/或生長激素。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述環(huán)境包括干細(xì)胞，優(yōu)選 間充質(zhì)干細(xì)胞，更優(yōu)選人間充質(zhì)干細(xì)胞。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述相互作用包括所述環(huán) 境中所含細(xì)胞的譜系特異性分化。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的高通量篩選方法，其中所述分化對成骨或軟骨形成譜系具 有特異性。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述相互作用包括一種或 多種熒光蛋白的表達(dá)。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的高通量篩選方法，其中所述一種或多種熒光蛋白受控于一種或多種骨骼特異性啟動子和/或一種或多種軟骨特異性啟動子。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的高通量篩選方法，其中所述一種或多種骨骼特異性啟動子 選自由BSP、骨鈣素、I型膠原蛋白和OSEl組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的高通量篩選方法，其中所述一種或多種軟骨特異性啟動子 選自由2型膠原蛋白、COMP和X型膠原蛋白組成的組。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的高通量篩選方法，其中所述篩選包括一種或多種 顯微鏡(例如光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡)，及由其衍生的技術(shù)例如熒光壽命成像、發(fā)光成 像、免疫組織化學(xué)、原位雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、熒光原位雜交、核磁共振、拉曼成像、紅外光 譜、原子力顯微鏡、電子顯微鏡、掃描探針顯微鏡、掃描近場光學(xué)顯微鏡、X射線光電子顯微 鏡、X射線顯微分析、X射線衍射和表面等離子體共振。
21.用于對材料表面和環(huán)境間的相互作用進(jìn)行高通量篩選的設(shè)備，包括-包括所述材料和具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；-用于使所述微陣列與所述環(huán)境接觸的接觸裝置；以及-用于監(jiān)測一個或多個所述單元與所述環(huán)境間的相互作用的檢測裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分析材料表面和環(huán)境間相互作用的高通量篩選方法，包括提供包括所述材料并具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；使至少部分所述大量單元與所述環(huán)境接觸；和篩選所述微陣列以得出一個或多個所述單元與所述環(huán)境間的相互作用。
文檔編號G01N33/543GK101952720SQ200880123869
公開日2011年1月19日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者克萊門斯·安東尼·萬·布利特斯韋克, 拜仁迪恩·雅各巴·帕彭伯格, 簡·德·波爾, 蒙特·維杰庫瑪·烏那德凱特, 迪米特里奧斯·斯達(dá)曼堤利斯, 馬賽厄斯·衛(wèi)斯林 申請人:屯特大學(xué)