專(zhuān)利名稱(chēng)：：檢測(cè)用于診斷和表征障礙的自身抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)公開(kāi)的主題涉及通過(guò)檢測(cè)自身抗體診斷和表征受試者中的障礙。具體而言，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題涉及利用抗原(在一些實(shí)施方案中包括從細(xì)胞產(chǎn)生的外來(lái)體分離的抗原)來(lái)檢測(cè)受試者中的自身抗體，用于診斷或表征所述受試者中的癌癥和/或不孕癥(infertility)和/或其他障礙。
背景技術(shù)：
：許多疾病如果在早期階段被診斷出，則它們可以被更為有效地治療和/或預(yù)防。對(duì)于癌癥而言，這一點(diǎn)尤其的正確。例如，卯％的1期卵巢癌病例可治愈，而對(duì)于晚期疾病(ffl期和IV期)患者而言，存活5年的幾率低于21%。因此，顯著提高癌癥存活率的希望在于早期診斷。類(lèi)似地，如果有更加敏感的早期診斷試驗(yàn)，其他障礙也有可能被更早地診斷并且/或者治療的預(yù)后被更好地確定。作為另一個(gè)具體的實(shí)例，比起被報(bào)道的難以產(chǎn)生或維持足月的活妊娠，不孕障礙更以難以預(yù)先診斷和確定而眾所周知。更加敏感和特異的診斷測(cè)定能夠提供對(duì)不孕障礙的更好診斷和對(duì)不孕治療的更好預(yù)后?，F(xiàn)行對(duì)多種障礙(包括例如癌癥)的診斷測(cè)定是以抗原為基礎(chǔ)，并依賴(lài)于對(duì)與所述障礙相關(guān)的循環(huán)系統(tǒng)蛋白質(zhì)的檢測(cè)。這些測(cè)定依賴(lài)于由細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)主動(dòng)分泌或流出或者因細(xì)胞死亡(壞死或凋亡)而產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)的表達(dá)、合成及釋放。這些抗原蛋白質(zhì)必須"逃離，，疾病的原始位點(diǎn)，使個(gè)體免疫組分的抗原加工容量飽和，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并達(dá)到足以由以酶或放射性標(biāo)記為基礎(chǔ)的免疫測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)的穩(wěn)態(tài)濃度。這些事件通常在疾病最初確立(例如致瘤性轉(zhuǎn)化事件和腫瘤灶發(fā)生)后才出現(xiàn)。因此，現(xiàn)行的基于抗原的測(cè)定無(wú)法真正地檢測(cè)目標(biāo)障礙的早期階段。為了顯著改善對(duì)目標(biāo)障礙的診斷測(cè)定，尚未獲得滿(mǎn)足的需求是需要一種在障礙確立早期對(duì)于疾病標(biāo)記物的存在更加敏感的檢測(cè)該障礙的新方法。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明內(nèi)容部分列出了本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的數(shù)個(gè)實(shí)施方案，并且在許多情況中列出了這些實(shí)施方案的調(diào)整方案及變化方案。該
發(fā)明內(nèi)容部分只是數(shù)目眾多的不同實(shí)施方案的示例。提及一個(gè)給定實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)代表性特征時(shí)同樣也是示例。這樣的實(shí)施方案一般可以以具有或不具有所提及的一種或多種特征而存在；同樣，這些特征可適用于本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的其他實(shí)施方案，而不管其是否在該
發(fā)明內(nèi)容部分中列出。為了避免過(guò)度重復(fù)，該
發(fā)明內(nèi)容部分不再列出或顯示這些特征的所有可能的組合。在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于檢測(cè)受試者中的自身抗體水平并且/或者對(duì)該水平定量的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的生物樣品，并將一種抗原與所述樣品相接觸。所述抗原可包括一種分離自一種外來(lái)體的自身抗體免疫反應(yīng)肽。所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)樣品中對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的所述自身抗體的水平并且/或者對(duì)該水平定量。在一些實(shí)施方案中，所述自身抗體與一種癌癥或不孕障礙相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題進(jìn)一步提供了一種用于診斷與受試者中自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的生物樣品，并將一種抗原與所述樣品相接觸。所述抗原可包括一種分離自一種外來(lái)體的自身抗體免疫反應(yīng)肽。所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)所述樣品中對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的自身抗體，并將自身抗體對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平與一個(gè)參考水平比較，以診斷所述受試者中的所述障礙。在一些實(shí)施方案中，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題還進(jìn)一步提供了一種用于表征受試者中的一種與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含自身抗體的生物樣品，并將一種抗原與所述樣品相接觸。所述抗原可包括一種分離自一種外來(lái)體的自身抗體免疫反應(yīng)肽。所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)所述樣品中與所述水"^定量，從而丄征所述受試者中的所述障礙。'、^在用于診斷或表征障礙的方法的一些實(shí)施方案中，所述障礙為一種癌癥或一種不孕障礙。在本文公開(kāi)的方法的一些實(shí)施方案中，所述障礙為一種上皮癌或一種腺癌。另外，在一些實(shí)施方案中，所述抗原包括一種選自以下的癌抗原肽p53、p63、p73、mdm-2、親組織蛋白酶-D(procathepsin-D)、B23、C23、PLAP、cerB/HER2、NY-ESO-l、SCP1、SSX畫(huà)1、SSX國(guó)2、SSX-4、HSPIO、HSP27、HSP60、HSP90、GRP78、HoxA7、HoxB7、EpCAM、c國(guó)ras、間皮素(mesothelin)、生存素(survivin)、粘蛋白(mucin)、EGF激酶、c-myc、核磷蛋白(nucleophosmin)和TAG72。在所述方法的一些實(shí)施方案中，所述障礙為一種選自以下的不孕障礙卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢綜合征(PCOS)、子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失。在所述方法的一些實(shí)施方案中，所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、嚢內(nèi)液、胸膜液、淚液、尿液、唾液、組織或它們的結(jié)合物。另外，在一些實(shí)施方案中，所述受試者為一種哺乳動(dòng)物。在本申請(qǐng)公開(kāi)的方法的一些實(shí)施方案中，所述外來(lái)體分離自一種細(xì)胞，所述細(xì)胞在一些實(shí)施方案中可為一種培養(yǎng)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為一種癌細(xì)胞，例如卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞或絨毛膜癌細(xì)胞。在一些具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為UL-1細(xì)胞、UL-2細(xì)胞、UL-3細(xì)胞或UL-6細(xì)胞。在一些具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為胎盤(pán)細(xì)胞。在本申請(qǐng)公開(kāi)的方法的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)包括一種選自以下的技術(shù)ELISA、RIA、多重免疫測(cè)定、免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡法。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題還進(jìn)一步提供了一種用于檢測(cè)一個(gè)樣品中的自身抗體的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含一種自身抗體免疫反應(yīng)肽抗原及一個(gè)用于容納所述抗原的容器。在一些實(shí)施方案中，所述抗原可分離自一種外來(lái)體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原附著于一種支持物上。在一些實(shí)施方案中，所述支持物為微量滴定板、膜(硝酸纖維素、PVDF或類(lèi)似材料)、聚苯乙烯珠子、試管或浸漬片(dipstick)。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含一種結(jié)合一種自身抗體的抗體制品。進(jìn)一步，在一些實(shí)施方案中，所述抗體制品包含一種可檢測(cè)的標(biāo)記。更進(jìn)一步，在一些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)標(biāo)記包括放射性標(biāo)記、酶、生物素、染料、熒光標(biāo)簽標(biāo)記、半抗原或發(fā)光標(biāo)記。因此，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一個(gè)目標(biāo)為提供檢測(cè)用于診斷和表征障礙的自身抗體的方法。通過(guò)本申請(qǐng)公開(kāi)的主題完全地或部分地實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在研讀以下的對(duì)本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的說(shuō)明、附圖和非限制性的實(shí)施例后，上文已陳述的本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的目標(biāo)(可通過(guò)本申請(qǐng)公開(kāi)的主題完全地或部分地實(shí)現(xiàn))、其他目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于他們來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。圖l的圖顯示了，與正常不攜帶腫瘤的對(duì)照對(duì)比，癌癥患者中腫瘤反應(yīng)性免疫球蛋白與疾病階段的相關(guān)情況。圖2A和2B的照片顯示了存在于代表性卵巢癌患者(2A=II期，2B-IV期)的血清中的免疫球蛋白與源自正常卵巢上皮(NO)和3個(gè)卵巢腫瘤細(xì)胞系(UL1、UL3和UL6)的細(xì)胞抗原的免疫反應(yīng)性。框指示目的區(qū)域。圖3A-3D的系列照片顯示了在對(duì)順鉑(cisplatin)應(yīng)答的患者中，識(shí)別模式差異的2-維電泳分析結(jié)果。圖3A-3D顯示了部分的2D印跡，使用來(lái)自UL-6的抗原作為靶標(biāo)和來(lái)自mc期卵巢嚢腺癌的患者的血清。患者A和B(分別為圖3A和3B)對(duì)順鉑應(yīng)答，而患者C和D(分別為3C和3D)無(wú)應(yīng)答。圖4A和4B的柱狀圖顯示了來(lái)自2名卵巢癌患者的蛋白質(zhì)陣列譜。通過(guò)RP-HPLC分離來(lái)自UL-1卵巢肺瘤細(xì)胞系的免疫沉淀的細(xì)胞蛋白質(zhì)，并將蛋白質(zhì)結(jié)合于MAGNAGRAPH膜。通過(guò)將所述孔與來(lái)自卵巢癌患者的血清孵育來(lái)鑒定免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)，以光密度計(jì)測(cè)定的像素表示。圖5顯示了源自患者的腫瘤反應(yīng)性自身抗體的免疫反應(yīng)性模式。圖6的圖顯示了來(lái)自正常女性自愿者(對(duì)照)、患有良性卵巢疾病的女性和患有侵襲性卵巢癌的女性的血清與一個(gè)蛋白質(zhì)陣列中的抗原(在表l中列出)呈現(xiàn)自身抗體反應(yīng)性的百分?jǐn)?shù)。圖7的系列照片所示的原始蛋白質(zhì)微陣列示出患有早期和晚期卵巢癌的女性中的反應(yīng)性IgG。圖8A的系列照片顯示了宮頸癌患者抗血清與細(xì)胞性抗原的反應(yīng)性。圖8B的圖顯示了源自宮頸癌細(xì)胞系的抗原與患者血清的反應(yīng)性。圖9的系列照片和圖顯示了視黃酸對(duì)從宮頸癌細(xì)胞釋放的可溶性抗原的反應(yīng)性的作用。圖10的系列照片和圖顯示了視黃酸對(duì)從宮頸癌細(xì)胞釋放的細(xì)胞相關(guān)抗原的反應(yīng)性的作用。圖ll的系列圖顯示了來(lái)自患有不同期的癌癥、良性疾病的不同患者或正常對(duì)照的血清對(duì)不同的自身抗體免疫反應(yīng)肽抗原的免疫反應(yīng)性。圖12的系列圖顯示了來(lái)自對(duì)照受試者和患有不同類(lèi)型癌癥的患者的血清對(duì)不同自身抗體免疫反應(yīng)肽抗原的免疫反應(yīng)性。圖13的系列照片顯示了重組抗原和源自天然外來(lái)體的抗原中對(duì)抗來(lái)自不同癌癥患者的血清的抗原表位的差異。圖14的圖所示的ELisA結(jié)果為被診斷為i期、n期或ni期子宮內(nèi)膜異位癥的患者和正常對(duì)照的血清對(duì)源自子宮內(nèi)膜亞細(xì)胞區(qū)室的細(xì)胞抗原的免疫反應(yīng)性?？乖蛛x自子宮內(nèi)膜細(xì)胞的膜、核和胞質(zhì)溶膠部分，并3皮偶聯(lián)至微量滴定板的孔中。圖15的系列照片顯示了來(lái)自子宮內(nèi)膜和卵巢且被自體反應(yīng)性體液應(yīng)答識(shí)別的細(xì)胞抗原的蛋白質(zhì)免疫印跡。圖16A-i6c的系列照片顯示了對(duì)患有n期和m期子宮內(nèi)膜異位癥的患者血清進(jìn)行二維電泳所分離的子宮內(nèi)膜膜抗原的部分代表性免疫識(shí)別。蛋白質(zhì)分離自Hec-1A(子宮內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞系)。將溶解的膜蛋白質(zhì)(100mg)加載至PH3-10等電聚焦帶上(strip),在電泳后，將該等點(diǎn)聚焦帶加至10-20%丙烯酰胺SDS-PAGE凝膠上部。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素并進(jìn)行免疫印跡。圖17的系列照片顯示了獲自被診斷為不孕障礙的女性的血清對(duì)源自子宮內(nèi)膜的細(xì)胞抗原的血清學(xué)反應(yīng)模式。圖18的系列照片所示的蛋白質(zhì)免疫印跡表明了在正常足月分娩和反復(fù)妊娠丟失的妊娠過(guò)程中產(chǎn)生的自身抗體的存在。具體實(shí)施例方式在如下附隨的說(shuō)明中將詳細(xì)地給出本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案。通過(guò)該詳細(xì)說(shuō)明、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。本文提及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其他參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用的方式全文納入本文。在出現(xiàn)沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。按照長(zhǎng)期形成的專(zhuān)利法慣例，術(shù)語(yǔ)"a(—種)"、"an(—個(gè))"和"the(該)"在用于本申請(qǐng)(包括權(quán)利要求書(shū))中時(shí)是指"一個(gè)或多個(gè)"。除非另外指出，否則在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的表示成分量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字應(yīng)被理解為在所有情況下都被術(shù)語(yǔ)"約"修飾。因此，除非相反指出，否則在本說(shuō)明書(shū)和附隨的權(quán)利要求書(shū)中列出的數(shù)值參數(shù)是可依賴(lài)于本申請(qǐng)公開(kāi)的主題意欲獲得的所需性質(zhì)而變化的近似值。在提及質(zhì)量、重量、時(shí)間、體積、濃度或百分率的值或量的時(shí)候，本文使用的術(shù)語(yǔ)"約"的意思是涵蓋偏離所述指定量如下區(qū)間以?xún)?nèi)的變化范圍，即在一些實(shí)施方案中為±20%,在一些實(shí)施方案中為±10%，在一些實(shí)施方案中為±5%,在一些實(shí)施方案中為±1%，在一些實(shí)施方案中為±0.5%,以及在一些實(shí)施方案中為±0.1%，只要這樣的變化適合于實(shí)施本申請(qǐng)7>開(kāi)的方法。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有等同于本申請(qǐng)公開(kāi)的主題所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。任何類(lèi)似于或等價(jià)于本文所述的方法、設(shè)備和材料均可用于實(shí)施或測(cè)試本申請(qǐng)公開(kāi)的主題，盡管在此只描述代表性的方法、設(shè)備和材料?，F(xiàn)有技術(shù)中已確定，某些障礙的特征在于在患病的受試者中產(chǎn)生自身抗體。也就是說(shuō)，該受試者的免疫系統(tǒng)被刺激產(chǎn)生抗自身抗原(與外源抗原例如侵入微生物所特有的抗原相對(duì))的抗體。與自身抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的該抗原在一些情形下可具有由于一級(jí)序列或翻譯后加工中的變化造成的改變的表位(例如這可發(fā)生在癌癥中)，但也可以是與正?？乖诿庖邔W(xué)上相同。在這兩種情形下，均已發(fā)現(xiàn)自身抗體的產(chǎn)生可與障礙的存在相關(guān)，乃至可提供用于表征所述障礙的信息。本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了用于檢測(cè)受試者中自身抗體水平并且/或者對(duì)該水平定量的新方法，所述自身抗體水平可與所述受試者中一種障礙的存在力或?qū)λ稣系K的表征相關(guān)。例如，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，提供了用于診斷和/或表征受試者中與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的一種癌癥或不孕障礙的方法。L用于檢測(cè)自身抗體水平并對(duì)該水平定量的方法在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了用于檢測(cè)并/或定量受試者中的自身抗體水平并且/或者對(duì)該水平定量的方法。在一些實(shí)施方案中，這些方法可被用于診斷和/或表征受試者中與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的一個(gè)生物樣品，然后將一種抗原與所述樣品接觸。所述抗原包括一種自身抗體免疫反應(yīng)肽。所述方法接著包括檢測(cè)樣品中與所述抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的所述自身抗體的水平并對(duì)該水平定量。在一些實(shí)施方案中，所述生物樣品可包括例如乳汁、血液、血清、血漿、腹水、嚢內(nèi)液、胸膜液、唾液、淚液、尿液、組織或它們的結(jié)合物。此外，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于診斷受試者中的一種與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙的方法，該方法是基于檢測(cè)所述受試者中的自身抗體。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的一個(gè)生物樣品；將一種抗原與所述樣品接觸，其中所述抗原包括一種自身抗體免疫反應(yīng)肽；檢測(cè)所述樣品中對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的自身抗體；并將自身抗體對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平與一個(gè)參考水平相比較，以診斷所述受試者中的所述障礙。本文使用的術(shù)語(yǔ)"作診斷"和"診斷"是指這樣的方法，即本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)這些方法可估計(jì)乃至確定受試者是否患有一種給定的障礙或病癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)常以一種或多種診斷指示物為基礎(chǔ)進(jìn)行診斷，所述指示物例如一種自身抗體，其量(包括存在或不存在)可指示所述病癥的存在、嚴(yán)重性或不存在。除了診斷，臨床的預(yù)后也是一個(gè)很受關(guān)注和注意的方面。為了設(shè)計(jì)最有效的治療，知曉障礙的嚴(yán)重性(例如癌細(xì)胞的侵襲力及腫瘤復(fù)發(fā)的可能性)很重要。自身抗體的測(cè)量可被用于將具有良好預(yù)后、不需要進(jìn)一步治療的受試者與那些更可能受益于更強(qiáng)烈治療的受試者分開(kāi)。由此，本文使用的"進(jìn)行診斷"或"診斷"還涵蓋進(jìn)行預(yù)后，基于對(duì)診斷性自身抗體的測(cè)量，預(yù)后可提供對(duì)臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)(進(jìn)行或未進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療)、對(duì)合適療法的選擇(或療法是否有效)或者對(duì)現(xiàn)行療法的監(jiān)測(cè)及可能的療法改變。而且，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，可以隨時(shí)間多次進(jìn)行對(duì)所述自身抗體的測(cè)定以有利于診斷和/或預(yù)后。所述自身抗體水平的時(shí)間性變化可用于預(yù)測(cè)臨床結(jié)果、監(jiān)測(cè)所述障礙的進(jìn)展和/或針對(duì)所述障礙的適當(dāng)療法的效果。在一個(gè)這樣的示例性實(shí)施方案中，可能會(huì)有以下預(yù)期，即生物樣品中自身抗體(以及有可能的一種或多種其他生物標(biāo)記物，條件是它(們)被監(jiān)測(cè))的量在有效治療的過(guò)程中會(huì)隨時(shí)間減少。將自身抗體的水平(例如升高的水平)與參考水平或"正常水平"相關(guān)聯(lián)，以診斷和/或表征一種障礙是指，將自身抗體水平(定量的l或存不存在)與無(wú)該障礙的受試者中的預(yù)期水平(包括但不限于沒(méi)有檢測(cè)到自身抗體)相比較。相對(duì)于正常水平的變化(例如提高)是指這樣的結(jié)果，即所述樣品與在其他相當(dāng)條件下的類(lèi)似無(wú)疾病樣品相比較時(shí)，變化(例如升高)幅度超過(guò)測(cè)量技術(shù)固有的誤差。在一些實(shí)施方案中，在所述測(cè)試受試者中檢測(cè)到的自身抗體的水平比基線(xiàn)"正常"存在量升高約10%或更多。在一些實(shí)施方案中，在所述測(cè)試受試者中檢測(cè)到的自身抗體的水平升高約20%或更多，在一些實(shí)施方案中，在所述測(cè)試受試者中檢測(cè)到的自身抗體的水平升高約25%或更多，以及在一些實(shí)施方案中，在所述測(cè)試受試者中檢測(cè)到的自身抗體的水平升高約50%或更多，上述這些情形是自身抗體存在量的升高，這種升高可與所述受試者中存在所述障礙相關(guān)聯(lián)。而且，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于表征受試者中的一種與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙的方法。本文使用的"表征"可指，檢測(cè)一種障礙的存在或測(cè)定一種障礙的嚴(yán)重度，例如確定一種癌癥的階段。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含自身抗體的生物樣品；將一種抗原與所述樣品接觸，其中所述抗原包括一種自身抗體免疫反應(yīng)肽；檢測(cè)所述樣品中對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的自身抗體；并對(duì)自身抗體針對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平定量，從而表征所述受試者中的所述障礙。本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)"和"免疫反應(yīng)性"在用于抗體結(jié)合時(shí)是指，抗體的可變區(qū)與抗原的特定表位的特異性結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"肽"、"多肽"和"蛋白"在本文中可互換使用，是指20種蛋白氨基酸或氨基酸類(lèi)似物的聚合物，而不考慮其大小或功能。雖然"蛋白"經(jīng)常被用于言及相對(duì)較大的多肽，"肽，，經(jīng)常被用于言及較小的多肽，但是這些術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中的用法可有重疊及變化。除非另外指出，否則本文使用的術(shù)語(yǔ)"肽"是指肽、多肽和蛋白。本文中的術(shù)語(yǔ)"蛋白"、"多肽"和"肽"在提及基因產(chǎn)物時(shí)可互換使用。因此，示例性的多肽包括基因產(chǎn)物、天然存在的蛋白、前兩者的同源物、直系同源物(ortholog)、旁系同源物(paralog)、片段以及其他等價(jià)物、變體和類(lèi)似物。在本文公開(kāi)的方法的一些實(shí)施方案中，檢測(cè)所述樣品中的所述自身抗體可包括，將所述自身抗體與一種抗原結(jié)合，然后檢測(cè)分離自所述生物樣品的自身抗體的結(jié)合事件或者存在情況。用于檢測(cè)所述自身抗體的示例性技術(shù)包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、多重免疫測(cè)定、免疫沉淀法和免疫印跡法(包括例如蛋白質(zhì)印跡法和斑點(diǎn)印跡法)。多種有用的免疫檢測(cè)方法已被記載于科學(xué)文獻(xiàn)中，例如Nakam腦etal.(見(jiàn)HandbookofExperimentalImmunology(4thEd.)，Weiretal.(eds).Vol.1，Chapter27，BlackwellScientificPubl"Oxford,1987;通過(guò)引用的方式將其納入本文)。最簡(jiǎn)單直接層面上的免疫測(cè)定是指結(jié)合測(cè)定。示例性免疫測(cè)定包括多種類(lèi)型的ELISA、RIA和多重免疫測(cè)定。使用組織切片的免疫組織化學(xué)檢測(cè)也是特別有用的。然而，容易理解的是，檢測(cè)并不限于這些技術(shù)，蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)印跡、FACS分析、沉淀素反應(yīng)等也可以用于本申請(qǐng)公開(kāi)的主題。關(guān)于本申請(qǐng)的方法，免疫結(jié)合方法通常包括，獲得疑似包含一種抗體的一個(gè)樣品，并將所述樣品在使免疫復(fù)合體有效形成的條件下與一種15根據(jù)本申請(qǐng)主題的抗原(例如一種自身抗體免疫反應(yīng)肽)相接觸。將所選生物樣品在使免疫復(fù)合體(一級(jí)免疫復(fù)合體)形成的有效條件和足夠時(shí)長(zhǎng)下與所述抗原相接觸，通常是將所述組合物添加至所述樣品中，并將所述混合物孵育這樣的一段時(shí)間，即在該時(shí)間段內(nèi)所述抗體與存在的抗原足以形成免疫復(fù)合體。在這之后，可將所述抗原-抗體混合物洗滌，以去除任何非特異性結(jié)合的抗體分子，使得僅那些特異性結(jié)合于所述一級(jí)免疫復(fù)合體中的抗體被檢測(cè)。通常，對(duì)免疫復(fù)合體形成的檢測(cè)可通過(guò)應(yīng)用多種方法實(shí)現(xiàn)。這些方法通?；趯?duì)一種標(biāo)簽或標(biāo)記物的檢測(cè)，例如本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)使用的任何放射性的、熒光的、生物的或酶的標(biāo)簽或標(biāo)記。有關(guān)這些標(biāo)記的使用的美國(guó)專(zhuān)利包括3，817，837;3，850，752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;4,302,534;4,366,241;4，637，988;4,786,594;5，108，896;5，229，302;5,629,164和5,691,154，以上每一篇文獻(xiàn)均通過(guò)引用的方式納入本文。當(dāng)然，如本領(lǐng)域中公知的，通過(guò)使用二級(jí)結(jié)合配體例如第二抗體或生物素/親和素配體結(jié)合方案可實(shí)現(xiàn)另外的優(yōu)點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述一級(jí)免疫復(fù)合體的檢測(cè)可通過(guò)一種這樣的二級(jí)結(jié)合配體實(shí)現(xiàn)，即該二級(jí)結(jié)合配體具有與存在于所述樣品中的抗原或抗體的結(jié)合親和性(特異性或非特異性(例如對(duì)所述自身抗體Fc區(qū)的反應(yīng)性))。在這些情況下，所述二級(jí)結(jié)合配體可連接一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記。所述二級(jí)結(jié)合配體自身常為一種抗體，因此所述抗體被稱(chēng)為"二級(jí)，，抗體。在使二級(jí)免疫復(fù)合體形成的有效條件和足夠時(shí)長(zhǎng)下，將所述一級(jí)免疫復(fù)合體與所述標(biāo)記的二級(jí)結(jié)合配體或抗體相接觸。然后，通常將所述二級(jí)免疫復(fù)合體洗滌，以去除任何未結(jié)合的標(biāo)記的二級(jí)抗體或配體，然后檢測(cè)剩下的所述二級(jí)免疫復(fù)合體的標(biāo)記。其他方法包括通過(guò)兩步法檢測(cè)一級(jí)免疫復(fù)合體。如上述，對(duì)所述抗原或自身抗體有結(jié)合親和性的二級(jí)結(jié)合配體(例如一種抗體)被用于形成二級(jí)免疫復(fù)合體。所述二級(jí)結(jié)合配體包括一種這樣的酶，即該酶能夠?qū)⒌孜锛庸こ煽蓹z測(cè)產(chǎn)物，從而隨時(shí)間放大信號(hào)。在洗滌后，將所述二級(jí)免疫復(fù)合體與底物相接觸，使得可進(jìn)行檢測(cè)。竟?fàn)幮悦庖邫z測(cè)也可以被用于檢測(cè)對(duì)所述測(cè)試抗原特異的自身抗體的存在。在該技術(shù)中，一種標(biāo)記的抗體首先在溶液中與所述抗原一起孵育。所述標(biāo)記發(fā)出的信號(hào)被測(cè)量。然后將該抗原/抗體復(fù)合體與含有或疑似含有目的抗體的樣品相接觸。如果所述樣品含對(duì)所述抗原特異的抗體，那么它們將結(jié)合所述抗原并竟?fàn)幮灾脫Q所述的標(biāo)記的抗體。這可檢測(cè)為所述標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度的下降。在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些但非全部實(shí)施方案中，用于捕獲來(lái)自所述生物樣品的所述自身抗體的抗原分離自外來(lái)體。術(shù)語(yǔ)"分離的"在用于多肽時(shí)是指該多肽基本上脫離它在天然狀態(tài)所聯(lián)系的其他細(xì)胞部分或外來(lái)體部分。外來(lái)體是內(nèi)體源的小泡，在晚期內(nèi)體多泡體與質(zhì)膜融合后分泌至細(xì)胞外環(huán)境中。來(lái)自多種組織類(lèi)型的細(xì)胞已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可分泌外來(lái)體，例如樹(shù)突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和肥大細(xì)胞。不同來(lái)源的外來(lái)體呈現(xiàn)出多個(gè)獨(dú)立系列的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)部分。值得注意的是，它們均包含參與抗原呈遞和免疫調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，表明外來(lái)體在引起免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞-細(xì)胞通訊中起作用。事實(shí)上，來(lái)自以源自腫瘤抗原的肽脈沖的樹(shù)突細(xì)胞(DC)的外來(lái)體可在使用匹配肺瘤的動(dòng)物模型中誘發(fā)抗肺瘤反應(yīng)。然而，源自包含癌抗原的癌細(xì)胞的外來(lái)體已經(jīng)顯示包含免疫抑制性多肽，使得源自腫瘤的未修飾外來(lái)體直接用在疫苗中是不適宜的并有可能是不安全的。本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的外來(lái)體十分適合于產(chǎn)生可與自身抗體發(fā)生免疫反應(yīng)以從受試者的生物樣品捕獲出所述自身抗體的抗原，這是因?yàn)樗鼈冇杉?xì)胞產(chǎn)生而不是由人工合成，從而可提供"天然的"抗原。也就是說(shuō)，由這些細(xì)胞產(chǎn)生并存在于所述外來(lái)體中的抗原可以是這樣的全長(zhǎng)肽，即它由所述細(xì)胞加工(如糖基化等)并折疊成類(lèi)似于受試者中免疫細(xì)胞經(jīng)歷過(guò)的抗原。由此，所述外來(lái)體抗原可用于這樣的測(cè)定中，即該測(cè)定用于檢測(cè)可能存在于患有障礙(例如癌癥和不孕障礙)的患者中的自身抗體。因此，在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種抗原的每一種均可以包含一種癌細(xì)胞抗原和/或不孕障礙抗原。用于提供在本申請(qǐng)公開(kāi)的方法中使用的抗原的外來(lái)體可分離自產(chǎn)生外來(lái)體的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為一種培養(yǎng)的細(xì)胞，即一種在培養(yǎng)基中離體繁殖的細(xì)胞。所述培養(yǎng)的細(xì)胞可以(但不必須)是被永生化的，以利于連續(xù)繁殖。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為癌細(xì)胞，例如最初從腫瘤分離、然后在培養(yǎng)物中繁殖的癌細(xì)胞，這在本領(lǐng)域中通常是公知的。在一些實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞可為一種上皮癌或一種腺癌。例如，在一些實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞可為卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞或絨毛膜癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為原代培養(yǎng)細(xì)胞，例如一種從受試者中分離的胎盤(pán)細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為選自但不限于UL-1細(xì)胞、UL-2細(xì)胞、UL-3細(xì)胞和UL-6細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞系。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中，已經(jīng)從卵巢具有mc期囊腺癌的女性建立了所有這些原代的人卵巢腫瘤細(xì)胞系(被命名為UL-1、UL-2、UL-3和UL-6)。UL-2和UL-3來(lái)自遺傳性卵巢癌，而UL-l和UL-6來(lái)自自發(fā)癌。UL-1細(xì)胞來(lái)自一位63歲女性患者，UL-2細(xì)胞來(lái)自一位34歲女性患者，UL-3細(xì)胞來(lái)自一位42歲女性患者，且UL-6細(xì)胞來(lái)自一位72歲女性患者。這些細(xì)胞系在棵鼠中是致肺瘤的，在棵鼠中可產(chǎn)生與嚢腺癌一致的腫瘤。這些細(xì)胞系的EpCAM、PLAP、FasL、PD-L1和II類(lèi)MHC都是陽(yáng)性。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)以下方式將所述抗原分離用于本文公開(kāi)的方法中收獲培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基，并從所述培養(yǎng)基選擇性取出所述外來(lái)體，例如通過(guò)離心。然后，根據(jù)需要，可通過(guò)常規(guī)的蛋白質(zhì)分離和純化的方法進(jìn)一步分離所述抗原，這在本領(lǐng)域中是^^知的。進(jìn)一步，對(duì)于本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的診斷方法，優(yōu)選的受試者是脊推動(dòng)物受試者。優(yōu)選的脊推動(dòng)物是溫血?jiǎng)游?；?yōu)選的溫血脊推動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物最優(yōu)選人。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"受試者"包括人受試者和動(dòng)物受試者。因此，根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了獸醫(yī)的治療用途。由此，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了對(duì)哺乳動(dòng)物的治療，所述哺乳動(dòng)物例如人以及那些由于瀕臨滅絕而重要的哺乳動(dòng)物，例如東北虎(Siberiantiger);具有重要經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值的哺乳動(dòng)物，例如在農(nóng)場(chǎng)中飼養(yǎng)用于人消費(fèi)的動(dòng)物；以t或者在社會(huì)關(guān)系上對(duì)人來(lái)說(shuō)重要的動(dòng)物，例如作為寵物或在動(dòng)物園中的動(dòng)物。這些動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于食肉動(dòng)物例如貓和狗；豬類(lèi)(swine)，包括豬(pig)、閹豬(hog)和野豬(wildboar);反芻動(dòng)物及/或有蹄動(dòng)物例如牛(cattle)、公牛(ox)、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝；以及馬。還提供了對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的治療，不但包括對(duì)禽類(lèi)特別是家養(yǎng)禽(即家禽，例如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞(guineafowl)等)的治療方法，而且包括對(duì)那些瀕臨滅絕和/或在動(dòng)物園中的鳥(niǎo)種類(lèi)的治療方法，這是因?yàn)樗鼈儗?duì)人也有著重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。因此，還提供了對(duì)家畜的治療方法，所述家畜包括但不限于家養(yǎng)的豬、反芻動(dòng)物、有蹄動(dòng)物、馬(包括竟賽馬)、家禽等。iL用于it斷癌癥的方法本申請(qǐng)公開(kāi)的主題進(jìn)一步提供了一種用于診斷和表征受試者的癌癥的方法。在美國(guó)，癌癥是第二大死亡原因。在1999年，據(jù)估計(jì)有563,100例癌癥死亡，并且每年診斷出約1,222,000例新的癌癥病例。其中，實(shí)體瘤癌癥例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌最為常見(jiàn)。癌癥的診斷和分類(lèi)依賴(lài)于對(duì)通過(guò)肉眼獲得的臨床和組織病理學(xué)信息的主觀解釋?zhuān)瑥亩谀[瘤的起源組織將腫瘤分成公認(rèn)的類(lèi)別。然而，臨床信息可能是不完備的或者有誤導(dǎo)的?，F(xiàn)行對(duì)癌癥的診斷測(cè)定最常見(jiàn)的是以抗原為基礎(chǔ)。這些測(cè)定依賴(lài)于由腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌或流出或者因細(xì)胞死亡(壞死或凋亡)而產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)的表達(dá)、合成及釋放。這些抗原蛋白質(zhì)必須"逃離"疾病的原始位點(diǎn)、使個(gè)體的免疫組分的抗原加工容量飽和、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并達(dá)到足以由基于酶或放射性標(biāo)記的免疫測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)的穩(wěn)態(tài)濃度。這些事件通常在致瘤性轉(zhuǎn)化事件和腫瘤灶發(fā)生最初確立后才出現(xiàn)。對(duì)于更早檢測(cè)癌癥的改善主要集中在提高敏感性和高通量能力；然而，這些診斷測(cè)定表現(xiàn)出數(shù)個(gè)基本的局限。循環(huán)系統(tǒng)抗原直至腫瘤確立后才出現(xiàn)；現(xiàn)行的抗原不是特異地針對(duì)癌癥；以及沒(méi)有單個(gè)抗原在100%的癌癥病例中都表達(dá)。最近，以對(duì)患者血清的蛋白組學(xué)模式的分析作為早期的檢測(cè)方法被研究(Liottaetal.，GynecolOncol88:S25-S28,2003.)。令人遺憾的是，這種基于質(zhì)譜(MS)的方法具有數(shù)個(gè)缺陷。除了與基于抗原的測(cè)定系統(tǒng)相關(guān)的循環(huán)系統(tǒng)抗原延遲出現(xiàn)之外，MS蛋白組分析的敏感性居中，且隨蛋白質(zhì)分子量增大效果逐漸降低，它不能識(shí)別這些標(biāo)記物蛋白質(zhì)，并且必須要使用高端先進(jìn)的分析儀器，例如SELDI-TOF質(zhì)譜儀和生物信息學(xué)工具。除了癌癥相關(guān)的蛋白質(zhì)差異之外，血清蛋白組學(xué)模式可能呈現(xiàn)出個(gè)體差異，并且這種"MS-診斷指紋法，，的結(jié)果依賴(lài)于與血清的"訓(xùn)練集，，的比較及隨后對(duì)所產(chǎn)生的模式的解析。因此，在MS蛋白組學(xué)分析可臨床應(yīng)用之前，需要解決可行性、再現(xiàn)性和標(biāo)準(zhǔn)化的問(wèn)題。對(duì)癌癥患者的免疫能力的評(píng)估已被用于確定腫瘤是否已危害宿主的免疫性，從而識(shí)別出具有預(yù)后價(jià)值的特定免疫參數(shù)并為免疫療法評(píng)估提供一個(gè)基準(zhǔn)(Hellstrometal"見(jiàn)DeVitaVT，HellmanS，andRosenbergSA，eds.Biologictherapyofcancer.NewYork:Lippincott，1991:35-52.)。雖然許多癌癥(包括例如卵巢癌)患者中的免疫細(xì)胞的功能受到損害——這通過(guò)無(wú)法根除所述腫瘤確定——，但是研究表明對(duì)腫瘤抗原的免疫識(shí)別仍完好。腫瘤反應(yīng)性自身抗體可在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的早期被檢測(cè)到。研究已表明在癌癥患者中存在腫瘤反應(yīng)性免疫球蛋白，所述患者包括黑色素瘤患者(Merimskyetal.,TumourBiol15:188-202，1994)、肺癌患者(Niklinskaetal"FoliaHistochemCytobiol39:51-56，2001;Brichoryetal"CancerRes61:7908-7912，2001)、乳腺癌患者(Conroyetal"Lancet345:126，1995;Barboucheetal"EuropJClinChemClinBiochem32:511-514，1994)、頭頸癌患者(Vlocketal，CancerRes49:1361-1365，1989)和卵巢癌患者(Kuttehetal"JSocGynecolInvest3:216-222，1996;Tayloretal"AmJR印rodImmunol6:179-184,1984;Vogletal"BritJCancer83:1338-1343，2000)。謙導(dǎo)體液應(yīng)答背后的機(jī)制在癌癥患者中似乎是多方面的，包括引起氨基酸序列變化的點(diǎn)突變(JungandSchluesener,JExpMed173:273-276，1991;Winteretal"CancerRes52:4168-4174，1992;Lubinetal.，CancerRes53:5872-5876，1993)、擴(kuò)增或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加引起的過(guò)表達(dá)(Peoplesetal"ProcNatlAmerSciUSA92:432-436，1995;Labrecqueetal"CancerRes53:3468-3471，1993)、翻譯后#"飾的變化(Koteraetal"Humoralimmunityagainstatandemrepeatepitopeofhumanmucinmuc-1inserafrombreast,pancreaticandcoloncancerpatients,C"wcer54<i/>:2S56-6<,7994;AnderssonE.HenderikxP.KrambovitisE.HoogenboomHR.BorrebaeckCA.AtandemrepeatofMUC1coreproteininducesaweakinvitroimmuneresponseinhumanBcells.CViwce尸7iim6>/0§j，47(5,*2^^-56，795^5Chinnietal.，ClinCancerRes3:1557-1564，1997)或加工中的錯(cuò)誤。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的細(xì)胞外出現(xiàn)通常可引起自身抗體的生成。抗異常細(xì)胞抗原(例如c-myb、c-myc、p53和p21ras)的自身抗體已經(jīng)在顯著比例的癌癥患者中被發(fā)現(xiàn)，即便在循環(huán)系統(tǒng)中不存在可檢測(cè)的抗原(Canevarietal.,AnnalsOncol7:227-232,1996;Yamamotoetal"Oncology56:129-133，1999;Abu-Shakraetal"AnnalsRheumDis60:433-440，2001.)。在診斷時(shí)檢測(cè)到對(duì)抗這些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗體似乎與不良預(yù)后相關(guān)。在以前的分析p53的自體抗體的誘導(dǎo)的研究中，與蛋白質(zhì)過(guò)表達(dá)相關(guān)的自身免疫反應(yīng)傾向于針對(duì)氨基端和羧基端。相反，抗相關(guān)蛋白質(zhì)p73的自身抗體似乎針對(duì)內(nèi)部的突變熱點(diǎn)。在使用化學(xué)誘導(dǎo)的或可移植的自發(fā)肺瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中，可證明循環(huán)系統(tǒng)腫瘤反應(yīng)性IgG先于可觸知腫瘤或循環(huán)系統(tǒng)腫瘤抗原出現(xiàn)。本發(fā)明人及同事以前開(kāi)發(fā)了"自體分型，，，以鑒定腫瘤反應(yīng)性IgG的存在，并且將癌癥患者的抗原識(shí)別模式確定為一種診斷工具(TaylorandDoellgast，AnalyticalBiochemistry,98:53-59，1979.)。然而，直至最近，對(duì)誘發(fā)這種體液應(yīng)答的特定抗原的分子鑒定仍不清楚?，F(xiàn)在，可將最近改進(jìn)的"自體分型，，用于分析腫瘤抗原。這種被命名為SEREX的改進(jìn)版本是使用對(duì)人肺瘤的重組cDNA表達(dá)庫(kù)的血清學(xué)分析鑒定免疫識(shí)別的耙標(biāo)(Old,JExpMed187:1163-1167，1998)。這種技術(shù)具有數(shù)個(gè)局限，包括與細(xì)菌或噬菌體組分的高交叉反應(yīng)性、源自存在于原始腫瘤中的正常組織(包括淋巴樣細(xì)胞)的cDNA的共表達(dá)，以及由于該cDNA在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)，因而不存在出現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞中的癌癥相關(guān)的翻譯后修飾和加工，這會(huì)引起這些"基因工程的"蛋白質(zhì)靶標(biāo)的免疫反應(yīng)性喪失。血清學(xué)分析技術(shù)已被用于為癌癥診斷確定新的靶抗原，但仍有限制其應(yīng)用的缺陷?，F(xiàn)在用于檢測(cè)自身抗體的抗原靶標(biāo)是重組野生型蛋白質(zhì)——例如p53的自身抗體的檢測(cè)已僅使用野生型p53蛋白質(zhì)。野生型蛋白質(zhì)的使用排除了對(duì)抗突變熱點(diǎn)的自身抗體的檢測(cè)。對(duì)于p53而言，大多數(shù)研究表明，自身抗體結(jié)合于氨基端或羧基端。重組野生型p53與針對(duì)突變位點(diǎn)的自身抗體無(wú)反應(yīng)性可能說(shuō)明，在卯巢癌中p53自身抗體頻率低于p53突變頻率。本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了一種診斷癌癥的新方法，所述方法克服了上文詳述的現(xiàn)有技術(shù)的局限。使用源自"天然"腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)抗原(例如源自癌癥細(xì)胞的外來(lái)體)，癌癥患者的肺瘤反應(yīng)性體液應(yīng)答在本文公開(kāi)的蛋白質(zhì)陣列中的新應(yīng)用提供了一種創(chuàng)新性的快速方法，來(lái)鑒定受試者中與癌癥發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)的變化(例如突變、截短和翻譯后修飾)的出現(xiàn)情況?；加袗盒约膊〉幕颊呖尚纬勺陨砻庖邩蝇F(xiàn)象，這是抗多種自身21抗原的自身抗體生成的結(jié)果，所述自身抗原包括癌蛋白、肺瘤抑制基因、增殖相關(guān)抗原和癌癥/睪丸抗原。具有同樣腫瘤類(lèi)型的患者共有的特定蛋白質(zhì)中的異?？纱砘镜男律锏耐?，且這些共有的變化可被用于診斷和表征癌癥，包括確定腫瘤的類(lèi)型和階段。由此，在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了一種診斷受試者的一種癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的一個(gè)生物樣品；將一種抗原與所述樣品接觸，其中所述抗原包括一種自身抗體免疫反應(yīng)肽；檢測(cè)在所述樣品中對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的自身抗體；并將自身抗體對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平與一個(gè)參考水平對(duì)比，以診斷所述受試者的所述癌癥。而且，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于表征受試者中與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的癌癥的方法。例如，對(duì)所述癌癥的進(jìn)一步表征可通過(guò)檢測(cè)來(lái)自所述受試者的樣品中的自身抗體并且/或者對(duì)該自身抗體定量來(lái)進(jìn)行，例如通過(guò)基于定量測(cè)量存在于所述樣品中的特定自身抗體的水平來(lái)確定癌癥階段。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來(lái)自受試者的包含自身抗體的一個(gè)生物樣品；將一種抗原與所述樣品接觸，其中所述抗原包括一種自身抗體免疫反應(yīng)肽；檢測(cè)在所述樣品中對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的自身抗體；并對(duì)自身抗體針對(duì)所述抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性水平定量，從而表征所述受試者中的所述癌癥。實(shí)施例部分將提供另外的用于表征存在于受試者的癌癥階段的示例性實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。在用于診斷和/或表征受試者的癌癥的方法的一些實(shí)施方案中，所述自身抗體免疫反應(yīng)肽可分離自一種外來(lái)體。本文使用的術(shù)語(yǔ)"癌癥"是指動(dòng)物中出現(xiàn)的所有類(lèi)型的癌癥、新生物或惡性肺瘤，包括白血病、癌(carcinomas)和肉瘤。癌癥的實(shí)例有腦癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宮癌和髓母細(xì)胞瘤。"白血病"是指造血器官的廣泛進(jìn)行性惡性疾病，其特征通常在于血液和骨髓中的白細(xì)胞及其前體異常的增殖及發(fā)育。白血病包括，例如急性非淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性前髓細(xì)胞性白血病、成人T細(xì)胞性白血病、非白血性白血病(aleukemicleukemia)、白細(xì)胞不增多性白血病(aleukocythemicleukemia)、嗜威性白血病(basophylicleukemia)、母細(xì)胞性白血病、牛白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、皮膚白血病、胚胎白血病(embryonalleukemia)、嗜酸性白血病(eosinophilicleukemia)、格羅斯白血病(Gross，leukemia)、毛細(xì)胞性白血病、成血性白血病(hemoblasticleukemia)、成血細(xì)胞性白血病(h柳ocytoblasticleukemia)、組織細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、白細(xì)胞減少性白血病、淋巴白血病(lymphaticleukemia)、成'淋巴細(xì)胞性白血病(lymphoblasticleukemia)、'淋巴細(xì)胞性白血病、成'淋巴性白血病(lymphogenousleukemia)、淋巴樣白血病(lymphoidleukemia)、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞性白血病、巨核細(xì)胞性白血病、小成髄細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病、成髄性白血病(myeloblastsleukemia)、髓細(xì)胞'性白血病、髓樣粒細(xì)胞'性白血病(myeloidgranulocyticleukemia)、髓單核細(xì)胞性白血病(myelomonocyticleukemia)、Naegeli白血病、漿細(xì)胞'性白血病(plasmacellleukemia)、漿細(xì)胞'性白血病(plasmacyticleukemia)、前髓細(xì)胞'性白血病、李德?tīng)柤?xì)胞小生白血病(Riedercellleukemia)、希林氏白血病(Schilling'sleukemia)、干細(xì)胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細(xì)胞性白血病。術(shù)語(yǔ)"癌"是指由傾向于浸潤(rùn)周?chē)M織并發(fā)生轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞組成的惡性新生物。示例性的癌包括，例如腺泡癌(acinarcarcinoma)、腺泡癌(acinouscarcinoma)、腺?lài)靶园?adenocysticcarcinoma)、腺樣嚢性癌(adenoidcysticcarcinoma)、腺癌(carcinomaadenomatosum)、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡癌、肺泡細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(basalcellcarcinoma)、基底細(xì)胞癌(carcinomabasocellulare)、基底細(xì)胞樣癌(basaloidcarcinoma)、基底鱗狀細(xì)胞癌(basosquamouscellcarcinoma)、細(xì)支氣管肺泡癌(bronchioalveolarcarcinoma)、支氣管癌(bronchiolarcarcinoma)、支氣管源性癌(bronchogeniccarcinoma)、腦樣癌(cerebriformcarcinoma)、膽管細(xì)胞癌(cholangiocellularcarcinoma)、絨毛膜癌(chorioniccarcinoma)、股樣癌(colloidcarcinoma)、粉刺狀癌(comedocarcinoma)、子宮體癌(corpuscarcinoma)、篩狀癌(cribriformcarcinoma)、胸廓癌(carcinomaencuirasse)、皮跌癌(carcinomacutaneum)、柱狀細(xì)胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱狀細(xì)胞癌(cylindricalcellcarcinoma)、導(dǎo)管癌、硬癌(carcinomadurum)、胚胎性癌(embryonalcarcinoma)、體樣癌(encephaloidcarcinoma)、epiennoid癌(epiennoidcarcinoma)、腺樣上皮癌(carcinomaepithelialeadenoides)、夕卜植癌(exophyticcarcinoma)、潰瘍性癌(carcinomaexulcere)、硬癌(carcinomaf!brosum)、股狀癌(gelatiniformcarcinoma)、股樣癌(gelatinouscarcinoma)、巨大細(xì)胞癌(giantcellcarcinoma)、巨細(xì)胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandularcarcinoma)、顆粒細(xì)胞癌(granulosacellcarcinama)、毛母質(zhì)癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌(hematoidcarcinoma)、肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma)、大嗜酸細(xì)胞癌(Hurthlecellcarcinoma)、透明質(zhì)癌(hyalinecarcinoma)、hypemephroid癌(hypemephroidcarcinoma)、幼稚型胚月臺(tái)性癌(infantileembryonalcarcinoma)、原位癌、表皮內(nèi)癌(intraepidermalcarcinoma)、上皮內(nèi)癌(intraepithelialcarcinoma)、克龍》泉切爾癌(Krompecher'scarcinoma)、Kulchitzky細(xì)胞癌(Kulchitzky-cellcarcinoma)、大細(xì)胞癌(large-cellcarcinoma)、豆?fàn)畎?lenticularcarcinoma)、豆?fàn)畎?carcinomalenticulare)、月旨瘤癌(lipomatouscarcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelialcarcinoma)、髓樣癌(carcinomamedullare)、號(hào)樣癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌(melanoticcarcinoma)、軟癌(carcinomamolle)、粘液癌(mucinouscarcinoma)、粘液癌(carcinomamuciparum)、粘液細(xì)胞癌(carcinomamucocellulare)、粘液表皮樣癌(mucoepidermoidcarcinoma)、粘液癌(carcinomamucosum)、粘液癌(mucouscarcinoma)、粘液瘤樣癌(carcinomamyxomatodes)、鼻咽癌(naspharyngealcarcinoma)、燕麥細(xì)胞癌(oatcellcarcinoma)、骨化性癌(carcinomaossificans)、類(lèi)骨質(zhì)癌(osteoidcarcinoma)、乳頭狀癌(papillarycarcinoma)、門(mén)脈周癌(periportalcarcinoma)、原位癌(preinvasivecarcinoma)、棘細(xì)胞癌(pricklecellcarcinoma)、軟糊狀癌(pultaceouscarcinoma)、腎的腎細(xì)胞癌(renalcellcarcinomaofkidney)、儲(chǔ)備細(xì)胞癌(reservecellcarcinoma)、肉瘤樣癌(carcinomasarcomatodes)、施奈德癌(schneideriancarcinoma)、硬癌(scirrhouscarcinoma)、陰嚢癌(carcinomascroti)、印戒細(xì)胞癌(signet-ringcellcarcinoma)、單純癌(carcinomasimplex)、小細(xì)胞癌(small-cellcarcinoma)、硬癌(solanoidcarcinoma)、球狀細(xì)胞癌(spheroidalcellcarcinoma)、梭形細(xì)胞癌(spindlecellcarcinoma)、號(hào)樣癌(carcinomaspongiosum)、鱗癌(squamouscarcinoma)、蜂狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma)、繩捆癌(stringcarcinoma)、血管擴(kuò)張性癌(carcinomatelangieetatieum)、血管擴(kuò)張性癌(carcinomatelangiectodes)、移行細(xì)胞癌(transitionalcellcarcinoma)、結(jié)節(jié)性皮癌(carcinomatuberosum)、結(jié)節(jié)性皮癌(tuberouscarcinoma)、疾狀癌(verrucouscarcinoma)和絨毛狀癌(carcinomavillosum)。術(shù)語(yǔ)"肉瘤"通常是指這樣的肺瘤，即這種腫瘤由胚胎結(jié)締組織之類(lèi)的物質(zhì)構(gòu)成，并且通常由嵌于纖維物質(zhì)或同質(zhì)物質(zhì)中壓實(shí)的細(xì)胞組成。肉瘤包括，例如軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤(Abemethy'ssarcoma)、月旨肪肉瘤(adiposesarcoma)、月旨肪肉瘤(liposarcoma)、腺泡狀軟組織肉瘤(alveolarsoftpartsarcoma)、成釉細(xì)胞肉瘤、葡萄狀肉瘤(botryoidsarcoma)、綠色瘤肉瘤、絨毛膜癌、胚胎性肉瘤(embryonalsarconm)、Wilns肺瘤肉瘤(Wilns'tumorsarcoma)、子宮內(nèi)膜肉瘤(endometrialsarcoma)、間質(zhì)肉瘤(stromalsarcoma)、尤因肉瘤(Ewing'ssarcoma)、筋膜肉瘤(fascialsarcoma)、纖維母細(xì)胞肉瘤(fibroblasticsarcoma)、巨細(xì)胞肉瘤(giantcellsarcoma)、粒細(xì)胞肉瘤(granulocyticsarcoma)、霍奇金肉瘤(Hodgkin'ssarcoma)、特發(fā)性多發(fā)性色素沉著出血性肉瘤(idiopathicmultiplepigmentedhemorrhagicsarcoma)、B細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤(immunoblasticsarcomaofBcells)、淋巴瘤、T細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤(immunoblasticsarcomaofT-cells)、詹森肉瘤(Jensen'ssarcoma)、卡》皮西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、肝巨喧細(xì)胞肉瘤(Kupffercellsarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、白血病'性肉瘤(leukosarcoma)、惡'性間葉肉瘤(malignantmesenchymomasarcoma)、骨膜外肉瘤(parostealsarcoma)、網(wǎng)織紅細(xì)胞肉瘤(reticulocyticsarcoma)、勞斯肉瘤(Roussarcoma)、漿液嚢'性肉瘤(serocysticsarcoma)、滑膜肉瘤和毛細(xì)血管擴(kuò)張'性肉瘤(telangiectaticsarcoma)。術(shù)語(yǔ)"黑色素瘤"用以指一種起源于皮膚和其他器官的黑色素細(xì)胞體系的腫瘤。黑色素瘤包括，例如肢端雀斑樣痣黑色素瘤25(acral-lentiginousmelanoma)、無(wú)黑色素性黑色素瘤(amelanoticmelanoma)、良性幼年黑色素瘤(benignjuvenilemelanoma)、克勞德曼黑色素瘤(Cloudman'smelanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding畫(huà)Passeymelanoma)、幼年黑色素瘤(juvenilemelanoma)、惡性雀斑樣痣黑色素瘤(lentigomalignamelanoma)、惡性黑色素瘤(malignantmelanoma)、結(jié)節(jié)性黑色素瘤(nodularmelanoma)、曱下黑色素瘤(subungalmelanoma)和淺表擴(kuò)散性黑色素瘤(superflcialspreadingmelanoma)。另外的癌癥包括例如，霍奇金病(Hodgkin'sDisease)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin'sLymphoma)、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥(primarythrombocytosis)、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細(xì)胞肺癌腫瘤(small-celllungtumors)、原發(fā)性腦腫瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰島素瘤(malignantpancreaticinsulanoma)、惡性類(lèi)癌(malignantcarcinoid)、癌前皮跌病變(premalignantskinlesions)、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌(genitourinarytractcancer)、惡性高釣血癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和腎上腺皮質(zhì)癌。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為一種上皮癌或一種腺癌。例如，在一些實(shí)施方案中，所述障礙可為起源自上皮組織的卵巢癌或?qū)m頸癌。再例如，在一些實(shí)施方案中，所述障礙可為選自但不限于卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤和胰腺癌的一種腺癌。在一些實(shí)施方案中，可選擇一種或多種用于檢測(cè)已與癌癥(以及在一些實(shí)施方案中，癌癥的具體階段)關(guān)聯(lián)的自身抗體的抗原。與癌癥相關(guān)的自身抗體發(fā)生免疫反應(yīng)并且可與本申請(qǐng)的方法一起使用的抗原的非限制性實(shí)例在下文的表中列出。作為一個(gè)實(shí)例，可應(yīng)用癌癥抗原肽，例如凋亡蛋白抑制物(IAP)家族的成員(例如生存素)。生存素在大多數(shù)胰臟腺癌中表達(dá)(Sarelaetal.Expressionofsurvivin，anovelinhibitorofapoptosisandcellcycleregulatoryprotein,inpancreaticadenocarcinoma.BrJCancer.2002Mar18;86(6):886-92)?？捎糜诒旧暾?qǐng)方法的其他抗原包括粘蛋白(例如CA125(MUC-16)、TAG-72和MUC-1)。許多腺癌中會(huì)出現(xiàn)粘蛋白產(chǎn)生的增多，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等。腫瘤相關(guān)的抗原MUC-1在多種來(lái)源的人腺癌中過(guò)表達(dá)且糖基化不足，所述多種來(lái)源例如乳房、卵巢和結(jié)腸(Henderikxetal.Humansingle-chainFvantibodiestoMUC-1corepeptideselectedfromphagedisplaylibrariesrecognizeuniqueepitopesandpredominantlybindadenocarcinoma.CancerRes.1998Oct1;58(19):4324-32)。另外，腫瘤相關(guān)的糖蛋白TAG-72在大多數(shù)人腺癌中表達(dá)，但^艮少在大部分正常組織中表達(dá)(Yoonetal.Construction,affinitymaturation,andbiologicalcharacterizationofananti-tumor-associatedglycoprotein-72humanizedantibody.JBiolChem.2006Mar17;281(ll):6985-92)。可用于本申請(qǐng)方法的其他抗原包括癌-睪丸抗原(例如NY-ESO-l、SSX-1、SSX-2、SSX-4和SCP-1)。作為一個(gè)實(shí)例，現(xiàn)已證明癌-睪丸抗原在卵巢漿液性新生物中的表達(dá)可與其惡性的程度直接相關(guān)。可用于本申請(qǐng)方法的其他抗原包括熱休克蛋白(例如HSP27、HSP60、HSP卯和GRP78)。例如，現(xiàn)已證明HSP在肺腺癌中的表達(dá)較高。而且，HSP70和HSP90可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)聯(lián)。亦見(jiàn)例如Crouteetal.Expressionofstress-relatedgenesinacadmium-resistantA549humancellline.JournalofToxicology&EnvironmentalHealthPartA.68(9):703-18,2005;Liangetal.Mislocalizationofmembraneproteinsassociatedwithmultidrugresistanceincisplatin-resistantcancercelllines.CancerResearch.63(18):5909醫(yī)16，2003;Lee.GRP78inductionincancer:therapeuticandprognosticimplications.CancerResearch.67(8):3496-9，2007;和Leeetal.GRP78asanovelpredictorofresponsivenesstochemotherapyinbreastcancer.CancerResearch.66(16):7849畫(huà)53，2006?？捎糜诒旧暾?qǐng)方法的抗原另一實(shí)例包括間皮素，它是存在于正常間皮細(xì)胞上并在多種人腫瘤中過(guò)表達(dá)的分化抗原，所述人肺瘤包括間皮瘤、卵巢腺癌和胰腺癌(Hassanetal.Mesothelin:anewtargetforimmunotherapy.ClinCancerRes.2004Jim15;10(12Pt1):3937-42;Baruchetal.lmmunocytochemicalstudyoftheexpressionofmesothelininfine-needleaspirationbiopsyspecimensofpancreaticadenocarcinoma.DiagnosticCytopathology.35(3》143-7，2007Puetal.UtilityofWT-l，p63，MOC31,mesothelin,andcytokeratin(K903andCK5/6)immunostainsindifferentiatingadenocarcinoma,squamouscellcarcinoma,andmalignantmesotheliomaineffusions.DiagnosticCytopathology.36(1):20國(guó)5，2008;Arganietal.Mesothelinisoverexpressedinthevastmajorityofductaladenocarcinomasofthepancreas:identificationofanewpancreaticcancermarkerbyserialanalysisofgeneexpression(SAGE).ClinicalCancerResearch.7(12》3862-8，2001;和Dennisetal.Markersofadenocarcinomacharacteristicofthesiteoforigin:developmentofadiagnosticalgorithm.ClinicalCancerResearch.11(10):3766誦72，2005)。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>HSP-90胞質(zhì)GRP-78胞質(zhì)前溶酶體酶家親組織蛋胞質(zhì)族的酶前體白酶-DPLAP質(zhì)膜粘附分子EpCAM質(zhì)膜粘蛋白TAG-72胞質(zhì)和質(zhì)膜CA125質(zhì)膜Muc-1Mel誦CAM質(zhì)膜Muc-16質(zhì)膜粘附相關(guān)的蛋間皮素質(zhì)膜白質(zhì)(糖蛋白)激酶家族EGF激酶胞質(zhì)監(jiān)用于診斷不孕障礙的方法本申請(qǐng)公開(kāi)的主題進(jìn)一步提供了用于診斷和表征受試者中的不孕障礙的方法。不孕障礙是常見(jiàn)的醫(yī)學(xué)病癥，每年有大約730萬(wàn)美國(guó)人患此癥。據(jù)估計(jì)，約10%-15%的嘗試懷孕的已婚夫婦在一年后仍沒(méi)有懷孕。不孕障礙包括女性不孕癥，這是一個(gè)由健康保健提供者針對(duì)如下這樣的女性所使用的術(shù)語(yǔ)，即這些女性在嘗試至少一年后仍不能懷孕或者能懷孕但不能維持妊娠至足月。女性不孕癥的大多數(shù)病例由排卵的問(wèn)題引起。一些影響生育能力(fecundity)和生育(fertility)的不孕障礙包括卵巢功能早衰(POF)，其中卵巢在自然絕經(jīng)前停止工作；多嚢性卵巢綜合征(PCOS)，其中卵巢不能有規(guī)律地釋放卵子或不能釋放活的健康卵子；以及由子宮內(nèi)膜異位癥引起的生殖病理。其他不孕障礙可包括子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失。目前，健康保健專(zhuān)家通過(guò)以下方式診斷不孕癥進(jìn)行由評(píng)估排卵狀態(tài)組成的病情檢查，進(jìn)行鑒定子宮或輸卵管病理學(xué)或者其他成因性因素的檢查。在許多情況下，經(jīng)排除常見(jiàn)的根本病因?qū)W并且在兩個(gè)月經(jīng)周期后完成臨床診斷。生殖衰竭，一一包括反復(fù)自然流產(chǎn)和其他不孕障礙一一可由多種原因引起。29自身免疫機(jī)制參與到不孕障礙中，例如子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢衰竭，并且可能是先兆子癇或自然流產(chǎn)的病理生理學(xué)的原因。在33-61%的原因不明性不孕癥患者中已檢測(cè)到抗卵巢的自身抗體，表明該病理學(xué)可代表早期階段的自身免疫性卵巢衰竭。如在其他自身免疫病理學(xué)(例如l型糖尿病和曱狀腺炎)中那樣，抗卵巢的抗體可在發(fā)生臨床癥狀之前數(shù)月或數(shù)年出現(xiàn)，因此它們可在患有原因不明性不孕癥的女性中預(yù)測(cè)未來(lái)的卯巢衰竭。子宮內(nèi)膜異位癥是一種折磨多達(dá)10%的育齡女性的疾病，其特征在于激素調(diào)節(jié)的子宮外的子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)。已知子宮內(nèi)膜異位癥可造成30-50%患病女性的女性不孕障礙。已表明自身免疫機(jī)制可能參與其中，抗不同候選自身抗原的抗體在這些患者中已被證實(shí)。雖然子宮內(nèi)膜異位癥中的不孕機(jī)制還不完全清楚，但是在多達(dá)三分之二的患者中已發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥與自身抗體和/或其他自身免疫疾病有關(guān)。已有報(bào)道，在患有子宮內(nèi)膜異位癥的患者中100%的存在抗子宮內(nèi)膜的抗體，62%的存在抗卵巢的抗體。已在POF中研究了自身免疫的參與，自身免疫形式的POF的總比例估計(jì)為20-70%。在多種情形下，人卵巢可作為自身免疫攻擊的靶標(biāo)，所述情形包括多種器官特異性或全身性自身免疫疾病。在臨床上，隨后的卵巢功能障礙經(jīng)常會(huì)引起POF,而涉及卵巢的其他病理學(xué)例如原因不明性不孕癥、PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥已與抗卵巢的自身免疫相關(guān)聯(lián)。對(duì)這些病理學(xué)中的自身免疫機(jī)制的診斷有賴(lài)于對(duì)抗卵巢的自身抗體的檢測(cè)，但最近特別的關(guān)注還集中在自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞組分上。然而，對(duì)自身免疫效應(yīng)物的分子靶標(biāo)的了解很少，并且真正被鑒定的自身抗原很少。對(duì)針對(duì)多種卵巢靶標(biāo)的自身抗體的檢測(cè)可支持POF的自身免疫病因?qū)W的假設(shè)。對(duì)抗卵巢的抗體的最初報(bào)道主要包括患有POF和相關(guān)的腎上腺自身免疫疾病的患者。這些患者具有這樣的抗體，即該抗體可識(shí)別腎上腺皮質(zhì)、睪丸、胎盤(pán)和卵巢的產(chǎn)生類(lèi)固醇的多種類(lèi)型細(xì)胞，并且被稱(chēng)為類(lèi)固醇細(xì)胞抗體(SCA)。SCA的流行依賴(lài)于這樣的臨床特征它們可在大約60%的APS-I患者和25-40%的APS-II患者中被檢測(cè)到，但最常(78-100%)出現(xiàn)于患POF的患者中。還已表明，33-43%的患多內(nèi)分泌病和SCA的正常周期的女性將在8-15年內(nèi)發(fā)生卵巢衰竭。生殖衰竭的另一種常見(jiàn)原因是PCOS，其特征在于與多種臨床癥狀相關(guān)的高雄激素長(zhǎng)期無(wú)排卯狀態(tài)，并影響5-10%的生育年齡的女性。雖然PCOS以及無(wú)該綜合征的多嚢卵巢與激素失調(diào)有關(guān)，但是已表明有自身免疫失調(diào)。已報(bào)道了具有與抗卵巢的血清抗體相關(guān)的嚢方面的自身免疫卯巢炎的組織病理學(xué)特征。多位研究人員已描述了非器官特異性和器官特異性自身抗體的普遍存在，并且已在50-60%的PCOS患者中證明有抗卵巢的抗體。Timg報(bào)道了在鼠模型中產(chǎn)生卵母細(xì)胞自身抗體可引起卵巢衰竭。無(wú)臨床癥狀的患者中的自身免疫功能障礙還可引起反復(fù)的自然流產(chǎn)。事實(shí)上，某些反復(fù)流產(chǎn)者具有一種或多種異常自身抗體。在反復(fù)流產(chǎn)中已涉及抗磷脂的抗體、抗DNA的抗體和抗核的抗體。一種自然流產(chǎn)的機(jī)制被認(rèn)為是胎盤(pán)血管的血栓形成和胎盤(pán)梗死，它們由自身抗體抗p2-糖蛋白I、凝血酶原(prothrombin)和/或膜聯(lián)蛋白V(annexinV)的反應(yīng)所致。另一個(gè)可能的原因是自身抗體直接結(jié)合于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過(guò)阻止分化成合體滋養(yǎng)層減少滋養(yǎng)層侵入至母體蛻膜和植入。免疫系統(tǒng)已顯示在卵巢功能早衰、多嚢卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、反復(fù)妊娠丟失和其他不孕障礙的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了免疫反應(yīng)性的標(biāo)記物(例如與一種不孕障礙相關(guān)的自身抗體)作為不孕障礙診斷輔助工具的用途，所述不孕障礙包括但不限于POF、PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失。而且，如本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供的，對(duì)于抗生殖道上特定組分的自身免疫的評(píng)估是一種用于不孕癥治療的預(yù)后工具。由此，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種診斷受試者中的不孕障礙的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的一個(gè)生物樣品；將一種抗原與所述樣品接觸，其中所述抗原包括一種自身抗體免疫反應(yīng)肽；在所述樣品中檢測(cè)對(duì)所述抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的自身抗體；并將自身抗體對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平與一個(gè)參考水平比較，以在診斷所述受試者中的所述不孕障礙。而且，在本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于表征受試者中的與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的不孕障礙的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來(lái)自受試者的包含自身抗體的一個(gè)生物樣品；將一種抗原與所述樣品接觸，其中所述抗原包括一種自身抗體免疫反應(yīng)肽；在所述樣品中檢測(cè)對(duì)所述抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的自身抗體；并對(duì)自身抗體針對(duì)所述抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性水平定量，從而表征所述受試者中的所述不孕障礙。例如，在一些實(shí)施方案中，所述不孕障礙選自但不限于卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢綜合征(PCOS)、子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失(自然流產(chǎn))。而且，在一些實(shí)施方案中，所檢測(cè)的自身抗體對(duì)源自卵巢、子宮內(nèi)膜、胎盤(pán)或它們的結(jié)合的抗原有免疫反應(yīng)性。在用于診斷和/或表征受試者中的不孕障礙的方法的一些實(shí)施方案中，所述自身抗體免疫反應(yīng)肽可分離自一種外來(lái)體。在一些實(shí)施方案中，所述自身抗體免疫反應(yīng)肽為選自以下的肽抗原分子量約50kD和80kD的核抗原以及分子量約10kD、30kD、45kD、90kD和125kD的膜抗原。膜蛋白質(zhì)識(shí)別由所有不孕癥共有；然而，核蛋白質(zhì)識(shí)別似乎是子宮內(nèi)膜異位癥所特有的。IL用于檢測(cè)自身抗體的試劑盒在另一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的主題提供了用于檢測(cè)生物樣品中的自身抗體的免疫試劑盒。這類(lèi)試劑盒一般可包含一種或多種本文公開(kāi)的可與測(cè)試自身抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述抗原分離自外來(lái)體，正如本文所公開(kāi)的那樣。因此，更具體地，所述免疫檢測(cè)試劑盒將在合適的容器中包含一種或多種自身抗體免疫反應(yīng)性肽抗原。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含與所述抗原結(jié)合的抗體和/或經(jīng)例如Fc部分與其他抗體(例如目標(biāo)自身抗體)結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方案中，所提供的抗原可結(jié)合于一種固體支持物上，例如柱基質(zhì)或微量滴定板的孔、膜(例如硝酸纖維素、PVDF或類(lèi)似材料)、珠子或者浸漬片?；蛘撸鲋С治锟勺鳛樗鲈噭┖械膯为?dú)組分提供。所述試劑盒的免疫檢測(cè)試劑可包含與所給定的檢測(cè)抗體或所述32抗原本身相關(guān)聯(lián)或者連接的可檢測(cè)標(biāo)記。與一種第二結(jié)合配體相關(guān)聯(lián)或者連接的可檢測(cè)標(biāo)記也被考慮。這種可檢測(cè)標(biāo)記包括染料、半抗原、化學(xué)發(fā)光分子或熒光分子(羅丹明、熒光素、綠色熒光蛋白、螢光素酶)、生物素、放射標(biāo)簽(3H、35S、32P、"C、1311)或酶(堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶)。所述試劑盒可進(jìn)一步包含合適的設(shè)定量的標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)包括抗體和抗原。它們可用于制備檢測(cè)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。不管本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的試劑盒的類(lèi)型如何，它通常均可包含裝有合適分裝的所述生物試劑的一個(gè)或多個(gè)容器。所述試劑盒的組分可以水性介質(zhì)的形式或以?xún)龈傻男问桨b。本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的組合物可被有利地包裝于這樣的一個(gè)試劑盒中，即該試劑盒包含所述一種或多種活性試劑、一個(gè)合適的容器以及還有使用所述試劑盒的說(shuō)明書(shū)。所述試劑盒的一種或多種試劑可以一種附著于一種固體支持物的液體溶液形式提供或以一種干粉形式提供。如果以一種液體溶液形式提供所述試劑，那么所述液體溶液可以是一種水性溶液。如果所提供的試劑附著于一種固體支持物，那么所述固體支持物可為層析介質(zhì)(chromatographmedia)、具有多個(gè)孔的測(cè)試板或顯微鏡載玻片。如果所提供的試劑為干粉，那么通過(guò)添加一種合適溶劑可將所述粉體復(fù)水，所述溶劑可被提供。所述試劑盒的容器一般可包括所述抗原可置于其中且可根據(jù)需要適當(dāng)?shù)胤盅b的至少一個(gè)微量滴定板孔、載玻片、玻璃瓶、試管、燒瓶、瓶子、或者甚至注射器或其他容器。如果提供了第二或第三結(jié)合配體或另外的組分，那么所述試劑盒通常還可包含這種配體或組分可置于其中的第二個(gè)、第三個(gè)或其他另外的容器。本申請(qǐng)的主題試劑盒一般還可包含一種結(jié)構(gòu)，用于在商業(yè)銷(xiāo)售時(shí)以密封方式包含所述抗原容器及任何其他試劑容器。這種結(jié)構(gòu)可包括注模或吹模塑料包裝體，所需容器被保持于其中。實(shí)施例引入以下的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的實(shí)施方式。考慮到本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容及本領(lǐng)域中的一般技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，以下的實(shí)施例僅旨在示例，并且只要不偏離本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的范圍進(jìn)行多種改變、修飾和修改。實(shí)施例1反應(yīng)性抗體與癌癥關(guān)聯(lián)自身反應(yīng)性抗體已被證明普遍存在于所有受測(cè)試的癌癥患者中。在卵巢癌患者(11=28)和無(wú)腫瘤的年齡匹配女性志愿者(n=32)中分析了腫瘤反應(yīng)性自身抗體的出現(xiàn)情況。通過(guò)ELISA定量測(cè)定了卵巢癌患者血清中IgG的存在及其與源自卵巢腫瘤的細(xì)胞抗原的反應(yīng)性。將來(lái)自對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的UL-1卵巢腫瘤細(xì)胞的腫瘤來(lái)源細(xì)胞抗原以1:25稀釋到由100mM碳酸鈉和0.5MNaCl組成的偶聯(lián)緩沖液(pH8.3)中。將等份試樣添加至96-孔Immulon4微量滴定板的孔中，并在37。C下孵育過(guò)夜。將所述板以5%脫脂奶粉封閉，然后在4。C下與來(lái)卵巢癌患者和年齡匹配的正常對(duì)照的以1/200稀釋的200jil血清孵育過(guò)夜。將所述板洗滌并與過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體(以1/5000稀釋)孵育，通過(guò)以下方式測(cè)量存在的結(jié)合抗體將所述孔與含OPD(0.4mg/ml)的50mM檸檬酸鹽緩沖液孵育，在490nm測(cè)量吸光度。所有卵巢癌患者都表現(xiàn)出識(shí)別出卵巢腫瘤來(lái)源蛋白質(zhì)的自身抗體水平，該水平顯著高于其不攜帶癌的對(duì)應(yīng)者(p<0.0001)。對(duì)照群體血清中觀察到的IgG結(jié)合水平代表背景水平。在所述癌癥患者和對(duì)照組之間在IgG與腫瘤抗原結(jié)合方面沒(méi)有出現(xiàn)重疊。由于癌癥患者呈現(xiàn)了一個(gè)升高的腫瘤反應(yīng)性抗體水平，并且這些自身抗體的水平呈現(xiàn)了顯著的差異性，所以在這些腫瘤反應(yīng)性IgG的相對(duì)吸光度和疾病階段之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。關(guān)于與UL-1卵巢腫瘤分開(kāi)(圖1)。反應(yīng)性i:G的水平隨疾病階段的發(fā)展出、現(xiàn)升高。來(lái)自I期癌癥患者(n=8)的血清在如下背景之上呈現(xiàn)出顯著的升高正常血清的背景(n=32，p<0.001)或患良性卯巢疾病女性的血清的背景(n=8，p<0.01)。在來(lái)自I期卵巢癌和低惡性可能性的卵巢腫瘤的血清中檢測(cè)的免疫反應(yīng)性沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異。11期患者(11=10)中出現(xiàn)的免疫反應(yīng)性水平顯著高于I期患者中出現(xiàn)的水平(p<0.001),并顯著低于m期患者(n=8)的血清中檢測(cè)的水平(P<o.oi)。m期患者中出現(xiàn)的免疫反應(yīng)性水平顯著低于IV期患者(n=8)中出現(xiàn)的水平(p<0.001)。因此，卵巢癌患者呈現(xiàn)了與疾病階段相關(guān)的腫瘤反應(yīng)性抗體。實(shí)施例2腫瘤反應(yīng)性IgG的特異性抗原耙標(biāo)識(shí)別由于獲自卵巢癌患者血清的自身抗體對(duì)卵巢肺瘤抗原的反應(yīng)性基于疾病的階段可表現(xiàn)出量的差異，由此也使用蛋白質(zhì)免疫印跡和密度測(cè)定研究了性質(zhì)上的差異。使用來(lái)自對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3個(gè)卵巢肺瘤細(xì)胞系(UL-1、UL-3和UL-6)的細(xì)胞蛋白抗原，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡評(píng)估了與卵巢癌患者的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)的組分的存在(圖2,代表性的印跡)。使用患者血清(1:100稀釋)作為第一抗體源進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡。先使用過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體，然后使用ECL顯示源自患者的抗體與源自腫瘤細(xì)胞的抗原的結(jié)合。通過(guò)密度測(cè)定定量測(cè)定免疫反應(yīng)性。分析了所識(shí)別的抗原及該識(shí)別的強(qiáng)度上的差異。分析了十(10)個(gè)I期血清、十(10)個(gè)II期血清、十(10)個(gè)m期血清和十二(12)個(gè)IV期血清。對(duì)于所有卯巢癌患者，這些蛋白質(zhì)免疫印跡鑒定了分子量介于10-140kD的多條帶，但在患者中免疫相互作用的數(shù)量和強(qiáng)度是不同的。信號(hào)在所述免疫印跡上的強(qiáng)度變化與疾病的階段有關(guān)(每條帶的總像素，相關(guān)系數(shù)r-0.906)。雖然，晚期癌癥患者通常識(shí)別更大強(qiáng)度的更多條帶，但是來(lái)自卵巢癌患者的IgG在這些蛋白質(zhì)免疫印跡上出現(xiàn)了階段特異性的差異識(shí)別模式。除了階段相關(guān)的定量差異之外，早期階段的患者還呈現(xiàn)出對(duì)分子量大于100kD的數(shù)種抗原所特有的強(qiáng)烈識(shí)別(圖A中的框示出)，而晚期患者還呈現(xiàn)出對(duì)分子量小于40kD的抗原所特有的識(shí)別(圖B中的框示出)。作為一個(gè)對(duì)照，還測(cè)試了正常血清對(duì)這些蛋白質(zhì)的反應(yīng)性，以及所述癌癥患者血清對(duì)正常卵巢上皮的反應(yīng)性。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡沒(méi)有發(fā)現(xiàn)來(lái)自正常(不攜帶腫瘤)女性對(duì)照的血清會(huì)識(shí)別蛋白質(zhì)，而癌癥患者的血清僅呈現(xiàn)與正常卵巢上皮的幾個(gè)條帶的反應(yīng)性。由于一些抗原可被早期血清識(shí)別，并繼續(xù)被來(lái)自晚期患者的血清35識(shí)別，這可表明這些抗原性蛋白質(zhì)在早期表達(dá)并且其表達(dá)在整個(gè)腫瘤進(jìn)展中得以保持。一些蛋白質(zhì)似乎僅在腫瘤進(jìn)展的晚期被識(shí)別，表明它們?cè)诤髞?lái)發(fā)生改變和/或后來(lái)才出現(xiàn)。然而，由于它們?cè)诨颊咧械淖R(shí)別情況相同，因此在這些患者中它們可代表共同的變化。一些抗原性蛋白質(zhì)似乎優(yōu)先在早期被識(shí)別，表明早期腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵蛋白質(zhì)出現(xiàn)了改變。對(duì)這些階段特異性改變的蛋白質(zhì)的鑒定提供了對(duì)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的每個(gè)階段均很重要的改變的進(jìn)一步了解。其他研究人員使用蛋白質(zhì)印跡或基于源自腫瘤的抗原的ELISA的工作已在所有受試患者中檢測(cè)到了腫瘤反應(yīng)性抗體:然而，對(duì)特異性抗原蛋白質(zhì)的識(shí)別的評(píng)估還沒(méi)有在100%的患者中鑒定出單一組分，大多數(shù)單一蛋白質(zhì)僅在10-40%的患者#皮識(shí)別出。這種有限的識(shí)別可能是由于大多數(shù)肺瘤反應(yīng)性自身抗體的研究使用了重組蛋白質(zhì)(在許多情況中是野生型蛋白質(zhì))，所述蛋白質(zhì)缺乏可修改抗原表位的癌癥相關(guān)的翻譯后修飾，這可能會(huì)低估真實(shí)的免疫反應(yīng)性水平。自身抗體對(duì)在正常及癌癥組織中廣泛表達(dá)的抗原的應(yīng)答似乎可歸因于腫瘤特異性突變或翻譯后修飾。雖然在所有癌癥中均可檢測(cè)到腫瘤反應(yīng)性自身抗體，但是腫瘤反應(yīng)性IgG識(shí)別這些來(lái)自不攜帶癌癥的志愿者的特異性抗原的事件很罕見(jiàn)(<1%),并且在本申請(qǐng)公開(kāi)的測(cè)定系統(tǒng)中沒(méi)有檢測(cè)到這種事件。實(shí)施例3標(biāo)記物鑒定的治療響應(yīng)由于在晚期疾病的患者中出現(xiàn)了反應(yīng)性模式的差異，因而檢查了這種差異和化學(xué)抗性之間的相關(guān)性。通過(guò)2維電泳分離細(xì)胞組分并隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡，使得這些差異中的一些可被評(píng)估。使用來(lái)自對(duì)順鉑治療無(wú)最初響應(yīng)的患者及呈現(xiàn)最初響應(yīng)并>12個(gè)月保持無(wú)疾病的患者的血清，鑒定了對(duì)與順鉑抗性相關(guān)的3個(gè)點(diǎn)的一簇的識(shí)別(圖3)。利用這些細(xì)胞抗原作為本文公開(kāi)的診斷陣列的一部分可使抗性腫瘤被及早地鑒定。實(shí)施例4對(duì)體內(nèi)識(shí)別的抗原蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定36由于患者的體液應(yīng)答是針對(duì)與卵巢腫瘤相關(guān)的特定階段相關(guān)的蛋白質(zhì)，所以對(duì)這些免疫反應(yīng)性抗原的鑒定通過(guò)開(kāi)發(fā)一種蛋白質(zhì)陣列開(kāi)始。為了使分析的總蛋白質(zhì)的數(shù)目最少，通過(guò)免疫沉淀將免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)分離。IgG分離自3名患晚期卵巢癌的女性的血清，分離使用的是lmlHITRAPPROTEING-SEPHAROSE⑧柱(GEHealthcare)。將結(jié)合的IgG級(jí)分以IMMUNPURE⑧洗脫緩沖液(GEHealthcare)洗脫，在280nm監(jiān)測(cè)。將含IgG的級(jí)分合并并濃縮，然后依照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)偶聯(lián)至HITRAPNHSTM柱(GEHealthcare)。將來(lái)自UL-1卵巢肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞蛋白質(zhì)溶解并澄清。將固定的患者IgG的等分試樣在4。C與所述細(xì)胞蛋白質(zhì)制品孵育過(guò)夜，然后將結(jié)合的復(fù)合物洗脫。將這些免疫純化的細(xì)胞蛋白質(zhì)在4.6x250mmC8(300fi)柱上通過(guò)RP-HPLC色諳法分級(jí)分離。將所得到的級(jí)分通過(guò)speed-vac干燥，用于開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)陣列。將所述蛋白質(zhì)溶液(2.5nl)手工加載至單個(gè)斑點(diǎn)上。將一個(gè)過(guò)氧化物酶綴合的Ig樣品點(diǎn)至每個(gè)膜上作為陽(yáng)性對(duì)照并用于所述陣列的定位(在圖4A和4B中顯示為C道)。將來(lái)自晚期卵巢癌患者的血清(1:100稀釋)在4。C與所述膜孵育過(guò)夜，然后將膜與過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體孵育，通過(guò)ECL顯像。將所形成的膜成像，并使用用于斑點(diǎn)識(shí)別和定量的柯達(dá)分析軟件(Kodakanalysissoftware)分析。每個(gè)被分析的卵巢癌患者均識(shí)別了多個(gè)蛋白質(zhì)；然而，所有患者都識(shí)別一些蛋白質(zhì)。使用該陣列系統(tǒng)，對(duì)照(非癌癥患者)血清(11=10)未識(shí)別任何蛋白質(zhì)靶標(biāo)。為了鑒定引起這種觀察到的與患者自身抗體的免疫反應(yīng)的特異性蛋白質(zhì)，將對(duì)應(yīng)于這些被卵巢癌患者的體液免疫應(yīng)答所識(shí)別的蛋白質(zhì)的一部分進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜，接著進(jìn)行胰蛋白酶消化。將所產(chǎn)生的肽在熔融二氧化珪微細(xì)管柱(75x200nm，PolymicroTechnologies,Inc.)上通過(guò)HPLC分級(jí)分離，并使用0-80%線(xiàn)性梯度乙腈的0.1M乙酸溶液(140B溶劑送遞系統(tǒng))直接洗脫至三重四極質(zhì)鐠儀(TSQ70，F(xiàn)innigaiiMAT)的電噴霧離子源中。獲得每個(gè)峰的質(zhì)譜并將對(duì)每種蛋白質(zhì)產(chǎn)生的分子量片段與其他已知蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)比較，用于鑒定蛋白質(zhì)。還分析了另外的常見(jiàn)峰(11、19、44和49);然而，這些本申請(qǐng)的方法可鑒定一組僅被患卵巢癌的患者識(shí)別的抗原(圖5)。本文公開(kāi)的數(shù)據(jù)表明與疾病的存在、階段和化學(xué)抗性相關(guān)的反應(yīng)性組分的存在。數(shù)個(gè)小組已提出，蛋白質(zhì)在癌癥發(fā)生早期表達(dá)，以及它們中的多種已被發(fā)現(xiàn)可誘發(fā)自身抗體。Disis等人(Globalroleoftheimmunesysteminidentifyingcancerinitiationandlimitingdiseaseprogression.0/C7/w/c/(9"co/ogj;'23(35"S9Z-5，2卵5Z)ec.)證明，癌癥患者在疾病早期階段出現(xiàn)對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的血清抗體反應(yīng)?？筽53的自身抗體已在患早期階段的卵巢癌、結(jié)直腸癌和口腔癌的患者中被報(bào)道。本申請(qǐng)的結(jié)果表明免疫反應(yīng)性相對(duì)于階段的顯著差異，甚者，在早期階段癌癥中的識(shí)別也不同于正常和良性卵巢疾病。這些差異表示出定量的差異(結(jié)合強(qiáng)度或效價(jià))，而不是定性的差異；然而，本申請(qǐng)公開(kāi)的診斷陣列的設(shè)計(jì)使得能同時(shí)地鑒定自身抗體的存在并且對(duì)它們的結(jié)合(強(qiáng)度)定量。因此，本發(fā)明人已證明在腫瘤反應(yīng)性抗體結(jié)合(強(qiáng)度)中存在的定量差異可充分區(qū)分癌癥狀態(tài)和階段，從而用于診斷。實(shí)施例5對(duì)具有確立的蛋白質(zhì)靶的蛋白質(zhì)陣列進(jìn)行評(píng)估使用抗本發(fā)明人以前鑒定的自身抗原蛋白質(zhì)的市售抗體(表1)，通過(guò)免疫沉淀從溶解的UL-1卯巢癌細(xì)胞分離蛋白質(zhì)。將這些分離的蛋白質(zhì)用于確立一個(gè)蛋白質(zhì)陣列，以確定本申請(qǐng)的方法的效力。將這些免疫純化的細(xì)胞蛋白質(zhì)用于開(kāi)發(fā)一個(gè)蛋白質(zhì)陣列，所述蛋白質(zhì)陣列由1.5x2cm的總尺寸上的12個(gè)點(diǎn)組成。將12種蛋白質(zhì)溶液的每一種(2.5jU)手工加載至單個(gè)的點(diǎn)上。將過(guò)氧化物酶綴合的IgG點(diǎn)至每張膜上作為陽(yáng)性對(duì)照并用于所述陣列的定位。將以1:100稀釋的來(lái)自正常女性對(duì)照(n=20)、患良性卵巢疾病的女性(n=20)和患侵襲性卵巢癌的女性(n=20)的血清在4。C與所述膜孵育過(guò)夜。然后將膜與過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體孵育，通過(guò)ECL顯像。將所形成的膜成像，并使用用于斑點(diǎn)識(shí)別和定量的柯達(dá)分析軟件分析。將大于900像素的吸光度設(shè)置為陽(yáng)性，并比較免疫反應(yīng)性陽(yáng)性的血清的百分?jǐn)?shù)。來(lái)自所有患侵襲性卵巢癌的女性的血清識(shí)別至少2/12的受測(cè)抗原；然而，來(lái)自對(duì)照和患良性疾病的女性的血清也表現(xiàn)出對(duì)至少一種抗原的顯著識(shí)別。相反，對(duì)4種或更多種的這些抗原的識(shí)別局限于來(lái)自患侵襲性卵巢癌的女性的血清。將對(duì)4種或更多種抗原的識(shí)別設(shè)置為截止值產(chǎn)生了一種這樣的測(cè)定，即該測(cè)定具有區(qū)分患侵襲性卵巢癌和患良性卵巢疾病的患者的能力，并且敏感性=100%、特異性=76%且陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=100%。見(jiàn)圖6。表l:從卵巢癌細(xì)胞分離、用于所述陣列的細(xì)胞抗原，以及具有抗所述陣列中每種蛋白質(zhì)的自身抗體的卵巢癌患者的百分比。;抗原蛋白靶標(biāo)i具有自體反應(yīng)性IgG的患者(％);同源框基因家族<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>A114(EGFR激酶)固(22.2%)其他胎盤(pán)型堿性磷酸酶19/36(52.8%)NY-ES0117/36(47.2%)EpCAM27/36(75.0%)為了確定另外的參數(shù)，在區(qū)分良性和惡性卯巢結(jié)塊之外，檢查了另外的源自肺瘤的蛋白質(zhì)。圖7顯示的圖像來(lái)自一個(gè)36種蛋白質(zhì)的陣列?；谶@些結(jié)果，該陣列形式可區(qū)分與早期和晚期卵巢癌相關(guān)的抗原識(shí)別。圖7中顯示的數(shù)據(jù)基于來(lái)自單個(gè)卵巢細(xì)胞系(UL-1)的抗原。來(lái)自其他肺瘤細(xì)胞系的某些抗原可呈現(xiàn)更強(qiáng)的反應(yīng)性。在所有卵巢癌患者中呈現(xiàn)最大交叉反應(yīng)性的來(lái)自不同卵巢肺瘤系的最佳抗原可被特別地測(cè)定，用在早期疾病的診斷中。實(shí)施例6對(duì)分離自不同癌癥的蛋白質(zhì)的陣列進(jìn)行評(píng)估下表顯示了一個(gè)陣列的布局，顯示從4種不同卵巢癌分離的20種抗原(產(chǎn)生一共80Ag)，與對(duì)照比較評(píng)估了這些抗原檢測(cè)癌癥患者中自身抗體的能力。所使用的4種卵巢癌細(xì)胞系為A-UL-1、B=UL-2、C-UL-3和D-UL-6，它們?cè)诰唧w實(shí)施方式中被詳細(xì)公開(kāi)。表2:用于檢測(cè)自身抗體的抗原陣列的布局<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>(其中procathD為親組織蛋白酶-D)對(duì)于宮頸癌，對(duì)以下16名受試者的每一名的血清進(jìn)行評(píng)估，以檢測(cè)對(duì)分離自所述宮頸癌細(xì)胞系的蛋白質(zhì)應(yīng)答的抗體的存在。這包括12名患宮頸癌(腺鱗、鱗狀細(xì)胞和腺癌)的受試者和4名對(duì)照者(無(wú)宮頸癌的受試者)。還在以視黃酸處理細(xì)胞培養(yǎng)物后評(píng)估所述反應(yīng)性。大多數(shù)反應(yīng)性在所有細(xì)胞系(ME180、SiHa、CaSki和C33A)的可溶級(jí)分中被檢測(cè)到，并且是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p<0.05)(圖8A和8B)。最少反應(yīng)性在所有細(xì)胞系的膜級(jí)分中被檢測(cè)到。所述反應(yīng)性以像素定量?？傮w來(lái)說(shuō)，CaSki(HPV16和18)表現(xiàn)最大反應(yīng)性，并且在與其他細(xì)胞系相比時(shí)，在所述外來(lái)體級(jí)分和溶解級(jí)分中有最大反應(yīng)性(p<0.05)。無(wú)HPV的細(xì)胞系C33A在膜級(jí)分中表現(xiàn)最大反應(yīng)性。Mel80(HPV-39)表現(xiàn)最小量的反應(yīng)性。相似的抗原識(shí)別跨各個(gè)細(xì)胞系被檢測(cè)到。在不同細(xì)胞系之間有著有差異的抗原識(shí)別。對(duì)照血清沒(méi)有表現(xiàn)出任何反應(yīng)性。在以視黃酸處理的血清中，可溶的細(xì)胞相關(guān)抗原在所有細(xì)胞系中的反應(yīng)性均降低(p<0.05)(圖9)。用所述細(xì)胞相關(guān)抗原記錄到了升高的反應(yīng)性。這在以下級(jí)分中被檢測(cè)到所有細(xì)胞系的膜級(jí)分(p<0.05)、C33A和SiHa細(xì)胞系的核級(jí)分(p<0.05)及SiHa細(xì)胞系的胞質(zhì)溶膠級(jí)分(p<0.05)(圖10)。實(shí)施例7對(duì)跨多個(gè)不同癌癥的診斷測(cè)定進(jìn)行評(píng)估實(shí)施例7的方法腫瘤反應(yīng)性IgG對(duì)特異性抗原靶標(biāo)的識(shí)別。由于獲自卵巢癌患者血清的自身抗體對(duì)卵巢腫瘤抗原的反應(yīng)性基于疾病的階段表現(xiàn)出有定量差異，所以隨后使用ELISA免疫印跡研究定性的差異，以定量測(cè)定與特異性抗原免疫反應(yīng)的水平。外來(lái)體分離自3個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的卵巢腫瘤細(xì)胞系(UL-1、UL-3和UL-6)條件培養(yǎng)基。特異性反應(yīng)性抗原的制備。通過(guò)免疫吸附色譜從純化的外來(lái)體分離用于測(cè)定靶標(biāo)的反應(yīng)性蛋白質(zhì)。獲得每種目的蛋白質(zhì)的市售抗體。將這些抗體依照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)固定于lml的HITRAPNHSTM柱(GEHealthcare)。在以lOO，OOOxg離心外來(lái)體后，將沉淀物溶解于在水上的含以下成分的50mMTris-HCl(pH7.5)中0.3%SDS、2mM原釩酸鈉、200mMDTT、lmM氟化鈉、lmM焦磷酸鈉、1jig/ml亮肽素(leupeptin)、ljig/ml抑肽酶(aprotinin)、1pg/ml胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)和1mMPMSF。所述裂解物經(jīng)聲處理，并以lOO，OOOxg離心15分鐘。所溶解的蛋白質(zhì)通過(guò)與蛋白質(zhì)G-瓊脂糖(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)孵育1小時(shí)使之澄清。將該澄清的溶解蛋白質(zhì)材料應(yīng)用于免疫吸附柱并在4。C下孵育過(guò)夜。將結(jié)合的材料以含1%TritonX-100的PBS洗滌3次，所述特異性抗原蛋白質(zhì)由0.1M甘氨酸-HCl(pH2.8)釋放，由lMTris中和。將該抗原制品應(yīng)用于在TBS中平衡的MACROSPHEREGPCTM150/60柱(4.6x500)(Grace,Deerfield，IL)并進(jìn)行無(wú)梯度洗脫。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡評(píng)估洗脫物的等分試樣，以確證合適的分子級(jí)分。在4.6x250mmC8(300n)柱上通過(guò)RP-HPLC色譜進(jìn)一步分離合適的抗原級(jí)分。將蛋白質(zhì)峰通過(guò)真空離心干燥、重新懸浮于TBS中并通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)定定量。ELISA確定的自身抗體反應(yīng)性。為了確定源自患者的自身抗體對(duì)源自腫瘤的外來(lái)體的反應(yīng)性的水平，進(jìn)行了ELISA測(cè)定。將從每個(gè)免疫吸附制品分離的蛋白質(zhì)以1:25稀釋于由100mM碳酸鈉和0.5MNaCl組成的偶聯(lián)緩沖液(pH8.3)中。將等分試樣(2jig/孔)添加至96-孔IMMULON4TM微量滴定板(Chantilly，VA)的孔中，并在37。C孵育過(guò)夜。將所述板以5%脫脂奶粉的PBS液封閉1小時(shí)，隨后以PBS加0.2。/oTweeii-20和5。/o脫脂奶粉洗滌3次。然后，將所述板與來(lái)自患者和正常對(duì)照的以1/100稀釋的200jil血清在4。C孵育過(guò)夜。將所述板洗滌并與過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體(1/5000稀釋)醉育1小時(shí)。在洗滌后，通過(guò)以下方式測(cè)量存在的結(jié)合抗體將所述孔與含鄰苯二胺二鹽酸鹽(0.4mg/ml)(OPD，SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)的50mM檸檬酸鹽緩沖液孵育，在490nm測(cè)量吸光度。實(shí)施例7的結(jié)果使用免疫吸附純化的抗原，構(gòu)建了用于每個(gè)測(cè)定的微量滴定板。將以1:100稀釋的來(lái)自正常女性對(duì)照(n=10)、患良性卵巢疾病的女性(n=10)和患卵巢癌的女性(1-1￥期各11=10)的血清在4。C下與平行雙孔孵育過(guò)夜。將所述孔以TBS洗滌3次，然后與過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體孵育。在490nm測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。確定每個(gè)患者的平均吸光度并對(duì)其作圖。正常對(duì)照和患良性疾病的女性的免疫反應(yīng)性都處于基線(xiàn)水平，并被認(rèn)為相對(duì)于所有測(cè)試抗原是陰性的(圖11)。圖ll中曲線(xiàn)上的每個(gè)點(diǎn)均代表每個(gè)患者的平均值。在所有病例中，整個(gè)組的平均值與對(duì)照和良性病例是有統(tǒng)計(jì)差異的。為了評(píng)估本申請(qǐng)公開(kāi)的方法作為一般性癌癥診斷的方法的可用性，重復(fù)進(jìn)行這一研究，所不同的是使用來(lái)自患晚期胰腺癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌的女性的血清。所有受測(cè)癌癥患者似乎都生成識(shí)別核磷蛋白、組織蛋白酶D(cathepsinD)、p53和SSX抗原的自身抗體。僅患卵巢癌的女性識(shí)別胎盤(pán)型堿性磷酸酶(PLAP)。患有肺癌和結(jié)腸癌的患者更強(qiáng)地識(shí)別生存素(圖12)。實(shí)施例8對(duì)重組蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)上的抗原表位進(jìn)行確定通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將一份(20jig)每種特異性天然抗原及其重組對(duì)應(yīng)物分離。在電泳后，通過(guò)考馬斯藍(lán)染色法顯示條帶并將每個(gè)條帶切下。以SDS電泳緩沖液平衡凝膠。將包含所述特定蛋白質(zhì)的凝膠塊應(yīng)用至20%丙烯酰胺凝膠的孔中。將所述凝膠塊切成更小的小塊，并插入至SDS-PAGE濃縮膠的樣品孔中。將100jU電極溶液加入至干的凝膠塊上。在孵育1h后，將含溶于去離子水的10jil金黃色葡萄球菌(Aa/7卸/ococc附fl""ws)V8蛋白酶(Pierce，Rockford，IL，USA)(0.1ug/mL)的20fil稀釋的SDS樣品緩沖液加于所述樣品溶液上。進(jìn)行電泳至所述樣品和蛋白酶在上層凝膠中堆積，中斷1h以消化所述蛋白質(zhì)。然后繼續(xù)電泳，并將所分離的消化物電印跡于PVDF膜上。然后，將所述膜與1:100稀釋的患者血清孵育過(guò)夜。在以TBS洗滌3次后，將所述膜與作為二抗的過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體孵育1小時(shí)。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光顯示所結(jié)合的免疫復(fù)合體(ECL，AmershamLifeSciences,ArlingtonHeights,IL)。對(duì)于p53,患者l和3都識(shí)別所述源自肺瘤的蛋白質(zhì)中的一條中間肽條帶，所述肽條帶不出現(xiàn)于所述重組蛋白質(zhì)的肽中(圖13)。對(duì)于GRP78，所有患者都識(shí)別所述源自腫瘤的蛋白質(zhì)中的3-5條另外的肽條帶，所述肽條帶不出現(xiàn)于所述重組蛋白質(zhì)的肽中(圖13)。對(duì)于核磷蛋白，所有患者都呈現(xiàn)出與所述源自肺瘤的蛋白質(zhì)的反應(yīng)性強(qiáng)于與所述重組體蛋白質(zhì)的反應(yīng)性(圖13)。患者2識(shí)別所述源自肺瘤的核磷蛋白中的3條另外的條帶，患者3識(shí)別與所述重組蛋白質(zhì)相比分子量更低的l條條帶。這些結(jié)果表明，這些源自外來(lái)體的天然腫瘤來(lái)源的蛋白質(zhì)與重組蛋白質(zhì)相比呈現(xiàn)了另外的抗原表位。43實(shí)施例9對(duì)不孕障礙的診斷測(cè)定為了定量測(cè)定源自不孕障礙患者的自身抗體的免疫反應(yīng)性水平，通過(guò)ELISA定量測(cè)定了患子宮內(nèi)膜異位癥的患者血清中的IgG的存在及其對(duì)源自子宮內(nèi)膜、核和胞質(zhì)溶膠的細(xì)胞抗原的反應(yīng)性。將從每種亞細(xì)胞級(jí)分分離的蛋白質(zhì)以1:25稀釋于由100mM碳酸鈉和0.5MNaCl組成的偶聯(lián)緩沖液(pH8.3)中。將等分試樣添加至96-孔IMMULON4TM微量滴定板(Chantilly，VA)的孔中，并在37'C孵育過(guò)夜。將所述板以5%脫脂奶粉的PBS液封閉1小時(shí)，隨后以PBS加0.2。/。Tween-20和5。/。脫脂奶粉洗滌3次。然后，將所述板與來(lái)自患者和正常對(duì)照的以1/100稀釋的200jil血清在4。C孵育過(guò)夜。將所述板洗滌并與過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體(1/5000稀釋)孵育1小時(shí)。在洗滌后，通過(guò)以下方式測(cè)量結(jié)合抗體的存在將所述孔與含鄰苯二胺二鹽酸鹽(0.4mg/ml)(OPD，SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)的50mM檸檬酸鹽緩沖液孵育，并在490nm測(cè)量吸光度。血清樣品獲自年齡在21-34歲并且被診斷為不孕的女性，所述不孕由子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢功能早衰(POF)和反復(fù)妊娠丟失引起。對(duì)照受試者為年齡匹配的無(wú)痛癥狀、無(wú)骨盆異常且以前無(wú)骨盆手術(shù)的女性。依照修訂的美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(rASRM)分類(lèi)確定子宮內(nèi)膜異位癥的階段。樣品獲自格里維爾健康系統(tǒng)(GreenvilleHealthSystem)和路易斯維爾大學(xué)(UniversityofLouisville)的生殖內(nèi)分泌學(xué)和不孕癥系(DivisionsofReproductiveEndocrinologyandInfertility)。25個(gè)標(biāo)本獲自對(duì)照、25個(gè)均來(lái)自II期子宮內(nèi)膜異位癥和m期子宮內(nèi)膜異位癥的女性患者、18個(gè)經(jīng)歷反復(fù)妊娠丟失的患者以及11個(gè)患卵巢功能早衰的患者。樣品的收集經(jīng)GHS和路易斯維爾大學(xué)的人類(lèi)研究委員會(huì)(HumanStudiesCommittee)的知情同意審查。將靜脈血樣品收集至肝素化的管中并在凝固后分離血清。將血清保存于-70'C至使用。雖然有變化，但是所有具有不孕障礙的測(cè)試患者與正常對(duì)照患者相比都表現(xiàn)出了顯著的自身抗體水平(p<0.0001)。由于患者呈現(xiàn)出提高的自身抗體水平，且這些自身抗體的水平呈現(xiàn)出顯著的變化性，所以在這些IgG的相對(duì)吸光度和疾病的階段之間進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。反應(yīng)性IgG的水平隨疾病的階段出現(xiàn)升高，來(lái)自ii期患者的血清呈現(xiàn)出顯著高于正常血清(p<0.001)(圖14)。對(duì)于所有來(lái)源的抗原，在m期中存在的免疫反應(yīng)性水平顯著高于在n期患者的血清中檢測(cè)的水平(p<0.01)。為了表征這些自身抗體與來(lái)自子宮內(nèi)膜的抗原的反應(yīng)性，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡進(jìn)一步分析了來(lái)自正常對(duì)照和患子宮內(nèi)膜異位癥(n期和m期)的女性的血清樣品。所述患者組的代表性免疫印跡顯示于圖15中。對(duì)照患者(無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥)對(duì)任何細(xì)胞抗原均未表現(xiàn)出顯著的識(shí)別?；糿期子宮內(nèi)膜異位癥的患者與來(lái)自子宮內(nèi)膜和卵巢的細(xì)胞抗原都呈現(xiàn)出強(qiáng)反應(yīng)性。在這些組織中，最強(qiáng)的反應(yīng)出現(xiàn)于來(lái)自子宮內(nèi)膜的膜級(jí)分的抗原，接下來(lái)是來(lái)自卵巢的膜抗原。來(lái)自患ni期子宮內(nèi)膜異位癥的患者的血清呈現(xiàn)出類(lèi)似的反應(yīng)性模式；然而，與所有來(lái)源的膜抗原呈現(xiàn)出更大的強(qiáng)度。在子宮內(nèi)膜膜抗原中，所有患子宮內(nèi)膜異位癥的患者均識(shí)別80和140kD的蛋白質(zhì)，而患m期疾病的患者識(shí)別另外的IO、28和40kD的條帶。共同識(shí)別的140kD膜蛋白質(zhì)為卵巢膜抗原所共有。通常，患子宮內(nèi)膜異位癥的患者還呈現(xiàn)出強(qiáng)的對(duì)90和iookD蛋白質(zhì)的共同識(shí)別，而患ni期疾病的患者還識(shí)別另外的50和78kD的條帶。與源自胞質(zhì)溶膠的抗原幾乎沒(méi)有出現(xiàn)反應(yīng)性。由于所述反應(yīng)性的強(qiáng)度，通過(guò)以二維電泳分離子宮內(nèi)膜膜抗原進(jìn)一步分析了所述抗體結(jié)合(圖16A和16B)。該方法使得膜抗原被進(jìn)一步分離。與ii期相比，在m期子宮內(nèi)膜異位癥患者中出現(xiàn)的反應(yīng)性水平升高似乎是由于升高的與相同組分的反應(yīng)性和對(duì)另外的組分的識(shí)別兩者所致。基于該研究的結(jié)果，針對(duì)特定細(xì)胞蛋白質(zhì)的子宮內(nèi)膜自身抗體及/或?qū)k激活的抑制的評(píng)估可作為子宮內(nèi)膜異位癥的診斷指示物。與特定子宮內(nèi)膜膜抗原存在反應(yīng)的自身抗體的存在似乎是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生所特有的，并且與疾病的階段有關(guān)。單獨(dú)對(duì)nk激活進(jìn)行評(píng)估對(duì)于診斷標(biāo)記物的使用可能不具有特異性，但可與自身抗體的存在相結(jié)合；它們可為子宮內(nèi)膜異位癥的確診提供掙異性和敏感性。為了評(píng)估該方法對(duì)不孕癥病因的區(qū)分，所述蛋白質(zhì)陣列模板由4x8cm的總尺寸上的34個(gè)斑點(diǎn)組成，寬度上4個(gè)斑點(diǎn)及長(zhǎng)度上80個(gè)斑點(diǎn)。該模板被用作標(biāo)桿，以將溶液點(diǎn)于MAGNAGRAPH膜(MSI)上。為了將捕獲的蛋白質(zhì)點(diǎn)至所述膜上，將所述模板至于光盒上，并將MAGNAGRAPH膜置于所述模板之上。外來(lái)體分離自Hec-1A子宮內(nèi)膜細(xì)胞的培養(yǎng)物。將所分離的外來(lái)體溶解，然后使用0.25%SSA沉淀。然后，將所沉淀的外來(lái)體蛋白質(zhì)重新懸浮于TBS中，并進(jìn)行聲處理。然后以如下方式將該蛋白質(zhì)溶液分級(jí)分離使用C18反相HPLC柱，以0-100%的乙腈梯度洗脫。將所產(chǎn)生的32個(gè)蛋白質(zhì)峰濃縮，并通過(guò)真空離心去除溶劑。將每種蛋白質(zhì)重新懸浮于TBS中，并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將每種蛋白質(zhì)溶液(0.25nl)手工上樣至單斑點(diǎn)上。將每種蛋白質(zhì)溶液在溴酚藍(lán)(用于示蹤)中稀釋成100網(wǎng)/ml的初始濃度。對(duì)于每種蛋白質(zhì)，制備2ng的斑點(diǎn)。以5。/。BSA的0.1MTris-HCl(pH7.6)、0.15MNaCl溶液(TBS)將所述膜在室溫下封閉1小時(shí)。然后將膜以TBS加0.1%Tween-20洗滌3次，并以TBS洗滌2次。然后將所述膜保存于封口袋中并冷凍至使用。對(duì)于診斷測(cè)試，以血清進(jìn)行測(cè)定。使用本申請(qǐng)公開(kāi)的蛋白質(zhì)陣列測(cè)試了來(lái)自已知患者和有正常生育能力的非妊娠對(duì)照的稀釋血清(1:100)，以確定最佳的血清稀釋度，與靶蛋白質(zhì)的稀釋液結(jié)合，以鑒定具有特定病因?qū)W的不孕癥的患者。在使用所述陣列膜之前將其以TBS-Tween-20洗滌，并且在TBS中制備10倍連續(xù)稀釋的患者血清。將所稀釋的血清在4。C與膜孵育過(guò)夜。以TBS加0.1%Tween-20洗滌所述膜3次。然后將膜與過(guò)氧化物酶綴合的人IgG的抗體孵育，以TBS洗滌3次，并通過(guò)ECL顯像。將所形成的膜以柯達(dá)D290相機(jī)成像，并使用用于斑點(diǎn)識(shí)別和定量的柯達(dá)分析軟件分析(圖17)。出現(xiàn)了不同的免疫反應(yīng)性模式?；谶@種對(duì)子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)抗原的差異識(shí)別，可區(qū)分并診斷子宮內(nèi)膜異位癥引起的不孕障礙的患者與卵巢功能早衰引起的不孕障礙的患者。以類(lèi)似的方法，使用蛋白質(zhì)免疫印跡，還對(duì)經(jīng)歷反復(fù)妊娠丟失的女性檢查了抗胎盤(pán)來(lái)源抗原的自身抗體的存在情況(圖18)。妊娠可引起自身抗體的產(chǎn)生，這來(lái)自于從Thl至Th2免疫應(yīng)答的正常偏移。然而，經(jīng)歷反復(fù)妊娠丟失的女性同時(shí)呈現(xiàn)出增加的總體免疫反應(yīng)性和對(duì)特有組分的識(shí)別。以后經(jīng)歷反復(fù)妊娠丟失的無(wú)癥狀患者可識(shí)別分子量小于45,000道爾頓且大于130,000道爾頓的另外的蛋抗原。參考文獻(xiàn)Abu-Shakraetal.，Cancerandautoimmunity:autoimmuneandrheumaticfeaturesinpatientswithmalignancies.AnnalsRheumDis60:433-440,2001.Barboucheetal.，Prognosticsignificanceofautoantibodiestolamininintheseraofbreastcancerpatients.EuropJClinChemClinBiochem32:5"-514'1994.Brichoryetal.'Proteomics-basedidentificationofproteingeneproduct9.5asatumorantigenthatinducesahumoralimmuneresponseinlungcancer.CancerRes61:7908-7912,2001.serologicalresponse:Biologicalsignificanceandclinicalimplications.AnnalsOncol7:227-232，1996.Chinnietal.,CathepsinDandglucose-regulatedprotein78recognizedbythehumoralresponseofovariancancerpatients.ClinCancerRes3:1557-1564，1997.Conroyetal.'Autoantibodiesto90kDheat-shockproteininseraofbreastcancerpatients.Lancet345:126，1995.Hellstrometal.，Principlesoftumorimmunity:Tumorantigens.In:DeVitaVT，HellmanS，andRosenbergSA，eds.Biologictherapyofcancer.NewYork:Uppincott，1991:35-52.JungandSchluesener,JExpMed173:273-276，1991.KoteraYetal"Humoralimmunityagainstatandemrepeatepitopeofhumanmucinmuc-1inserafrombreast,pancreaticandcoloncancerpatients.Kuttehetal.，Immunologiccharacterizationoftumormarkersinhumanovariancancerce卄lines.JSocGynecolInvest3:216-222，1996.Labrecqueetal"Analysisoftheanti國(guó)p53antibodyresponseincancerpatients.CancerRes53:3468-3471，1993.Liottaetal.,Proteomicpatternsinseraserveasbiomarkersofovariancancer.GynecolOncol88:S25-S28,2003.Lubinetal.，Analysisofp53antibodiesinpatientswithvariouscancersdefineB-cellepitopesofhumanp53:Distributiononprimarystructureandexposureonproteinsurface.CancerRes53:5872-5876，1993.Merimskyetal.,Antigensandantibodiesinmalignantmelanoma.TumourBiol15:188-202，1994.Nakamuraetal.HandbookofExperimentalImmunology(4thEd.)，Weiretal.(eds).Vol.1，Chapter27，BlackwellScientificPubl"Oxford,1987.Niklinskaetal"Strongassociationbetweenp53proteinaccumulation,serumantibodies,andgenemutationinnon-smallcelllungcancer.FoliaHistochemCytobiol39:51-56,2001.Oldl_J,ChenYT:Newpathsinhumancancerserology.JExpMed187:1163-1167，1998.Peoplesetal"BreastandovariancancerspecificcytotoxicTlymphocytesrecognizethesameHER2/neU"derivedpeptide.ProcNatlAmerSciUSA92:432-436,1995.TaylorandDoellgast,Quantitationofperoxidase國(guó)antibodybindingtomembranefragmentsusingcolumnchromatography.AnalyticalBiochemistry,98:53-59'1979.Tayloretal.，Identificationofantigeniccomponentsrecognizedby"membranebound"antibodiesfromovariancancerpatients.AmJR印rodImmunol6:179-184,1984.美國(guó)專(zhuān)利3,817,837。美國(guó)專(zhuān)利3,850,752。美國(guó)專(zhuān)利3,939,350。美國(guó)專(zhuān)利3，996，345。美國(guó)專(zhuān)利4,275,149。美國(guó)專(zhuān)利4,277,437。美國(guó)專(zhuān)利4,302,534。美國(guó)專(zhuān)利4，366，241。美國(guó)專(zhuān)利4,637,988。美國(guó)專(zhuān)利4,786,594。美國(guó)專(zhuān)利5,108,896。美國(guó)專(zhuān)利5，229，302。美國(guó)專(zhuān)利5,629,164。美國(guó)專(zhuān)利5,691,154。Vlocketal,Incidenceofserumantibodyreactivitytoautologousheadandneckcancercelllinesandaugmentationofantibodyreactivityfollowingaciddissociationandultrafiltration.CancerRes49:1361-1365，1989.Vogletal.,Autoimmunityagainstp53predictsinvasivecancerwithpoorsurvivalinpatientswithovarianmass.BritJCancer83:1338-1343，2000.Winteretal"Developmentofantibodiesagainstp53inlungcancerpatientsappearstobedependentonthetypeofp53mutation.CancerRes52:4168-4174,1992Yamamotoetal.,Infrequentpresenceofanti國(guó)c-mycantibodiesandabsenceofc-myconcoproteininserafromlungcancerpatients.Oncology56:129-133，1999.應(yīng)理解，只要不偏離本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的范圍，可以改變本申請(qǐng)公開(kāi)的主題的各細(xì)節(jié)。并且，前文的描述僅是為了說(shuō)明的目的，而不是為了進(jìn)行限制。權(quán)利要求1.一種用于診斷受試者中的一種與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙的方法，包括(a)提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的生物樣品；(b)將一種抗原與所述樣品相接觸，其中所述抗原包括一種分離自一種外來(lái)體的自身抗體免疫反應(yīng)肽；(c)檢測(cè)所述樣品中對(duì)所述抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的自身抗體；以及(d)將自身抗體對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平與一個(gè)參考水平比較，以診斷所述受試者中的所述障礙。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述障礙為一種癌癥或一種不孕障礙。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述障礙為一種上皮癌或一種腺癌。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗原包括選自以下的癌抗原肽腫瘤抑制家族的肽、核酸結(jié)合肽、抗凋亡肽、癌基因家族的肽、同源框肽、癌睪丸抗原肽、熱休克蛋白家族的肽、前溶酶體酶家族的酶前體的肽、PLAP、粘附分子家族的肽、粘附相關(guān)的肽和激酶家族的肽。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述障礙為一種選自以下的不孕障礙卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢綜合征(PCOS)、子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、嚢內(nèi)液、胸膜液、淚液、尿液、唾液、組織或它們的結(jié)合物。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述受試者為一種哺乳動(dòng)物。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述外來(lái)體分離自一種細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述細(xì)胞為一種培養(yǎng)的細(xì)胞。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞為一種癌細(xì)胞。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述癌細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞或絨毛膜癌細(xì)胞。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞為UL-1細(xì)胞、UL-2細(xì)胞、UL-3細(xì)胞或UL-6細(xì)胞。13.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞為一種胎盤(pán)細(xì)胞。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測(cè)包括一種選自以下的技術(shù)ELISA、RIA、多重免疫測(cè)定、免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡法。15.—種用于表征受試者中的一種與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙的方法，包括(a)提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含自身抗體的生物樣品；(b)將一種抗原與所述樣品相接觸，其中所述抗原包括一種分離自一種外來(lái)體的自身抗體免疫反應(yīng)肽；(c)檢測(cè)所述樣品中對(duì)所述抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的自身抗體；以及(d)對(duì)所述自身抗體對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平定量，從而表征所述受試者中的所述障礙。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述障礙為一種癌癥或一種不孕障礙。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述障礙為一種上皮癌或一種腺癌。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗原包括選自以下的癌抗原肽腫瘤抑制家族的肽、核酸結(jié)合肽、抗凋亡肽、癌基因家族的肽、同源框肽、癌睪丸抗原肽、熱休克蛋白家族的肽、前溶酶體酶家族的酶前體的肽、PLAP、粘附分子家族的肽、粘附相關(guān)的肽和激酶家族的肽。19.權(quán)利要求16的方法，其中所述障礙為一種選自以下的不孕障礙卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢綜合征(PCOS)、子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失。20.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、嚢內(nèi)液、胸膜液、淚液、尿液、唾液、組織或它們的結(jié)合物。21.權(quán)利要求15的方法，其中所述受試者為一種哺乳動(dòng)物。22.權(quán)利要求15的方法，其中所述外來(lái)體分離自一種細(xì)胞。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞為一種培養(yǎng)的細(xì)胞。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述細(xì)胞為一種癌細(xì)胞。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述癌細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞或絨毛膜癌細(xì)胞。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞為UL-1細(xì)胞、UL-2細(xì)胞、UL-3細(xì)胞或UL-6細(xì)胞。27.權(quán)利要求23的方法，其中所述細(xì)胞為一種胎盤(pán)細(xì)胞。28.權(quán)利要求15的方法，其中所述檢測(cè)包括一種選自以下的技術(shù)ELISA、RIA、多重免疫測(cè)定、免疫沉淀法和免疫印跡法。29.權(quán)利要求16的方法，其中所述障礙為一種癌癥并且表征所述障礙包括確定所述癌癥的階段。30.—種用于檢測(cè)受試者中的自身抗體水平并且/或者對(duì)該水平定量的方法，包括(a)提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含或疑似包含自身抗體的生物樣品；(b)將一種抗原與所述樣品相接觸，其中所述抗原包括一種分離自一種外來(lái)體的自身抗體免疫反應(yīng)肽；以及(c)檢測(cè)所述樣品中對(duì)所述抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的所述自身抗體的水平并且/或者對(duì)該水平定量。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述自身抗體與一種癌癥或不孕障礙有關(guān)。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述癌癥為一種上皮癌或一種腺癌。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗原包括選自以下的癌抗原肽腫瘤抑制家族的肽、核酸結(jié)合肽、抗凋亡肽、癌基因家族的肽、同源框肽、癌睪丸抗原肽、熱休克蛋白家族的肽、前溶酶體酶家族的酶前體的肽、PLAP、粘附分子家族的肽、粘附相關(guān)的肽和激酶家族的肽。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述不孕障礙選自卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢綜合征(PCOS)、子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失。35.權(quán)利要求30的方法，其中所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、嚢內(nèi)液、胸膜液、淚液、尿液、唾液、組織或它們的結(jié)合物。36.權(quán)利要求30的方法，其中所述受試者為一種哺乳動(dòng)物。37.權(quán)利要求30的方法，其中所述外來(lái)體分離自一種細(xì)胞。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述細(xì)胞為一種培養(yǎng)的細(xì)胞。39.權(quán)利要求38的方法，其中所迷細(xì)胞為一種癌細(xì)胞，40.權(quán)利要求39的方法，其中所述癌細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞或絨毛膜癌細(xì)胞。41.權(quán)利要求39的方法，其中所述細(xì)胞為UL-1細(xì)胞、UL-2細(xì)胞、UL-3細(xì)胞或UL-6細(xì)胞。42.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)胞為一種胎盤(pán)細(xì)胞。43.權(quán)利要求30的方法，其中所述檢測(cè)包括一種選自以下的技術(shù)ELISA、RIA、多重免疫測(cè)定、免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡法。44.一種用于檢測(cè)一個(gè)樣品中的自身抗體的試劑盒，包含一種自身抗體免疫反應(yīng)肽抗原及一個(gè)用于容納所述抗原的容器，其中所述抗原分離自一種外來(lái)體。45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述抗原附著于一種支持物上。46.權(quán)利要求45的試劑盒，其中所述支持物為微量滴定板、膜、聚苯乙烯珠子、試管或浸漬片。47.權(quán)利要求44的試劑盒，包含一種與一種自身抗體結(jié)合的抗體制口48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述抗體制品包含一種可檢測(cè)的標(biāo)記。49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記包括放射性標(biāo)記、酶、生物素、染料、熒光標(biāo)簽標(biāo)記、半抗原或發(fā)光標(biāo)記。50.—種用于診斷受試者中的一種不孕障礙的方法，包括(a)提供一個(gè)來(lái)自受試者的包含或疑似包含與一種不孕障礙有關(guān)的自身抗體的生物樣品；(b)將至少一種抗原與所述樣品相接觸，其中所述抗原包括一種肽抗原，所述肽抗原可結(jié)合與所述不孕障礙相關(guān)的自身抗體，并且選自分子量約50kD和80kD的核抗原以及分子量約10kD、30kD、45kD、90kD和125kD的膜抗原；(c)檢測(cè)所述樣品中對(duì)所述抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的自身抗體；以及(d)將自身抗體對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)性水平與一個(gè)參考水平比較，以診斷所述受試者的所述不孕障礙以及/或者預(yù)測(cè)形成所述不孕障礙的風(fēng)險(xiǎn)。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述不孕障礙選自卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢綜合征(PCOS)、子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失。52.權(quán)利要求50的方法，其中所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、嚢內(nèi)液、胸膜液、淚液、尿液、唾液、組織或它們的結(jié)合物。53.權(quán)利要求50的方法，其中所述自身抗體對(duì)卵巢、子宮內(nèi)膜、胎盤(pán)或它們的結(jié)合有反應(yīng)性。54.權(quán)利要求50的方法，其中所述受試者為一種哺乳動(dòng)物。55.權(quán)利要求50的方法，其中所述抗原分離自一種培養(yǎng)的細(xì)胞。56.權(quán)利要求55的方法，其中所述培養(yǎng)的細(xì)胞為一種胎盤(pán)細(xì)胞。57.權(quán)利要求50的方法，其中所述抗原分離自胎盤(pán)、卵巢、子宮內(nèi)膜或它們的結(jié)合。58.權(quán)利要求50的方法，其中所述檢測(cè)包括一種選自以下的技術(shù)ELISA、RIA、多重免疫測(cè)定、免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡法。全文摘要提供了用于檢測(cè)受試者中的自身抗體水平并且/或者對(duì)該水平進(jìn)行定量的方法。進(jìn)一步提供了用于診斷和/或表征一種與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的障礙的方法。在一些實(shí)施方案中，所診斷和/或表征的障礙可以是一種癌癥或一種不孕癥。文檔編號(hào)G01N31/00GK101657719SQ200880009096公開(kāi)日2010年2月24日申請(qǐng)日期2008年1月28日優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日發(fā)明者C·格塞歐-泰勒,D·D·泰勒申請(qǐng)人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)公司