專利名稱：細胞分析儀及細胞分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞分析儀及細胞分析方法。更詳細地說，是涉及一種用激光照 射流經(jīng)流動室的測定試樣，利用該測定試樣發(fā)出的光對測定試樣中所含細胞進行分析的細 胞分析儀和細胞分析方法。
背景技術(shù)：
例如，國際公開第2006/103920號公報上曾經(jīng)公布過，用激光照射含有待測細胞 的測定試樣，并利用該測定試樣發(fā)出的散射光和熒光測定各細胞大小和形狀的流式細胞技 術(shù)法。在此流式細胞技術(shù)法中，用鞘液包裹著含待測細胞的測定試樣，在鞘流室內(nèi)形成細 流，使細胞排成一列通過。以此可以防止數(shù)個細胞同時通過鞘流室檢測區(qū)。然而，細胞有時會在測定試樣中凝集，一旦發(fā)生凝集細胞(數(shù)個細胞凝集而成)， 將很難正確得出測定試樣中各細胞大小和形狀等信息。因此，國際公開第2006/103920號公報上公布的分析儀，檢測激光照射的測定試 樣發(fā)出的前向散射光，用所得前向散射光信號波形的差分積分值和該信號波形的峰值之 比，判斷信號波形是否存在波谷，判別凝集細胞和非凝集細胞(沒有數(shù)個細胞凝集，僅作為 單一細胞存在)然而，從細胞中檢出的前向散射光的信號波形高度會隨細胞的凝集狀態(tài)和細胞的 流動方向等發(fā)生變化，在前向散射光的信號波形中，其波峰和波谷的部分有時不甚清晰。因 此，在國際公開第2006/103920號公報上記述的分析儀在提高辨別凝集細胞和非凝集細胞 的精度上是有限的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于上述情況，提供一種能精確辨別凝集細胞和非凝集細胞的細胞分析儀 和細胞分析方法。本發(fā)明第一方面涉及的細胞分析儀是一種分析生物試樣中所含待測細胞的細胞 分析裝置，其特征之一是包括檢測部件，讓由生物試樣和色素制備的測定試樣流入流動 室，用激光照射流過該流動室的測定試樣，檢測該測定試樣發(fā)出的熒光；信號處理部件，根 據(jù)此檢測部件輸出的熒光信號獲取反映熒光信號波形高度的值和反映熒光信號波形棱線 長度的值；及分析部件，根據(jù)上述信號處理部件獲取的上述反映熒光信號波形高度的值和 上述反映熒光信號波形棱線長度的值，辨別數(shù)個細胞凝集而成的凝集細胞和非凝集細胞。本發(fā)明第二方面涉及的細胞分析儀是一種分析生物試樣所含待測細胞的細胞分 析裝置，包括檢測部件，讓由生物試樣和色素制備的測定試樣流入流動室，用激光照射流 過該流動室的測定試樣，檢測該測定試樣發(fā)出的熒光；信號處理部件，根據(jù)此檢測部件輸出 的熒光信號獲取反映熒光信號波形高度的第一值、反映熒光信號波形棱線長度的第二值和 反映待測細胞核的DNA含量的第三值；及分析部件，根據(jù)上述信號處理部件獲取的上述第 一值、上述第二值和上述第三值，從測定試樣所含待測細胞中區(qū)分出異常細胞。
本發(fā)明第三方面涉及一種細胞分析方法，其特征在于該方法包括四個步驟第 一步驟，混合生物試樣和色素，制備測定試樣；第二步驟，使制備的測定試樣流進流動室，激 光照射流經(jīng)該流動室的測定試樣，檢測該測定試樣發(fā)出的熒光；第三步驟，根據(jù)上述熒光生 成的熒光信號，獲取反映熒光信號波形高度的值和反映熒光信號波形棱線長度的值；第四 步驟，根據(jù)上述反映熒光信號波形高度的值和上述反映熒光信號波形棱線長度的值，辨別 數(shù)個細胞凝集而成的凝集細胞和非凝集細胞。本發(fā)明第四方面涉及一種細胞分析方法，其特征在于該方法包括四個步驟第 一步驟，混合生物試樣和色素，制備測定試樣；第二步驟，使制備的測定試樣流入流動室，激 光照射流經(jīng)該流動室的測定試樣，檢測該測定試樣發(fā)出的熒光；第三步驟，根據(jù)上述熒光生 成的熒光信號，獲取反映熒光信號波形高度的第一值、反映熒光信號波形棱線長度的第二 值和反映待測細胞核DNA含量的第三值；第四步驟，根據(jù)上述第一值、上述第二值和上述第 三值，從測定試樣所含待測細胞中區(qū)分出異常細胞。


圖1為本發(fā)明的細胞分析儀一實施方式的斜視說明圖；圖2為圖1所示細胞分析儀的結(jié)構(gòu)框圖；圖3為構(gòu)成系統(tǒng)控制裝置的電腦的框圖；圖4為光學(xué)檢測系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖；圖5為通過聚焦光斑的細胞的說明圖；圖6為以待測細胞熒光信號波形差分積分值除以峰值的商為縱坐標、以側(cè)向散射 光信號的脈沖寬度為橫坐標的散點圖。圖7為單一細胞的信號波形圖。圖8為2個細胞組成的凝集細胞的信號波形圖。圖9為3個細胞組成的凝集細胞的信號波形圖。圖10為以從測定試樣獲得的前向散射光信號峰值為縱坐標、前向散射光信號脈 沖寬度為橫坐標的散點圖。圖11為系統(tǒng)控制裝置CPU處理過程的流程圖。圖12為系統(tǒng)控制裝置CPU進行細胞分析處理的流程圖。圖13為光學(xué)檢測系統(tǒng)的側(cè)視圖。圖14為光學(xué)檢測系統(tǒng)的平面圖。圖15為以從測定試樣獲得的側(cè)向熒光信號的脈沖面積為橫坐標的直方圖。圖16為系統(tǒng)控制裝置的CPU進行第二細胞分析處理的流程圖。圖17為系統(tǒng)控制裝置的CPU進行第三細胞分析處理的流程圖。圖18為在測定試樣流動方向上的光束形狀的顯示圖。
具體實施例方式下面參照附圖，詳細說明本發(fā)明的細胞分析儀及細胞分析方法的實施方式。[細胞分析儀的整體結(jié)構(gòu)]圖1為本發(fā)明一實施方式涉及的細胞分析儀10的斜視說明圖。此細胞分析儀10用于讓含采自患者的細胞的測定試樣流過流動室，激光照射流經(jīng)此流動室的測定試樣，檢 測、分析測定試樣發(fā)出的光(前向散射光、側(cè)向熒光等)，以此判斷上述細胞中是否含有癌 細胞和異型細胞。具體而言，細胞分析儀10用于用宮頸部位的上皮細胞篩查宮頸癌。細胞 分析儀10包括進行試樣測定的儀器主體12、連接此儀器主體12并分析測定結(jié)果的系統(tǒng)控 制裝置13。如圖2所示，細胞分析儀10的儀器主體12包括用于從測定試樣檢測細胞及其核 大小等信息的光學(xué)檢測系統(tǒng)3、信號處理電路4、測定控制系統(tǒng)16、電機、操作設(shè)備、電磁閥 等驅(qū)動設(shè)備17和各種傳感器18。信號處理電路4包括對前置放大器(無圖示)放大的光 學(xué)檢測系統(tǒng)3的輸出信號進行放大和濾波等處理的模擬信號處理電路、將模擬信號處理電 路輸出的信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號的A/D轉(zhuǎn)換器，以及對數(shù)字信號進行一定波形處理的數(shù)字信 號處理電路。測定控制系統(tǒng)16在處理傳感器18的信號的同時，控制驅(qū)動設(shè)備17的動作， 以此進行測定試樣的吸移和測定。當篩查宮頸癌時，可以使用對采自患者宮頸的細胞(上 皮細胞)進行離心(濃縮)、稀釋(清洗)、攪拌(Tapping)和碘化丙啶(PI)染色等眾所周 知的處理方式所制備的試樣作為測定試樣。將所制測定試樣放入試管，放置在儀器主體12 的吸移管(無圖示)下面，由該 吸移管吸移供給流動室。上述PI染色用含有色素的熒光染 色劑碘化丙啶(PI)進行。PI染色是有選擇地對核染色，因此可以檢測出核發(fā)出的熒光。[測定控制系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)]測定控制系統(tǒng)16包括微處理器20、存儲器21、I/O控制器22、傳感器信號處理電 路23、控制驅(qū)動設(shè)備的驅(qū)動電路24和外部通信控制器25等。存儲器21由ROM、RAM等構(gòu) 成，ROM中裝有控制驅(qū)動設(shè)備17的控制程序和執(zhí)行控制程序所需的數(shù)據(jù)。微處理器20可 將控制程序下載到RAM或直接從ROM執(zhí)行。傳感器18的信號通過傳感器信號處理電路23和I/O控制器22傳送到微處理器 20。微處理器20通過執(zhí)行控制程序，可以按照傳感器18的信號通過I/O控制器22和控制 驅(qū)動部件的驅(qū)動電路24控制驅(qū)動設(shè)備17。微處理器20處理過的數(shù)據(jù)和需要微處理器20處理的數(shù)據(jù)通過外部通信控制器25 與系統(tǒng)控制裝置13等外部設(shè)備進行傳輸。[系統(tǒng)控制裝置的結(jié)構(gòu)]圖3為系統(tǒng)控制裝置13的框圖。系統(tǒng)控制裝置13由個人電腦等組成，主要由主 機27、顯示器28和輸入設(shè)備29構(gòu)成。主機27主要由CPU27a、R0M27b、RAM27c、硬盤27d、 讀取裝置27e、輸出輸入接口 27f、圖像輸出接口 27g構(gòu)成。以上這些均通過總線27h連接，
可互相通信。CPU27a可執(zhí)行存儲在R0M27b的計算機程序和讀到RAM27c中的計算機程序。 R0M27b由掩模(Mask) ROM、PROM、EPR0M、EEPROM等構(gòu)成，存儲由CPU27a執(zhí)行的計算機程序 及其所用數(shù)據(jù)等。RAM27c由SRAM和DRAM等構(gòu)成。RAM27c用于讀取存儲在R0M27b和硬盤 27d的計算機程序。另外，它還可以作為CPU27a執(zhí)行這些計算機程序時的工作空間。硬盤27d裝有操作系統(tǒng)和應(yīng)用程序等供CPU27a執(zhí)行的各種計算機程序以及執(zhí)行 計算機程序所需的數(shù)據(jù)。比如硬盤27d裝有美國微軟公司制售的windows (注冊商標)等 提供圖形用戶界面的操作系統(tǒng)。硬盤27d還裝有辨別凝集粒子和非凝集粒子的計算機程序 及其用于執(zhí)行計算機程序的數(shù)據(jù)。
硬盤27d還裝有操作程序，該程序負責傳送細胞分析儀10向測定控制系統(tǒng)16下 達的測定指令(動作命令)，接受并處理儀器主體12測定的測定結(jié)果，顯示處理的分析結(jié)果 等。此操作程序在上述操作系統(tǒng)上執(zhí)行。讀取裝置27e由軟驅(qū)、⑶-ROM驅(qū)動器或DVD-ROM驅(qū)動器等構(gòu)成，可讀取存儲于便 攜型存儲介質(zhì)的計算機程序或數(shù)據(jù)。輸入輸出接口 27f由比如USB、IEEE1394、RS-232C等 串行接口、SCSI、IDE、IEEE1284等并行接口以及由D/A轉(zhuǎn)換器和A/D轉(zhuǎn)換器等組成的模擬 信號接口構(gòu)成。輸入輸出接口 27f連接由鍵盤和鼠標構(gòu)成的輸入設(shè)備29，用戶可以用輸入 設(shè)備29直接向電腦輸入數(shù)據(jù)。另外，輸入輸出接口 27f與儀器主體12連接，可以與儀器主 體12相互傳輸數(shù)據(jù)等。圖像輸出接口 27g與由IXD或CRT等構(gòu)成的顯示器28連接，將與從CPU27a接收的 圖像數(shù)據(jù)相應(yīng)的映象信號輸出到顯示器28。顯示器28按照輸入的映像信號顯示圖像(畫 面)°[光學(xué)檢測系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)]圖4為光學(xué)檢測系統(tǒng)3的結(jié)構(gòu)圖。圖中，透鏡系列(光學(xué)系統(tǒng))52將光源半導(dǎo)體 激光器53發(fā)出的激光聚焦于流經(jīng)流動室51的測定試樣，聚光鏡54將測定試樣中細胞發(fā)出 的前向散射光聚光于散射光檢測器光電二極管55。為簡單明了，上述透鏡系列52僅圖示 了單一的透鏡，但更詳細地如圖13和圖14所示，可以形成從半導(dǎo)體激光器53—側(cè)起、由準 直鏡52a、柱面透鏡系列(平凸柱面透鏡52b+雙凹柱面透鏡52c)和聚光鏡系列(聚光鏡 52d+聚光鏡52e)構(gòu)成的透鏡群結(jié)構(gòu)。如圖13所示，從側(cè)面看光學(xué)檢測系統(tǒng)3，則半導(dǎo)體激光器53發(fā)出的放射狀激光被 準直鏡52a變?yōu)槠叫泄?，其徑直通過平凸柱面透鏡52b和雙凹柱面透鏡52c，由聚光鏡52d 和聚光鏡52e聚焦于流經(jīng)流動室51的測定試樣中的第一聚焦點A。另一方面，如圖14所示，從上方俯瞰光學(xué)檢測系統(tǒng)3，則半導(dǎo)體激光器53發(fā)出的放 射狀激光被準直鏡52a變?yōu)槠叫泄?，由平凸柱面透鏡52b向與測定試樣流動垂直的方向收 攏，并由雙凹柱面透鏡52c向與測定試樣流動垂直的方向散射，由聚光鏡52d和聚光鏡52e 聚焦于流動室51后方的第二聚焦點B。通過這種透鏡系列52，在第一聚焦點A的光束形狀(從半導(dǎo)體激光器53 —側(cè)看到 的光束形狀)為向測定試樣流動方向收縮，向測定試樣流向垂直方向延伸的長橢圓形。具 體而言，一個順流經(jīng)流動室51的測定試樣流向的直徑為3 8μπκ垂直于測定試樣流向的 直徑為300 600 μ m的聚焦光斑，在順測定試樣流向通過的平面上形成其第一聚焦點A，并 照射在流經(jīng)流動室51的測定試樣上。關(guān)于透鏡系列52不限定于上述結(jié)構(gòu)，也可以適當變更。另一個聚光鏡56將上述細胞和細胞核的側(cè)向散射光和側(cè)向熒光聚焦于分色鏡 57。分色鏡57將側(cè)向散射光反射到散射光檢測器光電倍增管58，讓側(cè)向熒光穿過熒光檢測 器光電倍增管59。這些光反映測定試樣中細胞及其核的特征。光電二極管55、光電倍增管 58和光電倍增管59將檢測出的光轉(zhuǎn)換為電信號，分別輸出前向散射光信號(FSC)、側(cè)向散 射光信號(SSC)和側(cè)向熒光信號(SFL)。這些信號由無圖示的前置放大器放大后，輸送到前 述信號處理電路4 (參照圖2)。
如圖2所示，通過信號處理電路4進行濾波處理和A/D轉(zhuǎn)換處理等信號處理所得的前向散射光數(shù)據(jù)(FSC)、側(cè)向散射光數(shù)據(jù)(SSC)和側(cè)向熒光數(shù)據(jù)(SFL)由微處理器20通 過外部通信控制器25輸送至前述系統(tǒng)控制裝置13。系統(tǒng)控制裝置13根據(jù)前向散射光數(shù)據(jù) (FSC)、側(cè)向散射光數(shù)據(jù)(SSC)和側(cè)向熒光數(shù)據(jù)(SFL)繪制用于分析細胞及其核的散點圖和
直方圖。 也可以用氣體激光代替上述半導(dǎo)體激光作為光源，但從低成本、小型且低耗電的 觀點來看，以采用半導(dǎo)體激光為宜，采用半導(dǎo)體激光不僅可以降低產(chǎn)品成本，還可以實現(xiàn)儀 器的小型化和省電。在本實施方式中使用的是有利于聚光的波長較短的藍色半導(dǎo)體激光。 藍色半導(dǎo)體激光對PI等的熒光勵起波長也有效。也可以使用半導(dǎo)體激光中低成本、長壽 命、廠家穩(wěn)定供貨的紅色半導(dǎo)體激光。本實施方式用上述透鏡系列52(圖4)等光學(xué)系統(tǒng)形成一定大小的聚焦光斑。具 體而言，在測定試樣上形成略呈橢圓形的聚焦光斑，其順測定試樣在流動室51流向的直徑 為3 8 μ m，垂直于測定試樣流向的直徑為300 600 μ m。圖5為細胞通過聚焦光斑的說 明圖，圖中上下方向為測定試樣流經(jīng)流動室51的流動方向。在圖5中，右側(cè)的聚焦光斑是 用于檢測血液中的紅細胞和白細胞的普通儀器的聚焦光斑，左側(cè)的聚焦光斑為本實施方式 的細胞分析儀的光學(xué)系統(tǒng)所形成的聚焦光斑。制圖時聚焦光斑的長方向尺寸比與之垂直方 向(圖中上下方向)的尺寸縮小了，但本實施方式實際的聚焦光斑截面形狀非常細長。在本實施方式中，光電倍增管59檢測流經(jīng)流動室的測定試樣發(fā)出的熒光，信號處 理電路4從光電倍增管59輸出的熒光信號獲取反映信號波形高度的值_熒光信號波形峰 值(PEAK)，同時獲取信號波形的差分積分值(DIV)作為反映信號波形棱線長度的值。圖 9(b)為圖9(a)的細胞C3的信號波形顯示圖，縱坐標表示檢出熒光的強度，橫坐標表示光信 號的檢出時間。如圖9(b)所示，熒光信號波形(單點劃線)的峰值(PEAK)表示檢出熒光 的最大強度(圖中的PEAK)，熒光信號波形的差分積分值(DIV)表示強度大于基線1 (Base Linel)的熒光信號波形的長度(點S 點T，點U 點V，點W 點X的波形長度合計)。系 統(tǒng)控制裝置13通過外部通信控制器25接收包括熒光信號波形的差分積分值(DIV)和熒光 信號波形峰值(PEAK)在內(nèi)的側(cè)向熒光數(shù)據(jù)，將熒光信號波形的差分積分值(DIV)除以熒光 信號波形峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)與一定閾值進行比較，辨別該細胞是凝集細胞還 是非凝集細胞。差分積分值是微分信號波形、將其絕對值加在一起所得的值，波形中沒有波谷的 信號差分積分值幾乎與其信號峰值的2倍值相同。另一方面，波形中有波谷的信號其差分 積分值大于該信號峰值2倍的值，波形中波谷越多，波谷越深，與峰值的2倍值之間的差也 越大。因此，系統(tǒng)控制裝置13考慮到疊加在信號上的噪聲等，將比“2”略大的值“2. 6” 作為辨別所測細胞是凝集細胞還是非凝集細胞的基準值、即上述“一定閾值”。另外，一定閾 值不限于2. 6，最好是2.2 3之間的值。熒光信號波形的差分積分值(DIV)除以熒光信號 波形峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)大于一定閾值意味著熒光信號的波形中至少有一個波 谷，以此可以將待測細胞歸類為數(shù)個細胞凝集而成的凝集細胞。圖6為以待測細胞的熒光信號波形的差分積分值(DIV)除以峰值(PEAK)所得 商(DIV/PEAK)為縱坐標、以側(cè)向散射光信號波形的脈沖寬度(SSCW)為橫坐標的(DIV/ PEAK) -SSCW 散點圖。
在圖6中，分布在A所示區(qū)域內(nèi)的細胞其縱坐標值(熒光信號波形的差分積分值 /峰值(DIV/PEAK))在約2 2. 6范圍內(nèi)，這些細胞是圖7 (a)所示那種單一細胞(非凝集 細胞)Cl。圖7(b)是細胞Cl的信號波形的顯示圖。如圖7(b)所示，單一細胞時，信號波形 的峰值為一個，但與前向散射光的信號波形(實線)和側(cè)向散射光的信號波形(虛線)相 比，熒光信號的波形(單點劃線)波峰很分明。 在圖6，分布在B所示區(qū)域內(nèi)的細胞縱坐標值約在3. 5 4. 2范圍內(nèi)，這些細胞是 圖8(a)所示那種2個細胞凝集而成的凝集細胞C2。在圖6中，分布在C所示區(qū)域內(nèi)的細胞 縱坐標值約在4. 5 7的范圍內(nèi)，這些細胞是圖9 (a)所示那種3個細胞凝集而成的凝集細 胞C3。圖8(b)是細胞C2的信號波形的顯示圖。從圖8(b)和圖9(b)可以看出，與前向散 射光的信號波形和側(cè)向散射光的信號波形相比，熒光信號的波形中，波峰和波谷的部分都 很分明。如上所述，與前向散射光的信號波形和側(cè)向散射光的信號波形相比，熒光信號的 波形其波峰和波谷的部分更分明，因此，可以精確地辨別是凝集細胞還是非凝集細胞。在本實施方式中，由于將在聚焦光斑處順著測定試樣流向的直徑調(diào)為3 8μπι， 可以提高細胞核檢測的S/N比。在本實施方式中，對細胞核實施PI染色，使用細胞核發(fā)出的 熒光信號，但是在PI染色中除細胞核以外，細胞膜也多少會被染色，殘余的用于染色的染 料會流到流動室，從細胞核以外也會發(fā)出熒光。因此，作為熒光檢測器的光電倍增管59 (圖 4)可能檢測出細胞核以外發(fā)出的作為噪聲的熒光。然而，光學(xué)檢測系統(tǒng)3的透鏡系列52使 在聚焦光斑處順著測定試樣流向的直徑縮小為3 8μπι，可以更明確地甄別細胞核發(fā)出的 熒光和細胞核以外發(fā)出的熒光。即，考慮細胞核的大小(5 7μπι)將聚焦光斑的直徑縮小 為3 8μπι，以此減少噪聲，使熒光信號脈沖的上升緣更尖銳，從而可以使波峰更加鮮明。要將聚焦光斑處的上述流向的直徑縮小到小于3μπι，就要縮短透鏡系列52的焦 距，激光在穩(wěn)定區(qū)域(焦點深度)的強度就會變?nèi)?。圖18為在測定試樣流動方向上聚焦光 斑形狀的顯示圖。如圖18所示，焦點深度表示束徑達到在聚焦光斑上的束徑D的1. 1倍的 區(qū)域，束徑越大，光的強度就越弱。焦點深度變淺，將不能使激光穩(wěn)定地照射在20 100 μ m 大小的細胞核上。另一方面，在上述流向上的直徑大于8 μ m，則檢測出細胞核以外發(fā)出的噪 聲熒光的比例會增大，從而熒光信號脈沖的上升緣變得平緩，熒光信號脈沖幅度的范圍變 得模糊，使測定精度下降。并且，大量細胞核同時從聚焦光斑內(nèi)通過的頻度增加，從這一點 上也會造成測定精度下降。因此，最好考慮到上述焦點深度，來選定聚焦光斑處測定試樣流 動方向上的直徑。具體而言，最好形成的聚焦光斑使聚焦于測定試樣流動方向上的激光焦 點深度為20 110 μ m。要穩(wěn)定地向細胞核照射激光，以聚焦光斑的在上述流動方向上的直 徑為3. 5 7. 5 μ m為宜，4 7 μ m更好。由于在聚焦光斑上垂直于測定試樣流向的直徑為300 600 μ m范圍內(nèi)，可以讓宮 頸部位的全部上皮細胞(約60μπι)從激光光束的穩(wěn)定區(qū)域(指設(shè)構(gòu)成高斯分布的激光峰 值強度為1，則強度達到0.95以上的區(qū)域)通過。以此可以從細胞中獲得穩(wěn)定的散射光，可 以精確地測定細胞大小。因垂直于流向上的直徑大于300 μ m，上述激光束的穩(wěn)定區(qū)域變寬， 可以從細胞中獲得穩(wěn)定的散射光。另一方面，由于垂直于流向方向上的直徑小于600 μ m，中 心附近的激光強度增強，可以獲得穩(wěn)定的散射光。要從細胞中獲得穩(wěn)定的散射光，最好垂直 于測定試樣流向上的直徑為350 550 μ m。
[異常細胞分類]細胞的癌化和畸變會加速細胞的分裂，致使DNA含量比正常細胞增多。因此可以 以此DNA含量為細胞癌化和畸變的指標。反映細胞核DNA含量的值可以用激光照射待測細 胞發(fā)出的熒光信號的脈沖面積(熒光量)(SFLI)來衡量。如圖9(b)所示，熒光信號的脈沖 面積(熒光量)(SFLI)表示基線l(Base Line 1)和熒光信號波形之間圍起來的部分的面 積。信號處理電路4從光電倍增管59輸出的熒光信號獲取熒光信號的脈沖面積(熒光量) (SFLI)作為反映待測細胞核的DNA含量的值。系統(tǒng)控制裝置13判斷此熒光量是否超過一 定閾值，如果超過一定閾值，則將該細胞歸類于有異常DNA含量的癌化和畸變細胞。篩查宮頸癌中使用的樣本大部分為正常細胞，因此，當以熒光信號的脈沖面積 (熒光量)為橫坐標繪制圖15所示直方圖時，波峰出現(xiàn)在相當于正常細胞的位置。此波峰 位置的熒光量反映正常細胞的DNA含量，因此，系統(tǒng)控制裝置13將顯示出其2. 5倍以上熒 光量的細胞歸類為異常細胞?？梢韵胂螅?個以上細胞相互凝集通過激光的光束斑點時，光電倍增管59將檢 出從多個細胞核發(fā)出的熒光，整體輸出大面積的脈沖。然而，如前所述，本實施方式可以利 用熒光信號波形的差分積分值除以峰值的商(DIV/PEAK)精確地排除凝集細胞生成的數(shù) 據(jù)，從而可以提高異常細胞(癌化和畸變細胞)的劃分精度。即可以防止誤將因為凝集細 胞而被作為含有大量DNA的細胞檢測出來歸類于異常細胞。測定試樣中有時除待測細胞以外還有粘液、血液殘渣、細胞碎片等碎片。這些碎片 在測定試樣中過多，則該碎片發(fā)出的熒光會作為噪聲被檢測出來，降低測定精度。此時，上 述碎片比待測細胞尺寸小，信號處理電路4會從光電二極管55輸出的前向散射光信號獲取 前向散射光信號波形的脈沖寬度(FSCW)和前向散射光信號波形的峰值(FSCP)作為反映含 待測細胞的粒子大小的數(shù)個參數(shù)。如圖7(b)所示，前向散射光信號波形的峰值(FSCP)表 示檢出的前向散射光的最大強度(圖中的FSCP)。前向散射光信號波形的脈沖寬度(FSCW) 表示強度大于基線2 (Base Line 2)的前向散射光信號波形的寬度。系統(tǒng)控制裝置13通過 外部通信控制器25從儀器主體12接收包括前向散射光信號波形的脈沖寬度(FSCW)和前 向散射光信號波形的峰值(FSCP)在內(nèi)的前向散射光數(shù)據(jù)。然后，系統(tǒng)控制裝置13使用前 向散射光信號波形的脈沖寬度(FSCW)和前向散射光信號波形的峰值(FSCP)繪制散點圖， 根據(jù)散點圖區(qū)分待測細胞和待測細胞以外的粒子(碎片)。圖10為以前向散射光信號波形的脈沖寬度(FSCW)為橫坐標、前向散射光信號波 形的峰值(FSCP)為縱坐標的FSCW-FSCP散點圖。碎片比待測細胞尺寸小，故反映粒子大小 的前向散射光信號波形的峰值(FSCP)和前向散射光信號波形的脈沖寬度(FSCW)也分別比 待測細胞小。在圖10中，分布在左下角的一群為碎片。因此，通過將G所示區(qū)域內(nèi)的細胞 作為以后的分析目標，可以進一步提高辨別是否為異常細胞的精確度。[細胞分析方法]
下面就用細胞分析儀10(參照圖1)對細胞分析方法的具體實施方式
進行說明。首先，使用者人工制備流入流動室的測定試樣。具體而言，對從患者宮頸部位采集 的細胞(上皮細胞)進行離心(濃縮)、稀釋(清洗)、攪拌(Tapping)和碘化丙啶(PI)染 色等眾所周知的處理，制備測定試樣。然后，使用者將制備的測定試樣裝入試管(無圖示)， 將試管放到儀器主體的吸移管(無圖示)下面。
下面，參照圖11和圖12說明系統(tǒng)控制裝置13的處理流程。首先，接通系統(tǒng)控制裝置13的電源，于是系統(tǒng)控制裝置13的CPU27a對系統(tǒng)控制 裝置13內(nèi)的計算機程序進行初始化(步驟Si)。CPU27a判斷是否收到了使用者的測定指 示(步驟S2)，如果收到測定指示，則通過I/O接口 27f向儀器主體12傳送測定開始信號 (步驟S3)。若未收到測定指示，則CPU27a將處理移至步驟S6。
測定開始信號一傳送到儀器主體12，在儀器主體12，裝在試管中的測定試樣便被 吸移管吸移到圖4所示的流動室51中。流經(jīng)流動室51的測定試樣受到激光光束照射，測 定試樣發(fā)出的前向散射光由光電二極管55檢出，側(cè)向散射光由光電倍增管58檢出，側(cè)向熒 光由光電倍增管59檢出。然后，光學(xué)檢測系統(tǒng)3輸出的前向散射光信號(FSC)、側(cè)向散射光信號(SSC)和熒 光信號(SFL)被輸送到信號處理電路4，在信號處理電路4經(jīng)過一定處理所獲得的測定數(shù)據(jù) 通過外部通信控制器25傳送至系統(tǒng)控制裝置13。另一方面，系統(tǒng)控制裝置13的CPU27a判斷是否通過外部通信控制器25從儀器主 體12收到測定數(shù)據(jù)(前向散射光信號(FSC)、側(cè)向散射光信號(SSC)和熒光信號(SFL))(步 驟S4)，如果收到測定數(shù)據(jù)，則在將該測定數(shù)據(jù)存入硬盤27d之后，進行細胞分析處理(步驟 S5)。如果未收到測定數(shù)據(jù)，CPU27a轉(zhuǎn)到步驟S6進行處理。細胞分析處理結(jié)束后，CPU27a判斷是否收到關(guān)機指示(步驟S6)，如果收到關(guān)機指 示則結(jié)束處理。如果未收到關(guān)機指示，則CPU27a返回步驟S2的處理。下面參照圖12說明步驟S5的細胞分析處理。首先，CPU27a將從儀器主體12收到的前向散射光數(shù)據(jù)中前向散射光信號波形 的脈沖寬度(FSCW)和前向散射光信號波形的峰值(FSCP)從硬盤27d讀取到RAM27c (步 驟S501)，以讀取的脈沖寬度(FSCW)為橫坐標，以峰值(FSCP)為縱坐標，繪制圖10所示 FSCW-FSCP散點圖(步驟S502)。然后，CPU27a將此散點圖內(nèi)G所示區(qū)域內(nèi)的細胞作為以 后分析的目標。G所示區(qū)域外的粒子由此被作為待測細胞以外的碎片排除。接下來，CPU27a將待分析細胞的側(cè)向熒光數(shù)據(jù)中熒光信號波形的差分積分值 (DIV)和熒光信號波形的峰值(PEAK)從硬盤27d讀取到RAM27c，獲取熒光信號波形的差分 積分值(DIV)除以熒光信號波形的峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)，同時將待分析粒子的側(cè) 向散射光數(shù)據(jù)中側(cè)向散射光信號波形的脈沖寬度(SSCW)從硬盤27d讀取到RAM27C (步驟 S503)。如圖8(b)所示，側(cè)向散射光信號波形的脈沖寬度(SSCW)表示強度大于基線3 (Base Line 3)的側(cè)向散射光信號波形的寬度。CPU27a以熒光信號波形的差分積分值除以峰值的 商(DIV/PEAK)為縱坐標，以側(cè)向散射光信號波形的脈沖寬度(SSCW)為橫坐標，繪制圖6所 示(DIV/PEAK)-SSCW 散點圖(步驟 S504)。CPU27a將熒光信號波形的差分積分值(DIV)除以熒光信號波形的峰值(PEAK)的 商(DIV/PEAK)與閾值2. 6比較，判斷分析目標細胞是凝集細胞還是非凝集細胞。在此，當 下列算式(1)成立時，該細胞為非凝集細胞，當算式(1)不成立時，該細胞為凝集細胞。DIV/PEAK ( 2. 6... (1)CPU27a對非凝集細胞和凝集細胞分別計數(shù)(步驟S505)。然后，CPU27a將待分析細胞的側(cè)向熒光數(shù)據(jù)中反映待測細胞核DNA含量的值-表 示熒光信號脈沖面積的熒光量(SFLI)從硬盤27d讀取到RAM27c (步驟S506)，該熒光量是反映待測細胞核DNA含量的值。CPU27a以熒光信號脈沖面積(熒光量)(SFLI)為橫坐標， 繪制圖15所示直方圖(步驟S507)。在此直方圖中波峰出現(xiàn)在相當于正常細胞的位置。CPU27a判斷待分析細胞的熒光量(SFLI)是否超過圖15所示直方圖中波峰出現(xiàn)位 置的熒光量(SFLIP)的2. 5倍，即下列算式(2)是否成立。SFLI ≥ SFLIP · 2. 5... (2)在此，當式⑵成立時，CPU27a將該細胞歸類于細胞核DNA含量異常的DNA含量 異常細胞，當式(2)不成立時，將該細胞歸類于正常細胞。而且，CPU27a還對歸類為DNA含 量異常細胞的細胞進行計數(shù)(步驟S508)。CPU27a從步驟S508獲取的DNA含量異常細胞 的計數(shù)中減去在步驟S505獲得的凝集細胞的計數(shù)，獲取異常細胞數(shù)(步驟S509)。接下來，CPU27a計算出步驟S505獲取的非凝集細胞數(shù)和步驟S509獲取的異常細 胞數(shù)的比率，獲取異常細胞比率(步驟S510)。此異常細胞比率是一個作為判斷細胞分析儀 10分析的樣本中是否存在一定數(shù)量以上的癌化和畸變細胞的指標數(shù)值。比如，當異常細胞 比率在1 %以上時，說明樣本中有一定數(shù)量以上的癌化和畸變細胞，受檢者由此可以知道自 己很可能受到癌癥侵襲。CPU27a將步驟S510獲取的異常細胞比率與在步驟S502繪制的FSCW-FSCP散點 圖、在步驟S504繪制的(DIV/PEAK)-SSCW散點圖以及在步驟S507繪制的直方圖一起通過 圖像輸出接口 27g(圖3)顯示在系統(tǒng)控制裝置13的顯示器28上(參照圖1)(步驟S511)。 CPU27a就是如上進行細胞分析處理的。此次公開的實施方式可以認為在所有方面均為例示，絕無限制性。本發(fā)明的范圍 不受上述實施方式的說明所限，僅由權(quán)利要求書的范圍所示，而且包括與權(quán)利要求范圍具 有同樣意思及權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有變形。比如，本實施方式是判斷采自受檢者的樣本中是否有一定數(shù)量以上的宮頸部位的 癌化和畸變細胞，但本發(fā)明的細胞分析儀不限于此，也可以用于判斷采自受檢者的樣本中 是否有一定數(shù)量以上的口腔細胞、膀胱和咽喉等其他上皮細胞的癌化和畸變細胞、甚至臟 器的癌化和畸變細胞。又如，本實施方式在顯示器上顯示異常細胞比率，但本發(fā)明的細胞分析儀不限于 此，也可以在顯示異常細胞比率的同時，顯示受檢者是否受癌癥侵襲的文字表述。受檢者可 以據(jù)此更容易地了解自己是否很可能已受到癌癥侵襲。另外，本實施方式在獲得凝集細胞數(shù)后，獲取DNA含量異常細胞數(shù)，從DNA含量異 常細胞數(shù)減去凝集細胞數(shù)，求得異常細胞(癌化和畸變細胞)數(shù)，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。圖16為系統(tǒng)控制裝置13的CPU27a進行第二細胞分析處理的流程圖。下面參照圖 16就第二細胞分析處理進行說明。在第二細胞分析處理中，CPU27a在步驟S5001 5004進行與圖12所示細胞分析 處理步驟S501 504相同的處理。接著，CPU27a在步驟S5003對待分析細胞作出上述式(1)是否成立的判斷，如果 式(1)成立，則該細胞作為非凝集細胞計數(shù)(步驟S5005)。然后，CPU27a將上述式(1)成立的非凝集細胞的熒光量(SFLI)從硬盤27d讀到 RAM27c (步驟S5006)。CPU27a以熒光量(SFLI)為橫坐標繪制直方圖(步驟S5007)。CPU27a將在步驟S5007繪制的直方圖中顯示出熒光量超過波峰出現(xiàn)位置的熒光量(SFLIP) 2. 5倍的細胞劃歸為異常細胞(癌化和畸變細胞)，對該細胞進行計數(shù)(步驟 S5008)。CPU27a在步驟S5009進行與圖12所示細胞分析處理的步驟S510相同的處理，獲 取異常細胞比率。接著，CPU27a將步驟S5009獲取的異常細胞比率與在步驟S5002繪制的 FSCff-FSCP散點圖、在步驟S5004繪制的(DIV/PEAK) -SSCff散點圖以及在步驟S5007繪制的 直方圖一起通過圖像輸出接口 27g(圖3)顯示在系統(tǒng)控制裝置13的顯示器28上(參照圖 1)(步驟S5010)。CPU27a就是如上進行第二細胞分析處理的。圖17為系統(tǒng)控制裝置13的CPU27a進行第三細胞分析處理的流程圖。下面參照 圖17就第三細胞分析處理進行說明。在第三細胞分析處理中，CPU27a在步驟S50001、50002進行與圖12所示細胞分析 處理步驟S501、502相同的處理。CPU27a將步驟S50002獲取的待分析細胞的側(cè)向熒光數(shù)據(jù)中熒光信號波形的差分 積分值(DIV)、熒光信號波形的峰值(PEAK)和熒光信號的脈沖面積-熒光量(SFLI)從硬盤 27d讀到RAM27C，求熒光信號波形的差分積分值(DIV)除以熒光信號波形的峰值(PEAK)所 得的商(DIV/PEAK)，同時，將待分析細胞的側(cè)向散射光數(shù)據(jù)中側(cè)向散射光信號波形的脈沖 寬度(SSCW)從硬盤27d讀到RAM27c (步驟S50003)。CPU27a繪制以熒光信號波形的差分 積分值除以峰值的商(DIV/PEAK)為縱坐標、以側(cè)向散射光信號波形的脈沖寬度(SSCW)為 橫坐標的(DIV/PEAK)-SSCW散點圖和以熒光信號脈沖面積(熒光量)(SFLI)為橫坐標的直 方圖(步驟S50004)。 CPU27a判斷上述式(1)和式⑵是否都成立，當上述式(1)和式(2)都成立時，將 該細胞劃歸為異常細胞(癌化和畸變細胞)，并對該細胞計數(shù)(步驟S50005)。在本步驟的 處理中，CPU27a將僅式(1)成立的細胞作為非凝集細胞計數(shù)。CPU27a在步驟S50006進行與圖12所示細胞分析處理的步驟S510同樣的處理，獲 取異常細胞比率。然后CPU27a將步驟S50006獲取的異常細胞比率與在步驟S50002繪制的 FSCff-FSCP散點圖、在步驟S50004繪制的(DIV/PEAK)-SSCW散點圖以及直方圖一起通過圖 像輸出接口 27g(圖3)顯示在系統(tǒng)控制裝置13的顯示器28上(參照圖1)(步驟S50007)。 CPU27a就是如上進行第三細胞分析處理的。細胞分析儀10用可染色待測細胞核的色素制備測定試樣，由檢測部件檢測該細 胞核發(fā)出的熒光。如前所述，從細胞發(fā)出的前向散射光信號波形中，根據(jù)細胞的凝集狀態(tài) 和細胞的流動方向等，波形的峰谷部分有時不鮮明，但在熒光信號的波形中，峰谷部分很鮮 明，因此，利用此細胞核發(fā)出的熒光可以精確地判斷是凝集細胞還是非凝集細胞。
權(quán)利要求
一種細胞分析儀，所述細胞分析儀是一種分析生物試樣中所含待測細胞的細胞分析儀，包括檢測部件，讓由生物試樣和色素制備的測定試樣流入流動室，用激光照射流過所述流動室的所述測定試樣，檢測所述測定試樣發(fā)出的熒光；信號處理部件，根據(jù)所述檢測部件輸出的熒光信號獲取反映熒光信號波形高度的值和反映熒光信號波形的棱線長度的值；及分析部件，根據(jù)所述信號處理部件獲取的所述反映熒光信號波形高度的值和所述反映熒光信號波形的棱線長度的值，辨別數(shù)個細胞凝集而成的凝集細胞和非凝集細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞分析儀，其特征在于所述信號處理部件獲取熒光信號 波形的峰值作為所述反映熒光信號波形高度的值，獲取熒光信號波形的差分積分值作為所 述反映熒光信號波形的棱線長度的值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞分析儀，其特征在于所述分析部件將所述熒光信號波 形的差分積分值除以所述熒光信號波形的峰值所得商與一定閾值比較，以此辨別凝集細胞 和非凝集細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞分析儀，其特征在于所述信號處理部件根據(jù)所述檢測 部件輸出的熒光信號獲取反映非凝集細胞的細胞核DNA含量的熒光量；所述分析部件比較所述信號處理部件獲取的所述熒光量和一定閾值，從所述測定試樣 中所含待測細胞中分出異常細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞分析儀，其特征在于所述待測細胞是宮頸部位細胞，所 述異常細胞是宮頸癌細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞分析儀，其特征在于所述檢測部件還檢測所述測定試 樣發(fā)出的散射光；所述信號處理部件根據(jù)所述檢測部件輸出的散射光信號，獲取反映所述測定試樣中含 待測細胞的粒子大小的數(shù)個參數(shù)；所述分析部件根據(jù)所述信號處理部件獲取的所述數(shù)個參數(shù)，區(qū)分待測細胞和待測細胞 以外粒子，再辨別被判斷為待測細胞的粒子是凝集細胞還是非凝集細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞分析儀，其特征在于所述檢測部件具有光學(xué)系統(tǒng)，能夠 在流經(jīng)所述流動室的所述測定試樣上形成聚焦光斑，所述聚焦光斑順著流經(jīng)所述流動室的 測定試樣流向的直徑為3 8 μ m，垂直于所述測定試樣流向的直徑為300 600 μ m。
8.一種分析生物試樣所含待測細胞的細胞分析儀，包括檢測部件，讓由生物試樣和色素制備的測定試樣流入流動室，用激光照射流過所述流 動室的所述測定試樣，檢測所述測定試樣發(fā)出的熒光；信號處理部件，根據(jù)所述檢測部件輸出的熒光信號獲取反映熒光信號波形高度的第一 值、反映熒光信號波形的棱線長度的第二值和反映待測細胞核的DNA含量的第三值；及分析部件，根據(jù)所述信號處理部件獲取的所述第一值、所述第二值和所述第三值，從所 述測定試樣所含待測細胞中分出異常細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細胞分析儀，其特征在于所述分析部件將所述第二值除以 所述第一值所得的商小于第一閾值、所述第三值大于第二閾值的細胞歸類為異常細胞。
10.一種細胞分析方法，包括第一步驟，混合生物試樣和色素，制備測定試樣；第二步驟，使制備的所述測定試樣流入流動室，激光照射流經(jīng)所述流動室的所述測定 試樣，檢測所述測定試樣發(fā)出的熒光；第三步驟，根據(jù)所述熒光生成的熒光信號，獲取反映熒光信號波形高度的值和反映熒 光信號波形的棱線長度的值；第四步驟，根據(jù)所述反映熒光信號波形高度的值和所述反映熒光信號波形的棱線長度 的值，辨別數(shù)個細胞凝集而成的凝集細胞和非凝集細胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細胞分析方法，其特征在于還包括第五步驟，根據(jù)所述第二步驟檢出的所述熒光生成的熒光信號，獲取反映非凝集細胞 核DNA含量的熒光量；第六步驟，比較所述熒光量和一定閾值，從所述測定試樣所含待測細胞中分出異常細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細胞分析方法，其特征在于所述待測細胞是宮頸部位細 胞，所述異常細胞是宮頸癌細胞。
13.一種細胞分析方法，包括第一步驟，混合生物試樣和色素，制備測定試樣；第二步驟，使制備的所述測定試樣流入流動室，激光照射流經(jīng)所述流動室的所述測定 試樣，檢測所述測定試樣發(fā)出的熒光；第三步驟，根據(jù)所述熒光生成的熒光信號，獲取反映熒光信號波形高度的第一值、反映 熒光信號波形的棱線長度的第二值和反映待測細胞核DNA含量的第三值；第四步驟，根據(jù)所述第一值、所述第二值和所述第三值，從所述測定試樣所含待測細胞 中區(qū)分出異常細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能精確辨別凝集細胞和非凝集細胞的細胞分析儀。細胞分析儀(10)具有光學(xué)檢測系統(tǒng)(3)，讓由生物試樣和色素制備的測定試樣流入流動室(51)，用激光照射流過該流動室(51)的測定試樣，檢測該測定試樣發(fā)出的熒光；信號處理電路(4)，根據(jù)此光學(xué)檢測系統(tǒng)(3)輸出的熒光信號，獲取反映信號波形高度的值和反映信號波形棱線長度的值；及系統(tǒng)控制裝置(13)，根據(jù)信號處理電路(4)獲取的反映熒光信號波形高度的值和反映熒光信號波形棱線長度的值，辨別數(shù)個細胞凝集而成的凝集細胞和非凝集細胞。
文檔編號G01N33/48GK101842688SQ20088011375
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者岸和希, 石坂正樹, 福田正和 申請人:希森美康株式會社