專利名稱：一種基于分子伴侶添加技術(shù)的elisa檢測試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別是涉及以分子伴侶作為添加劑提高ELISA檢測試劑盒質(zhì)量的方法。
背景技術(shù)：
蛋白表達(dá)過程中，許多蛋白質(zhì)不能按正確的方式折疊。錯誤折疊的蛋白質(zhì)經(jīng)常將含碳豐富的氨基酸暴露在表面，而不是被包裹在內(nèi)。這些含碳豐富的基團(tuán)會跟其它蛋白質(zhì)中的類似基團(tuán)緊密結(jié)合，構(gòu)成大分子聚合物。這些聚合物本身失去自身生物學(xué)活性，并可使周圍蛋白聚集沉淀，在細(xì)胞內(nèi)存在時往往是致死的。
分子伴侶是一種引導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊的蛋白質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)折疊時，它們能保護(hù)蛋白質(zhì)分子免受其它蛋白質(zhì)的干擾。很多分子伴侶屬于熱休克蛋白，它們在細(xì)胞受熱時大量合成。熱激可導(dǎo)致多數(shù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，增加錯誤折疊的幾率，因此在受到熱刺激時，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)需要更多熱休克蛋白的幫助。
HSP60是一種典型的分子伴侶，它可以為正在折疊的蛋白質(zhì)提供一個附著環(huán)境，從而起到保護(hù)折疊過程的作用。未折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)入其結(jié)構(gòu)內(nèi)的空穴，便可以在其中完成折疊。
模擬體內(nèi)環(huán)境，在ELISA試劑盒實際生產(chǎn)中，試劑盒的成分里面，抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)物等均為蛋白成分，在運輸過程以及分裝使用過程中，由于蛋白濃度比較低，反應(yīng)條件及溫度環(huán)境等外界因素不穩(wěn)定，這些蛋白質(zhì)很容易受到影響而變性失活。而添加分子伴侶之后，蛋白將受到分子伴侶蛋白的保護(hù)，并且給部分變性蛋白提供一個復(fù)性的環(huán)境，從而間接的優(yōu)化試劑盒的保質(zhì)期，穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性等方面的品質(zhì)。
NGAL蛋白是1993年在中性粒細(xì)胞內(nèi)首先被發(fā)現(xiàn)的，與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程相關(guān)。近年來國內(nèi)外的研究表明，NGAL蛋白在多種疾病發(fā)病過程中具有特異性表達(dá)變化的特點，使得NGAL成為檢測疾病的生物標(biāo)志物。本發(fā)明中依據(jù)NGAL抗原決定簇
4特點，選擇兩個不同位點，表達(dá)抗原，免疫家兔獲得抗體，開發(fā)出特異性針對
于NGAL蛋白的抗體對。并通過質(zhì)量控制，投入研發(fā)試驗，為雙抗體夾心法、竟?fàn)嶦LISA法及其他利用抗體檢測樣本中NGAL含量的檢測方法提供基礎(chǔ)。
本發(fā)明中，使用HSP60蛋白作為NGAL的ELISA試劑盒蛋白組分添加劑，檢測并驗證HSP60對于該試劑盒的有效作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過添加分子伴侶蛋白的方法提高NGAL ELISA試劑盒的性能。
所述分子伴侶是HSP60。
本發(fā)明的另 一 目的是提供添加分子伴侶的ELISA檢測試劑盒，及分子伴侶表達(dá)、分離和純化的方法。
所述分子伴侶獲得依照如下進(jìn)行將HSP60編碼基因插入表達(dá)載體PET28a，得到PET28a-HSP60。
所述表達(dá)是將質(zhì)粒HIS-HSP60在大腸桿菌中表達(dá)和培養(yǎng)。
所述分離是指將大腸桿菌破碎，然后離心或過濾分離出融和蛋白。破碎可釆用電動搗碎機(jī)、或勻漿機(jī)破碎、或用超聲波處理破碎，也可以用溶菌酶處理。
所述純化是用本領(lǐng)域內(nèi)常用的層析法或電泳法進(jìn)行，優(yōu)選凝膠層析法進(jìn)行。
具體的說上述步驟如下進(jìn)行
1 ) PCR擴(kuò)增表達(dá)HSP60的基因片段，兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點，酶切消化后插入NdeI和XhoI消化后的Pet28a,得到質(zhì)粒PET28a-HSP60;
2 ) HIS-HSP60在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接種至3ml含有100路/ml kana的LB緩沖液，37°C，過夜，220rpm;將過夜培養(yǎng)物l: 100稀釋至lL含有100嗎/mlkana的LB緩沖液，37°C, 220rpm,培養(yǎng)5h;加入終濃度為O.lmM的IPTG, 22°C，180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g, 15min, 4'C離心收菌；菌體用50mM Tris-cl,200mM NaCl pH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT, 0.5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm, 20min離心3次；
3 )將上清液使用GE healthcare的chelating sepHarose Fast Flow柱料純化，得到純化融合蛋白。4)凝血酶酶切HIS標(biāo)簽，Ni柱純化，得到除去標(biāo)簽的HSP60蛋白。
實驗證明，純化后HSP60可溶性極高，20mg/mlHSP60在50mMTris， 500mMNaCl中保存，于(C幾個月內(nèi)未見明顯沉淀未有降解、FPLC表明HSP60為單體，一年內(nèi)未有聚合物出現(xiàn)。
本發(fā)明提供的利用PET28a系統(tǒng)融合表達(dá)、再經(jīng)酶切處理去掉標(biāo)簽制得的HSP60蛋白，可以在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)量與前人的結(jié)果類似，相對于真核表達(dá)，原核表達(dá)制備工程化抗體技術(shù)相對簡單，成本更低；
所述分子伴侶添加方法為，HSP60與蛋白組分為1:1混合。分別與未添加HSP60的ELISA試劑盒比較穩(wěn)定性、保質(zhì)期。


圖l:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中使用的蛋白表達(dá)載體PET28a的載體圖譜。圖2:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中HIS-HSP60融合蛋白小量表達(dá)蛋白電泳圖片。圖中1、未加IPTG誘導(dǎo)的菌株；2、 3、分別為加IPTG誘導(dǎo)的兩株菌株；4、
蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上至下分子量標(biāo)準(zhǔn)為115kDa、 66kDa、 45kDa、 35kDa、 25kDa、
18.4kDa、 14.4kDa。
圖3:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化后的HSP60蛋白電泳圖片。
圖中l(wèi)和2、純化后的HSP60蛋白；3、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上至下分子量
標(biāo)準(zhǔn)為115kDa、 6kDa、 45kDa、 35kDa、 25kDa、 18.4kDa、 14.4kDa。
圖4:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化后HSP60蛋白Superdex200凝膠過濾層析
洗脫曲線。
圖中最高的峰為純化后HSP60蛋白的峰。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例l HSP60的制備
HSP60蛋白廣泛存在于多種生物體中，其編碼基因一般可以通過RT-PCR從生物體cDNA中獲得。本發(fā)明中，以質(zhì)粒PCDNA3.1-HSP60為模板擴(kuò)增得到。1. 克隆PET28a-HSP60:
選擇表達(dá)載體PET28a為克隆載體(見圖l)，根據(jù)其多克隆位點及HSP60序列特點，設(shè)計兩端引物PCR擴(kuò)增表達(dá)HSP60的基因片段，兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點，酶切消化后插入Ndel和XhoI消化后的Pet28a,得到質(zhì)粒PET28a-HSP60;
2. 表達(dá)純化PET28a-HSP60:
將質(zhì)粒HIS-HSP60在大腸桿菌Rossetta中表達(dá)。首先通過小量表達(dá)鑒定，誘導(dǎo)株與未誘導(dǎo)株相比，在60KD左右處有明顯特異條帶(見圖2)。大量培養(yǎng)后，通過SDS-PAGE分析上清沉淀，結(jié)果顯示，該蛋白在上清中存在。利用其所帶His標(biāo)簽，通過IMAC的方法，可獲得純度為99%以上的目的蛋白(見圖3)。
HIS-HSP60在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接種至3ml含有100pg/ml kana的LB緩沖液，37°C,過夜，220rpm;將過夜培養(yǎng)物1: 100稀釋至1L含有100嗎/ml kana的LB緩沖液，37。C,220rpm，培養(yǎng)5h;加入終濃度為0.1mM的IPTG， 22°C ， 180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g, 15min, 4t:離心收菌；菌體用50mMTris-Cl, 200mMNaClpH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT, 0.5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm， 20min離心3次；上清使用GE healthcare的chelating s印Harose Fast Flow
柱料純化，步驟參照其廠家提供的說明書。
HIS-HSP60于咪唑濃度為60mM時被洗脫。產(chǎn)量高達(dá)50-100毫克每升培養(yǎng)物。
凝血酶酶切HIS標(biāo)簽，Ni柱純化，得到除去標(biāo)簽的HSP60蛋白。為分析HSP60在溶液中是否均一，將2mgHSP60換至20mMTris-Cl， pH8.0,50mMNaCl的緩沖液中。樣品通過20mM Tris-Cl, pH8.0, 50mMNaCl平衡好的Superdex200柱子。整個操作參考AKTAPurifier提供的手冊。結(jié)果顯示純化好的HSP60于咪哇濃度為60mM時被洗脫。產(chǎn)量高達(dá)50-100亳克每升培養(yǎng)物。
通過Superdex 200柱子時未見明顯的多聚體，主要以 一個均 一 的峰出現(xiàn)(見圖4)。
實施例2 添加與未添加HSP60后NGALELISA試劑盒的性能比較
l.靈敏度比較:配制濃度為0.0002, 0.002, 0.04, 0.10, 0.20, 0.50, 2.00，5.00 i!g/ml的NGAL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別使用4'C放置兩個月的添加HSP60與未添加的
7NGAL ELSIA試劑盒按間接竟?fàn)幮訣LISA法操作，根據(jù)抑制率與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，并計算NGAL樣品的抑制中濃度(IC50)及最低檢測限(ICIO)。
抑制率(％) = ( ODmax — ODmin) — (ODx - ODmin) / (ODmax — ODmin) xlOO(結(jié)果見表5)
式中OD醒為不力口NGAL時的吸光值，ODx為加NGAL時的吸光值，ODmin
為空白對照孔的吸光值。
通過IC-ELISA方法建立了NGAL的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。在0.002 ~ 0.5pg/ml濃度范
圍內(nèi)，以此范圍的濃度對數(shù)與抑制率進(jìn)行回歸分析，得線性回歸方程
I=31.793LogC+96.314 ( r=0.994 )。
添加HSP60組IC50為0.03495 pg/ml, ICIO為0.002 pg/ml。而未添加HSP60組IC50為0.02074ng/ml， IC10為0.004 pg/ml。2.回收率比較
NGAL在血清和尿液中添加回收率實驗健康人血清和尿液中分別添加濃度為0.002、 0.008、 0.04、 0.10、 0.20、 0.50 ng/ml的NGAL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，用上述建立的IC-ELISA法分別分別使用4。C放置兩個月的添加HSP60與未添加的NGALELSIA試劑盒對樣品進(jìn)行分析比較，計算回收率(結(jié)果見表l )。
添加分子伴侶的試劑盒，其回收率明顯比未添加分子伴侶的試劑盒要高。
表la添加HSP60 NGAL ELISA試劑盒檢測NGAL在血清中的回收率
血清中添加濃度檢測濃度回收率
(pg/ml)(jig/ml)(%)
0<0細(xì)20
0.0020.00209104.50
0駕0.00803100.36
0.040.039799.25
0.10.098598.50
0.20.18793.40
0.50.502100.40表lb不添加HSP60 NGAL ELISA試劑盒檢測NGAL在血清中的回收率
血清中添加濃度 檢測濃度 回收率
(pg/ml)_ ( pg/ml)_(%)
5 <0扁2 5~
O還 0.00163 81.50
0.008 0.00603 75.37
0.04 0.0383 95.75
0.10 0.0873 87.30
0.20 0.172 86.00
0.50 0.473 94.60
表lc添加HSP60 NGAL ELISA試劑盒檢測NGAL在尿液中的回收率
尿液中添加濃度 檢測濃度 回收率
(ng/ml)_(pg/ml) (%)
"(5 <0細(xì)2 "5~~
0.002 0.00199 99.50
O細(xì) 0.00792 99.00
0.04 0.0395 98.75
0.10 0.0102 102.00
0.20 0.203 101.50
0.50 0.506 101.20
表Id不添加HSP60 NGAL ELISA試劑盒檢測NGAL在尿液中的回收率
尿液中添加濃度檢測濃度回收率
(fig/ml)(|ag/ml)(%)
0<0扁20
0.0020.0017989.50
O細(xì)0.0074993.625
0.040.037794.25
0.100.083983.90
0.200.18291.00
0.500.47595.00
注1)樣品不經(jīng)過處理直接進(jìn)行測定；2)重復(fù)實驗5次取平均值
9
權(quán)利要求
1、一種分子伴侶添加劑，其特征在于，它是由原核表達(dá)純化的極高可溶性及活性的蛋白。
2、 如權(quán)利要求1所述的分子伴侶添加劑，其特征在于，所述分子伴侶是 HSP60。
3、 如權(quán)利要求l所述的分子伴侶添加劑，其特征在于，它是用于ELISA試 劑盒的添加劑。
4、 分子伴侶添加到NGAL的ELISA試劑盒提高試劑盒質(zhì)量的方法，包括 蛋白克隆，表達(dá)，分離和純化及在NGAL試劑盒中添加使用的方法。
5、 如權(quán)利要求4所述的ELISA試劑盒，其特征在于是針對于定性及定量檢測 各種樣品中NGAL含量的試劑盒。
6、 如權(quán)利要求4所述的ELISA試劑盒，其特征在于其高效特異性檢測NGAL 蛋白的抗原位點。
7、 如權(quán)利要求4所述的ELISA試劑盒，其特征在于其利用抗體對或單個包被 抗體，利用雙抗體夾心法或竟?fàn)幏ǘㄐ院投繖z測樣品中NGAL。
8、 如權(quán)利要求4所述的ELISA試劑盒，其特征在于其所用抗體含有NGAL的多克隆抗體。
9、 如權(quán)利要求l所述的融合蛋白分子伴侶，其特征在于，所述表達(dá)是將質(zhì) 粒PET28A-HSP60在大腸桿菌中表達(dá)和培養(yǎng)。
10、 如權(quán)利要求l所述的融合蛋白分子伴侶，其特征在于，所述分離是指將 大腸桿菌破碎，然后離心或過濾分離出分子伴侶蛋白。
11、 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白分子伴侶，其特征在于，所述破碎可釆 用電動搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎，或用超聲波處理破碎，或用溶菌酶處理。
12、 如權(quán)利要求l所述的融合蛋白分子伴侶，其特征在于，所述純化是用層 析法或電泳法進(jìn)行。
13、 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白分子伴侶，其特征在于，所述分子伴侶 通過以下述步驟制備1) PCR擴(kuò)增表達(dá)HSP60的基因片段，兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點，酶切 消化后插入NdeT和XhoI消化后的Pet28a,得到質(zhì)粒PET28a-HSP60;,2 ) HIS-HSP60在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接種至3ml含有100嗎/ml kana 的LB緩沖液，37°C,過夜，220rpm;將過夜培養(yǎng)物l : 100稀釋至lL含有100嗎/ml kana的LB緩沖液，37°C, 220rpm,培養(yǎng)5h;加入終濃度為O.lmM的IPTG, 22°C, 180rpm,繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g， 15min, 4。C離心收菌；菌體用50mMTris-cl， 200mM NaCl pH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT, 0.5h;用超聲破碎儀超 聲至溶液澄清，12000rpm， 20min離心3次;,3 )將上清液使用GE healthcare的chelating sepH arose Fast Flow柱料純化,得 到純化后的融合蛋白。,4)凝血酶酶切fflS標(biāo)簽，Ni柱純化，得到除去標(biāo)簽的HSP60蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于分子伴侶添加技術(shù)的ELISA檢測試劑盒。該試劑盒是由體外表達(dá)純化后的分子伴侶蛋白添加入NGAL的ELISA步驟中各組分中制備得到的。本發(fā)明提供的分子伴侶蛋白可溶性極好、活性極高，且該ELISA試劑盒質(zhì)量與未添加的試劑盒相比具備檢測穩(wěn)定性好、保質(zhì)期長、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。該分子伴侶的基序來源于人源蛋白，且純化宿主為大腸桿菌，應(yīng)用時沒有交叉反應(yīng)問題，而且該蛋白由于其分子伴侶的特點，大大的降低了抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他會因為某些極端條件而影響活性事件的產(chǎn)生幾率。
文檔編號G01N33/68GK101650369SQ20081023742
公開日2010年2月17日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者華權(quán)高 申請人:武漢華美生物工程有限公司