專利名稱：：電化學(xué)分析物檢測裝置和方法電化學(xué)分析物檢測裝置和方法本申請要求2007年7月26日提交的美國臨時申請NO.60/952，099的權(quán)益，為了所有的目的將該申請通過引用合并在此。
背景技術(shù)：
：本申請涉及用于樣品中分析物的電化學(xué)檢測的裝置和方法。本發(fā)明利用了分析物和裝置中所提供的至少一種試劑之間的特異性結(jié)合關(guān)系作為檢測所述分析物的手段。分析物與試劑之間的特異性結(jié)合構(gòu)成分析基礎(chǔ)的分析方法是已知的。例如，在酶聯(lián)免疫分析(EIA或ELISA)操作中，當(dāng)分析物存在時，通過分析物與抗體成分的相互作用，在固定的抗體和移動的酶-抗體試劑之間形成夾心物。這引起了酶的固定化。因而固定化酶的隨后的檢出是測試溶液中存在分析物的指示。(參見美國專利No.3，654，090，4，169，012和4，642，285)。類似的夾心分析在層析免疫分析中使用，其中移動試劑上的有色的標(biāo)簽(例如，有色的乳膠珠子)被誘捕到規(guī)定位置處的底物上，來產(chǎn)生指示樣品中分析物的存在的圖案。(參見美國專利NO.4，943，522,5,656，503,5,712，172和5，766，961)。取決于分析物和試劑之間的特異性結(jié)合的分析方法也可以采用競爭性分析的形式，其中包含標(biāo)記的試劑的復(fù)合物的形成在存在分析物時以分析物濃度依賴性的方式被抑制(參見，美國專利NO.4，868，131,5,981，298和5，989，921)，或采用置換分析的形式，其中包含標(biāo)記的試劑的預(yù)先存在的復(fù)合物在存在分析物時以分析物濃度依賴性的方式被破壞。(參見美國專利NO.4，746，631和6，020，209)。分析物的檢測取決于電化學(xué)測量的免疫分析也是已知的。美國專利No.5，149，630公開了一種分析，其中與底物反應(yīng)相關(guān)的、酶底物和電極之間電子轉(zhuǎn)移的程度被復(fù)合物的形成、或被任何配體復(fù)合物相對于未結(jié)合的酶標(biāo)記的成分的置換所擾亂。這種測定在存在施加的電勢的情況下進(jìn)行。在美國專利NO.5，198，367、5，427，912中公開的分析設(shè)備中，施加的電勢還用于測量電流，美國專利No.5，494，831公開了電流的應(yīng)用和測量產(chǎn)生結(jié)合的阻抗改變。發(fā)明概述本發(fā)明提供了利用結(jié)合相互作用用于樣品中分析物的電化學(xué)檢測的新的方法和裝置。本發(fā)明依靠這樣的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含有氧化還原酶的試劑被固定在一個電極的表面時所發(fā)生的、在兩個電極之間氧化還原酶的不對稱分布可以作為化學(xué)勢梯度來檢測，所述化學(xué)勢梯度來自被氧化或還原的氧化還原底物的分布方面的不對稱性。這種化學(xué)勢梯度可以通過觀察開路中電極之間的電勢差來電勢測定地檢測，或通過觀察當(dāng)電路閉合時電極之間的電流來電流測定地檢測。在兩種情況下，不對稱性的觀察可以在不對電極施加外部電勢或電流的情況下進(jìn)行。在本發(fā)明的第一個實(shí)施方式中，使用了夾心式分析。在這個實(shí)施方式中，要測試分析物的樣品在存在移動的測試試劑的情況下被導(dǎo)入測試槽。測試槽包含第一和第二電極。第一電極在其表面固定了固定的測試試劑。移動的測試試劑包含分析物結(jié)合部分和氧化還原酶部分，固定的測試試劑包含分析物結(jié)合部分。如果分析物存在于測試槽中的樣品中，至少部分所述移動的測試試劑變?yōu)楣潭ㄔ谒龅谝浑姌O上，從而當(dāng)分析物存在時在所述第一和第二電極之間產(chǎn)生氧化還原酶濃度方面的不對稱性。還提供了測試槽中氧化還原酶的氧化還原底物。氧化還原底物被所述氧化還原酶作用(氧化或還原)。如果在所述第一和第二電極之間的氧化還原酶濃度方面存在不對稱性(即，當(dāng)分析物存在于樣品中時)，這導(dǎo)致所述第一和第二電極之間的化學(xué)勢梯度。檢測這種化學(xué)勢梯度來測定樣品中的分析物。在這個實(shí)施方式中，不對稱性和產(chǎn)生的勢梯度越大，樣品中分析物的數(shù)量越大。在本發(fā)明的第二實(shí)施方式中，使用了競爭或置換型的分析。在這種分析中，氧化還原酶連接到可以結(jié)合共同的固定的測試試劑的分析物或分析物的類似物。任選地，提供已經(jīng)通過固定的測試試劑結(jié)合到電極的氧化還原酶。當(dāng)添加樣品時，所述樣品中存在的分析物將與氧化還原酶競爭固定的測試試劑所提供的結(jié)合位點(diǎn)，引起不對稱性的量的降低，如果所有結(jié)合位點(diǎn)被氧化還原酶占據(jù)這將發(fā)生。附圖的簡要描述附圖IA和B顯示了當(dāng)氧化還原酶分布不對稱(附圖1A)或?qū)ΨQ(附圖1B)時，在兩個電極之間還原的介質(zhì)分布的示意圖。附圖2A和B說明了利用電流計(jì)測定兩個電極處不對稱的酶分布。附圖3顯示了在本發(fā)明中有用的的夾心分析形式。附圖4和5顯示了在本發(fā)明中有用的競爭/置換分析形式。附圖6A-C顯示了具有相面對的電極的測試槽的構(gòu)建。附圖7A-C顯示了并排電極結(jié)構(gòu)的實(shí)例。附圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的計(jì)量器的外視圖。附圖9顯示了在本發(fā)明的計(jì)量器中可用的電路。附圖10顯示了在開路中兩個電極之間酶分布不對稱性的不同水平下作為時間的函數(shù)的電勢差。附圖11顯示了在短路中兩個電極之間酶分布不對稱性的不同水平下作為時間的函數(shù)的電流。附圖12顯示了峰電勢差與電極酶活性比例的相關(guān)性。附圖13顯示了峰電流與電極酶活性比例的相關(guān)性。附圖14顯示了χ軸上已知的總酶Et和y軸上測量的I3tltl的示意性的標(biāo)繪圖。附圖15顯示了χ軸上已知的Et和y軸上測量的Itl的示意性的標(biāo)繪圖。附圖16顯示了log(R)如何影響Itl對比Et的斜率的標(biāo)繪圖，其用于得出參數(shù)a和b0附圖17顯示了Iog(R)影響Itl對比Et的截距的標(biāo)繪圖，其用于得出參數(shù)參數(shù)c和cL附圖18顯示了如根據(jù)本發(fā)明測定的，酶的實(shí)際數(shù)量與酶的估計(jì)數(shù)量之間的相關(guān)性。發(fā)明的詳細(xì)說明I.定義如在本申請的說明書和權(quán)利要求中使用的，應(yīng)當(dāng)采用以下定義(a)“分析物”是指可能在樣品中存在的感興趣的材料。在本發(fā)明中可檢測的分析物是可在特異性結(jié)合相互作用中與至少一種其他試劑締合的那些，它們可以參與此處描述的夾心、競爭或置換分析結(jié)構(gòu)。分析物的實(shí)例包括抗原或半抗原，例如肽(例如激素)、蛋白質(zhì)(例如酶)、藥物、殺蟲劑、微生物、抗體和可以與互補(bǔ)序列參與序列特異性雜交反應(yīng)的核酸。(b)“分析物特異性酶成分”或試劑是指包含分析物結(jié)合部分和氧化還原酶部分兩者的試劑。分析物特異性酶成分被適當(dāng)?shù)赜米饕苿釉噭?c)“分析物的測定”是指用于評估樣品的定性的、半定量的和定量的過程。在定性評估中，結(jié)果表明分析物是否在樣品中檢出。在半定量的評估中，結(jié)果表明是否存在超過某一預(yù)定閾值的分析物。在定量評估中，結(jié)果是存在的分析物的數(shù)量的數(shù)字性指示。(d)術(shù)語“氧化還原酶”是指氧化或還原底物的酶。這樣的酶一般可以稱為氧化酶、過氧化物酶、還原酶或脫氫酶。例如葡萄糖氧化酶和各種過氧化物酶的酶通常在分析設(shè)備中使用，因而穩(wěn)定形式的這些酶的制備是公知的。(e)術(shù)語“氧化還原底物”是指與氧化還原酶相互作用來生產(chǎn)化學(xué)勢梯度的化合物或化合物的組合。在某些情況下，酶底物可以直接產(chǎn)生足夠創(chuàng)造化學(xué)勢梯度的氧化還原活性物種。在其它情況中，二級化合物可能是需要的。例如，對葡萄糖氧化酶來說，與葡萄糖的相互作用產(chǎn)生葡糖酸內(nèi)酯和還原的酶，當(dāng)還原的酶被介質(zhì)化合物氧化時產(chǎn)生化學(xué)勢梯度，所述介質(zhì)化合物是化學(xué)勢梯度中實(shí)際的氧化還原活性物種。因而，在這種情況下，“氧化還原底物”是底物化合物葡萄糖和介質(zhì)化合物的組合。(f)術(shù)語“化學(xué)勢梯度”是指氧化還原活性物種的濃度梯度。將理解的是，更為嚴(yán)格地，勢梯度來自電極之間還原的物種與氧化的物種的比例方面的梯度，然而，一種物種的濃度梯度的思想更容易被體現(xiàn)，因而在此處使用。當(dāng)在兩個電極之間存在這樣的梯度時，如果電路是開放的，可以檢測電勢差，當(dāng)電路閉合時，電流將流動直到梯度消失。將理解的是，在本發(fā)明的設(shè)備中化學(xué)勢梯度是短暫的，當(dāng)停止產(chǎn)生新的氧化還原活性物種時，氧化還原活性物種的分布將隨著時間的過去而平均。在此使用的術(shù)語“化學(xué)勢梯度”僅僅指來自氧化還原酶分布的不對稱性的這種短暫的梯度，而不是指來自電極之間電勢差或電流的施加的任何電勢梯度。(g)用語“檢測第一和第二電極之間的化學(xué)勢梯度”是指使用電勢或電流的測量手段檢測開路或閉路中的化學(xué)勢梯度。(h)術(shù)語“酶活性”和“酶濃度”在此作為等價的術(shù)語使用，盡管將理解的是在正常使用中它們具有不同的含義。酶的活性提供了酶的催化能力的定量度量。這不僅取決于容積中存在的酶的物理數(shù)量(即，濃度)，還取決于影響酶的催化效率的條件。本發(fā)明實(shí)際上測量酶活性的不對稱性，因?yàn)闊o活性的酶的存在將不會產(chǎn)生氧化還原底物的不對稱性。然而，由于期望的是控制酶的質(zhì)量和條件，這實(shí)際上也是酶濃度方面的不對稱性的度量。(i)術(shù)語“固定在第一電極上”是指直接或間接地固定在電極的表面上，條件是所固定的材料變?yōu)楣潭ㄔ谂c所述第一電極相關(guān)的容積中，并且相比第二電極更接近第一電極。例如，對于電極_抗體_分析物_抗體_酶夾心物的形成來說，酶被認(rèn)為“固定”在電極上，雖然在夾心物中存在著幾個插入的部分。(j)術(shù)語“固定的測試試劑”是指當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的分析時、與電極締合的夾心物或競爭/置換反應(yīng)的成分。固定可以通過固定的測試試劑和電極的表面之間化學(xué)鍵(共價的或非共價的)的形成，或可以是物理的締合，如通過在在電極的表面上設(shè)置的凝膠或膜內(nèi)固定的測試試劑的放置。固定的測試試劑包含結(jié)合部分，當(dāng)分析物存在于樣品中時，其與分析物相互作用來產(chǎn)生氧化還原酶分布方面的改變(作為分析物結(jié)合酶成分的部分)。在某些實(shí)施方式中，固定的試劑將在試驗(yàn)裝置的開始制造期間被固定。在其他實(shí)施方式中，固定將在添加樣品之后原位發(fā)生。因而，術(shù)語固定的測試試劑是指任何狀況，其中獲得具有分析物的結(jié)合位點(diǎn)的電極_(接頭)n_試劑的結(jié)構(gòu)，其中η是O或1或更大的整數(shù)。后一選擇容許產(chǎn)生一組通用的設(shè)備，其中連接試劑不是分析物特異性的，添加了結(jié)合接頭和分析物的試劑用于任何給定的分析物特異性測試。這種另外的試劑可以在制造時添加到測試條上，或在應(yīng)用于試驗(yàn)設(shè)備之前添加到樣品中。II.本發(fā)明的原理為了方便起見，將在葡萄糖氧化酶作為氧化還原酶、葡萄糖和介質(zhì)的組合作為氧化還原底物的情境下討論本發(fā)明的理論基礎(chǔ)。然而，該討論中的任何事物不應(yīng)被當(dāng)作將本發(fā)明限制為使用這些材料的指示。在通常的葡萄糖測量系統(tǒng)中，樣品槽中存在的酶將葡萄糖氧化為葡糖酸內(nèi)酯，酶被還原。氧化的介質(zhì)(例如鐵氰化物)與還原的酶作用來再生酶的氧化形式，并產(chǎn)生還原的介質(zhì)。這個過程繼續(xù)，直到葡萄糖或氧化的介質(zhì)被耗盡。如果酶在樣品槽中不對稱地分布，則還原的介質(zhì)的產(chǎn)生也是不對稱的，在還原的介質(zhì)的分布方面產(chǎn)生的不對稱性即使在有限的試劑耗盡后也持續(xù)一段時間(由擴(kuò)散參數(shù)決定)。當(dāng)還原的介質(zhì)存在于兩個電極之間的溶液中時，兩個電極之間的電勢差由能斯特方禾呈(Nernstequation)得出<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中E是電極1和2之間的電勢差，R是氣體常數(shù)，T是絕對溫度，F(xiàn)是法拉第常數(shù)。當(dāng)由于沒有不對稱性，兩個電極處還原的介質(zhì)的濃度方面沒有差異時(即，沒有化學(xué)勢梯度)，介質(zhì)項(xiàng)減為1，Iogl=O,因而電勢差是0。隨著不對稱性提高，電勢差提高。此外，如果系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為在測量時氧化的介質(zhì)濃度比還原的介質(zhì)的數(shù)量大(由于開始氧化的介質(zhì)的大量過量或測量的快速進(jìn)行，或兩者)，則兩個電極處氧化的介質(zhì)的濃度是基本上相等的，方程式可以簡化為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>附圖IA和B顯示了當(dāng)氧化還原酶分布不對稱(附圖1A)或?qū)ΨQ(附圖1B)時，在兩個電極(1，2)之間還原的介質(zhì)分布的示意圖。上述方程式可以用于利用電勢測定法測定兩個電極1和2處酶的濃度比例。兩個電極在開放電路中連接，測量它們之間的電勢差。如果酶3在一個電極比另一個電極處是更為有活性或濃縮的(S卩，它具有如附圖IA所示的不對稱分布)，還原的介質(zhì)的濃度將在該電極處比另一個高，產(chǎn)生電極之間的電勢差。如果在兩個電極處存在著酶的相等的活性或濃度(即，它具有如附圖IB所示的對稱分布)，在每個電極處還原的介質(zhì)的濃度將是相等的，電極將是等電勢的，測量的電勢差將是O。如果，不使用電勢測定法，電極在短路中連接，酶活性的不對稱分布將產(chǎn)生還原的介質(zhì)的不對稱分布，其可以在通過閉合電極之間的電路使電極之間的電勢差趨向零時通過跟蹤(follow)電流來觀察到。如果還原的介質(zhì)通過酶活性產(chǎn)生并且擴(kuò)散到電極，電流將流動，足夠的介質(zhì)將被再氧化，從而還原的介質(zhì)濃度在兩個電極處相等。電流將與還原的介質(zhì)向兩個電極的流動的差異成比例。附圖2A和B說明了這些原則用來利用電流測定法定量兩個電極處的酶的濃度比的用途。兩個電極在短路中連接，測量它們之間的電流。隨著電極之間的電勢差被限制為零，當(dāng)必需在每個電極處維持等量的化學(xué)勢時，介質(zhì)將在電極處被還原或氧化。當(dāng)還原的介質(zhì)在一個電極被氧化時，電流將流動，等量的氧化的介質(zhì)將在另一個電極處被還原。如果在每個電極處的酶活性是相等的，將不必需要電子傳遞來保持化學(xué)勢平衡，從而將沒有電流流動。如果在一個電極處存在比另一個電極處更高的酶活性，還原的介質(zhì)在該電極處將被消耗，在另一個電極處產(chǎn)生以維持平衡的化學(xué)勢，電流將流動。III.實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明的原理適合于測定樣品中的分析物的實(shí)際應(yīng)用。這可以在各種結(jié)合形式下進(jìn)行。一般地，使用兩個分析物特異性的化學(xué)成分，選擇它們以相應(yīng)于要測定的分析物。一般地，希望的是有至少一個成分(一般是分析物-受體)高度特異于該分析物，而另一個成分在它的結(jié)合方面可以是較低特異性的。各種非限制性的組合在表1中闡述。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>要理解的是，在本領(lǐng)域中，設(shè)備中包含的“抗體”可以是完整抗體，例如免疫球蛋白，或它可以是抗體的工程化的結(jié)合部分，例如單鏈抗體(scFv)或結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)，如在www.domantis.com中描述的。藥物的免疫分析在美國專利NO.7，220，842,5,677，132和5，618，926中描述了。殺蟲劑和殺蟲劑降解產(chǎn)物的免疫分析在美國專利NO.6，635，434中描述了。藥物和激素受體可以是天然的激素受體，或者它們可以是本領(lǐng)域已知的具有類似結(jié)合性質(zhì)的工程化的物種。(參見美國專利Nos.7，214，511和6，806，359，Rasmussenetal，J.BiolChem.，Vol.276，Issue7,4717-4723,February16,2001)美國專利公開20050130208公開了可卡因特異性適體，其可以用作分析物特異性酶成分的結(jié)合部分，或用作固定的測試試劑。其他適體在Ellington研究小組在http//aptamer.icmb.utexas.edu/白勺；據(jù)庫上歹Ij出。Miretal.“DifferentStrategiesToDevelopanElectrochemicalThrombinAptasensor."ElectrochemicalCommunication8(2006)505-511已經(jīng)描述了酶-適體偶聯(lián)。反應(yīng)的成分按照這樣的方式組合，從而它們?nèi)Q于樣品中分析物的存在或不存在在氧化還原酶的分布對稱性方面引起差異。多種設(shè)備形式可以實(shí)現(xiàn)這種結(jié)果。A.夾心形式附圖3顯示了兩個電極31和32。電極31具有固定在其內(nèi)表面上的分析物特異性受體33。分析物34與分析物特異性受體33締合。還存在的是分析物特異性酶試劑35以及氧化還原底物36、36'，所述分析物特異性酶試劑35與分析物以這樣的方式締合，從而在結(jié)合和未結(jié)合狀態(tài)下酶的活性被維持。當(dāng)存在分析物34時，由于受體33-分析物34-分析物特異性酶物種35夾心物的形成，分析物特異性酶試劑35的捕獲在電極31的表面發(fā)生。酶的活性引起接近電極31處一種形式的氧化還原底物(對于附圖3來說，36的形式)的濃度提高，由此其量值與分析物的數(shù)量相關(guān)的、可檢測的化學(xué)勢梯度產(chǎn)生。當(dāng)不存在分析物時，夾心物不形成，因而不產(chǎn)生可檢測的化學(xué)勢梯度。B.競爭/置換形式附圖4和5顯示了根據(jù)本發(fā)明的分析設(shè)備的競爭形式。樣品槽被兩個電極41、42限制。電極41具有配置在上面的分析物受體43。氧化還原酶45包含與分析物或分析物模擬物連接的酶。在不存在分析物時，如附圖4中所示，氧化還原酶45連接到分析物受體43，引起氧化還原酶的分布方面的不對稱性。取決于氧化還原酶、分析物受體的數(shù)量以及分析物受體與氧化還原酶的親和力，另外的氧化還原酶45'可以存在于批量的樣品中。如附圖5中所示，當(dāng)存在分析物44時，它與氧化還原酶45競爭分析物受體43，引起至少某些氧化還原酶45從分析物受體43上的置換，產(chǎn)生氧化還原酶的較低不對稱的分布，因而能夠測定樣品中的分析物。C.設(shè)備構(gòu)建_具有相面對的電極的樣品槽附圖6A-C顯示了使用相面對的電極構(gòu)建的、根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的樣品槽。該設(shè)備由各自具有面向設(shè)備內(nèi)部的導(dǎo)電表面(6Γ，62')的頂層61和底層62和絕緣分隔層63組成。接點(diǎn)64和65從頂層61和底層62伸出，以容許接觸導(dǎo)電表面用于電勢或電流測量。如在附圖6B中所示，導(dǎo)電層63在其中具有開口，其與相面對的導(dǎo)電表面61'和62'—起限定了樣品槽。這個樣品槽是向外部開放的用于導(dǎo)入樣品，例如，通過在附圖6C中所示的最后的設(shè)備上的開口66。例如，用于形成具有多個開口和/或排氣孔的這種類型的槽的各種結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的，因?yàn)椴鄣奶囟ㄔO(shè)計(jì)對于本發(fā)明的實(shí)踐不是關(guān)鍵的。類似地，連接器的其他設(shè)計(jì)是已知的，這對于本發(fā)明的實(shí)踐也不是關(guān)鍵的。在本發(fā)明的設(shè)備的一個實(shí)施方式中，導(dǎo)電表面(61'或62')之一具有放置在上面的分析物受體(固定的測試試劑)。用于分析物測定的試劑的其余部分可以作為干燥的試劑層67配置在樣品槽內(nèi)，或可以在導(dǎo)入樣品槽之前添加到樣品中。附圖6A-C所示的樣品槽部分一般作為單一用途的、一次性的部件來構(gòu)建。D.設(shè)備構(gòu)津-并排的電極除了上文討論的相面對的電極之外，第一和電極可以放置在樣品槽內(nèi)的同一表面上。這種結(jié)構(gòu)在此稱為并排的電極。附圖7A-C顯示了可以用于并排結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的非限制性實(shí)例，包括平行的條(附圖7A)、交錯的條(7B)和同心環(huán)(附圖7C)。在每種情況下，在電極71和另一個電極72之間的氧化還原酶分布的不對稱性引起兩個電極之間可測量的化學(xué)勢梯度。附圖7A-C所示的樣品槽部分一般作為單一用途的、一次性的部件來構(gòu)建。E.設(shè)備構(gòu)津_結(jié)果的傳汰除了樣品槽之外，本發(fā)明的設(shè)備具有以指示分析物的測定的有意義的方式向用戶傳達(dá)觀察到的電勢或電流的工具。這可以是從簡單的定性結(jié)果(分析物存在或不存在)到分析物數(shù)量的具體數(shù)值。傳達(dá)方式的技巧相應(yīng)地變化。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，為了提供定性的結(jié)果，設(shè)備可以在可見的位置具有材料的斑點(diǎn)，其響應(yīng)于超過閾值水平的不對稱性所產(chǎn)生的電流通過或電勢差的施加而改變顏色。在這種情況下，設(shè)備不需要獨(dú)立的計(jì)量器部分，可以僅僅是具有外側(cè)的指示物斑點(diǎn)的一次性的測試條。更通常地，樣品槽將被包含在一次性的測試條內(nèi)，所述測試條被插入可再次使用的的計(jì)量器中。所述計(jì)量器含有在樣品或測試條導(dǎo)入之后規(guī)定的時間測量電勢差或電流的電子元件，以及用于將測量的值轉(zhuǎn)變成顯示的值的電子元件。這種轉(zhuǎn)變可以利用查詢表(look-uptable)，所述查詢表根據(jù)特定的設(shè)備幾何結(jié)構(gòu)和分析物的校準(zhǔn)值將電流或電勢的特定值轉(zhuǎn)變成分析物的值。附圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的計(jì)量器的外視圖。如所示，計(jì)量器具有帶有顯示器82的外殼81，和一個或更多個控制接口83(例如，開關(guān)按鈕或滾輪等等)。外殼具有狹槽84用于接受測試設(shè)備。在外殼81的內(nèi)部是電路，用于當(dāng)施加樣品時向測試設(shè)備的電極施加電勢或電流。這可以在來自用戶的啟動信號之后、或在測試設(shè)備插入和樣品施加的自動檢測之后進(jìn)行。在本發(fā)明的計(jì)量器中可用的適合的電路是本領(lǐng)域已知的，例如，來自美國專利公布NO.US2005-0265094A1，通過引用將其合并在此。在附圖9中顯示了一個這樣的電路。在附圖9中，提供了理想的電壓計(jì)942，其可以測量跨越電極941、938的電勢。提供了開關(guān)944，當(dāng)要測量電勢時它是開放的，測量電流時是閉合的。當(dāng)開放時，槽939對于它的電極的至少一個是“漂浮的”，允許不受放大器935處的信號影響的電壓測量。開關(guān)944可以是機(jī)械開關(guān)(例如，繼電器)或FET(場效應(yīng)晶體管)開關(guān)或固態(tài)開關(guān)。在簡單的實(shí)例中，所述開關(guān)對開路開放；更一般地，它可以對非常高的電阻開放。這個電路可以用于測量電勢差或電流差。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，其他電路，包括更簡單得多的或更復(fù)雜的電路可以用于實(shí)現(xiàn)電勢差或電流之一或兩者的應(yīng)用。附圖9的電路也可以用于向本發(fā)明的測試設(shè)備施加電勢差。雖然，如以上討論的，電勢的這種施加不是進(jìn)行本發(fā)明的測量所必需的，在測量之前施加電勢(特別是在相面對的電極結(jié)構(gòu)的測試設(shè)備中)可以通過利用本質(zhì)上為電泳的手段有效地驅(qū)動分析物和/或分析物結(jié)合酶成分接近具有固定試劑的電極來產(chǎn)生更為快速的測量，只要所述分析物或分析物結(jié)合酶成分在測試設(shè)備內(nèi)的條件下(特別是PH值)是帶電的。從負(fù)到正的電勢差的階梯函數(shù)或正弦波也可以起到某種類似于試驗(yàn)設(shè)備內(nèi)的原位洗滌的作用。VI.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了進(jìn)行結(jié)合分析、用于使用電化學(xué)的檢測來檢測分析物的能力，而不需要施加外部的電勢或電流，不需要通常在夾心免疫分析操作中采用的洗滌步驟。因此，用于進(jìn)行該分析的裝置可以更為簡單、易于使用和更便宜。此外，電化學(xué)分析中的設(shè)備部件與例如在光學(xué)測量中使用的那些相比是更為有效的，便于供一次性測試設(shè)備使用的低成本可再次使用的計(jì)量器的制造。本發(fā)明可以使用小樣本的血液、淚液、唾液或汗液，具有對受試者的最小的侵入性(樣品少于10μ1，優(yōu)選的少于1μ1是血液測試特別希望的)。進(jìn)一步的，本發(fā)明可以提供非?？焖俚臏y試時間。通常的免疫分析操作花費(fèi)一小時或更久。本發(fā)明的測試設(shè)備的小體積以及測試對酶的分布方面小的差異的敏感性意味著，取決于要測量的分析物的濃度以及所述分析物與移動和固定試劑的結(jié)合成分的結(jié)合動力學(xué)，更短的時間是可能的(例如，低于30分鐘，更優(yōu)選的低于10分鐘，最優(yōu)選的低于1分鐘)。取決于樣品和氧化還原底物的性質(zhì)，可能的是使用來自樣品的材料作為反應(yīng)系統(tǒng)的部分。例如，當(dāng)樣品是血液樣品時，可以使用內(nèi)源的葡萄糖作為基于葡萄糖氧化酶的系統(tǒng)中氧化還原底物的成分。實(shí)施例在以下實(shí)施例中，使用模型系統(tǒng)展現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)用性和可操作性，其中酶被包被在電極對的兩個電極之一的表面上。這種模型不需要酶的捕獲，因而對于使用有限量的變量對捕獲后的行為建模是有用的，然而它不能提供實(shí)際測試系統(tǒng)的結(jié)合動力學(xué)的完整圖形。在其他的酶夾心、競爭和置換分析等等中利用試劑捕獲酶是公知的。實(shí)施例1使用通過引用合并在此的美國專利公開NO.US-2005-0258035-A1中描述的方法，構(gòu)建了包含由雙側(cè)的粘結(jié)層分隔的兩個金電極的電化學(xué)槽測試條?？倲?shù)IOOnL的酶溶液(IOOmM檸檬酸鈉緩沖液pH4.1中27mg/mL葡萄糖氧化酶)分配到兩個電極上并容許干燥。通過將IOOnL的酶溶液分?jǐn)傇趦蓚€電極之間，用水進(jìn)行平衡，制備具有不同比例的電極酶活性的測試條。例如，為了制備在電極1上具有75%酶活性、在電極2上具有25%酶活性的條，3份酶溶液與1份水的混合物IOOnL分配到電極1上，1份酶溶液與3份水的混合物IOOnL分配到電極2上。IOOmMβ-D-葡萄糖和IOOmM鐵氰化鉀的水溶液添加到電化學(xué)槽中。記錄開路中的電勢差(附圖10)或短路中的電流(附圖11)。注意的是，在不同的不對稱性水平下達(dá)到信號方面清楚的差異所需的時間是短的(低于15秒)，因而使得本發(fā)明適合于快速測量。附圖12顯示了獲得的峰電勢差與每個電極上分配的酶活性的比例相關(guān)。附圖13顯示了獲得的峰電流與每個電極上分配的酶活性的比例相關(guān)。實(shí)施例2通過將每個電極上分配的酶活性的比例的測定(如實(shí)施例1)與總酶活性的測定相組合，一個電極上存在的酶的數(shù)量(El)可以獨(dú)立于另一個電極上存在的數(shù)量(E2)而被測定。不同數(shù)量的酶可以分配到如實(shí)施例1中描述的夾心結(jié)構(gòu)中充當(dāng)電極的2個表面上。兩個電極上存在的酶活性的比例(R=E1/E2)通過短路結(jié)構(gòu)中電流的測量來確定。而總酶活性(Et=E1+E2)通過使用施加的電勢差測量電流來測定。然后根據(jù)R和Et的測定的值計(jì)算El和E2。制備含有0.25微克到1微克范圍內(nèi)的葡萄糖氧化酶的測試條，具有在兩個電極之間分布的酶從而R在1.5和1.9之間。這些條通過將0.25微克到1微克葡萄糖氧化酶的IOOnLIOOmM檸檬酸鈉緩沖液pH4.1溶液分配到電極1上，將0到0.4微克葡萄糖氧化酶的IOOnLIOOmM檸檬酸鈉緩沖液pH4.1溶液分配到電極2上，然后容許分配的溶液干燥來制備。IOOmMβ_D_葡萄糖和IOOmM鐵氰化鉀的水溶液添加到電化學(xué)槽中，記錄短路中的電流5秒。在這之后，施加300mV10秒。5s前一刻的電流被平均來得到Itl,15秒前一刻的電流被平均來得到Ι·(即，在5秒時測量的I是Itl，在15秒時測量的I指定為I3J。對于每個具有改變比例R的Et的提高的數(shù)量所測量的I(I。和I3J被記錄和標(biāo)繪。附圖14顯示了χ軸上已知的總酶Et和y軸上測量的I·的示意性圖。Et和13。。之間的關(guān)系可以從這個曲線來建立，例如數(shù)據(jù)可以通過以下方程式呈現(xiàn)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中m和η是線的斜率和截距。附圖15顯示了χ軸上已知的Et和y軸上測量的I。的示意性的標(biāo)繪圖。如所示，產(chǎn)生了線族，每一條對應(yīng)每個比例R的值。根據(jù)附圖15，Itl電流vsEt的線性關(guān)系取決于R，即，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>為了進(jìn)一步建立這種函數(shù)，我們對附圖15中所示的每條線標(biāo)繪了已知的Iog(R)vs斜率(附圖16)。此外，如附圖17中所示，我們標(biāo)繪了在附圖15中每條線的已知的Iog(R)和截距。因而這個函數(shù)f可以進(jìn)一步定義為關(guān)系式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>參數(shù)a和b可以根據(jù)附圖16的曲線計(jì)算，參數(shù)c和d可以根據(jù)附圖17計(jì)算。一旦已經(jīng)確定了參數(shù)a、b、c、d、m和n，El可以如下計(jì)算1.從I·計(jì)算Et<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>2.從I0和Et計(jì)算R<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>3.從Et和R計(jì)算E1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>附圖18顯示了對于在兩個電極上具有改變數(shù)量的酶的條，El的計(jì)算值對比El的實(shí)際值。附圖18表明，我們對在一個電極上分配的酶的估計(jì)值與分配的實(shí)際數(shù)量良好地相關(guān)，并且與另一個電極上分配的酶的數(shù)量無關(guān)。權(quán)利要求一種測定樣品中的分析物的方法，包括步驟(a)向測試槽中導(dǎo)入樣品，所述測試槽包含第一和第二電極、包含氧化還原酶部分的移動的測試試劑、和與所述移動的測試試劑和/或所述分析物相互作用的試劑，從而所述移動的測試試劑在分析物存在于樣品中時具有相對于所述電極的第一分布、在分析物不存在于樣品中時具有相對于所述電極的第二分布，所述第一和第二分布之一對于所述電極之間的線是不對稱的，所述第一和第二分布的另一個對于所述電極之間的線是對稱的或較低不對稱的，(b)在所述測試槽中提供所述氧化還原酶的氧化還原底物，所述氧化還原底物被所述氧化還原酶作用來產(chǎn)生第一和第二電極之間的化學(xué)勢梯度，其中所述化學(xué)勢梯度的的量值被所述移動的測試試劑的分布和因而分析物的存在決定，和(c)檢測所述第一和第二電極之間的化學(xué)勢梯度來測定樣品中的分析物，其中所述化學(xué)勢梯度的形成和檢測在不應(yīng)用外部電勢或電流的情況下進(jìn)行。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述測試槽包含在所述第一電極的表面上設(shè)置的固定的測試試劑作為與所述分析物相互作用的試劑之一，所述固定的測試試劑包含分析物結(jié)合部分，并且所述移動的測試試劑包含分析物結(jié)合部分和所述氧化還原酶部分，由此如果分析物存在于測試槽中的樣品中，至少部分所述移動的測試試劑變?yōu)楣潭ㄔ谒龅谝浑姌O上，從而當(dāng)分析物存在時在所述第一和第二電極之間產(chǎn)生氧化還原酶濃度的不對稱分布。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分和所述分析物是抗體_抗原對或抗體/半抗原對。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述氧化還原酶和所述氧化還原底物包含葡萄糖和介質(zhì)化合物。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分是藥物受體。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述氧化還原酶和所述氧化還原底物包含葡萄糖和介質(zhì)化合物。7.權(quán)利要求2的方法，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分是激素受體。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述氧化還原酶和所述氧化還原底物包含葡萄糖和介質(zhì)化合物。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分和所述分析物是抗體_抗原對或抗體/半抗原對。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述氧化還原酶和所述氧化還原底物包含葡萄糖和介質(zhì)化合物。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分是藥物受體。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述氧化還原酶和所述氧化還原底物包含葡萄糖和介質(zhì)化合物。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分是激素受體。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述氧化還原酶和所述氧化還原底物包含葡萄糖和介質(zhì)化合物。15.一種用于測定樣品中的分析物的裝置，其包含測試條，其包含被設(shè)置以接觸到接受樣品的測試槽的第一和第二電極，所述測試條進(jìn)一步包含氧化還原酶部分的移動的測試試劑、和與所述移動的測試試劑和/或所述分析物相互作用的試劑，從而所述移動的測試試劑在分析物存在于樣品中時具有相對于所述電極的第一分布、在分析物不存在于樣品中時具有相對于所述電極的第二分布，所述第一和第二分布之一對于所述電極之間的線是不對稱的，所述第一和第二分布的另一個對于所述電極之間的線是對稱的或較低不對稱的，和用于在不存在施加的外部電勢或電流的情況下檢測所述測試槽中所述移動的測試試劑的對稱或不對稱分布的電路，和將檢測的分布傳達(dá)給用戶的裝置。16.權(quán)利要求15的裝置，其中所述電路檢測所述第一和第二電極之間的電勢差。17.權(quán)利要求15的裝置，其中所述電路檢測包括電極的電路中的電流。18.權(quán)利要求15到17的任一項(xiàng)的裝置，其中所述第一和第二電極處于相面對的結(jié)構(gòu)中。19.權(quán)利要求15到17的任一項(xiàng)的裝置，其中所述第一和第二電極處于并排的結(jié)構(gòu)中。20.根據(jù)權(quán)利要求15到19的任一項(xiàng)的裝置，其中所述測試槽包含在所述第一電極的表面上設(shè)置的固定的測試試劑作為與所述分析物相互作用的試劑之一，所述固定的測試試劑包含分析物結(jié)合部分，并且所述移動的測試試劑包含分析物結(jié)合部分和所述氧化還原酶部分，由此如果分析物存在于測試槽中的樣品中，至少部分所述移動的測試試劑變?yōu)楣潭ㄔ谒龅谝浑姌O上，從而當(dāng)分析物存在時在所述第一和第二電極之間產(chǎn)生氧化還原酶濃度的不對稱分布。21.權(quán)利要求15到20的任一項(xiàng)的裝置，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分和所述分析物是抗體_抗原對或抗體/半抗原對。22.權(quán)利要求15到20的任一項(xiàng)的裝置，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分是藥物受體。23.權(quán)利要求15到20的任一項(xiàng)的裝置，其中所述固定的測試試劑的分析物結(jié)合部分是激素受體。24.權(quán)利要求15到23的任一項(xiàng)的裝置，其中所述氧化還原酶和所述氧化還原底物包含葡萄糖和介質(zhì)化合物。全文摘要一種用于樣品中分析物的電化學(xué)檢測的方法和裝置利用了結(jié)合相互作用并依靠這種發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含有氧化還原酶的試劑被固定在一個電極的表面時發(fā)生的、在兩個電極之間的氧化還原酶的不對稱分布可以作為來自氧化的或還原的氧化還原底物的分布的不對稱性的化學(xué)勢梯度來檢測。這種化學(xué)勢梯度可以通過觀察開路中電極之間的電勢差來電勢測定地檢測，或通過觀察當(dāng)電路閉合時電極之間的電流來電流測定地檢測。在兩種情況下，不對稱性的觀察可以在不對電極施加外部電勢或電流的情況下進(jìn)行。文檔編號G01N33/53GK101802612SQ200880108191公開日2010年8月11日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日發(fā)明者I·哈丁,R·威廉斯,S·尹加申請人:埃葛梅崔克斯股份有限公司