檢測人HSP90α-2蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人熱休克蛋白90 α -2 (HSP90a -2) 抗原表位肽、用該抗原表位肽制備的HSP90 a -2特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆 抗體、所述抗體在制備人HSP90 a -2體外診斷試劑盒上的應(yīng)用，人HSP90 a -2體外診斷試 劑盒，以及一種用于定量檢測待測物中人HSP90 a -2蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，對腫瘤標志物的研究已經(jīng)引起許多研究者的注意，尋找一種可靠的、非侵 入式的、能反映腫瘤的發(fā)生、增殖分化的腫瘤標志物是眾多研究者的共同心愿。通過對血 液、組織液的研究，目前發(fā)現(xiàn)一些腫瘤標志物可以對腫瘤的發(fā)生、增殖分化進行預(yù)測。其中， 人熱休克蛋白90 a -2 (HSP90 a -2)就是這樣的一種腫瘤標志物。
[0003] 熱休克蛋白90 a-2是熱休克蛋白家族中的重要的蛋白之一，其作為分子伴侶來 參與調(diào)控、維持細胞內(nèi)多種蛋白的構(gòu)象和功能，在調(diào)節(jié)細胞生長、分化和凋亡等方面發(fā)揮重 要的作用。近年發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白90 a-2作為伴侶蛋白對腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變、生長、增殖及 侵襲有著重要的作用。有許多報道證實，人體腫瘤組織中，熱休克蛋白的表達發(fā)生了改變。 在不同部位的腫瘤組織中，熱休克蛋白表達的改變并不一致。目前發(fā)現(xiàn)腫瘤病人血清中的 HSP90 a -2含量與腫瘤的惡性程度，尤其是轉(zhuǎn)移正相關(guān)。因此，HSP90 a -2有希望作為腫瘤 診斷和預(yù)后的標志物。
[0004] 檢測血清中的HSP90 a -2水平的最理想的方法為免疫檢測。因此，尋找合適的具 有免疫原性的HSP90 a -2抗原表位肽、制備特異性的HSP90 a -2抗原及抗體即成了重點。
[0005] 熒光免疫層析方法測血液中的待測物操作簡便、快速，只需10分鐘就能完成樣品 檢測，并且檢測范圍寬，靈敏度好，能夠迅速及時地幫助診斷病情，監(jiān)測預(yù)后。中國專利申 請No. 200910117820. 8公開了一種熒光微球免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測方法； 中國專利申請No. 200910047352. 1公開了一種熒光免疫層析試紙及其制備方法和應(yīng)用。然 而，目前還沒有針對人HSP90 a -2蛋白的熒光免疫層析試紙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于定量檢測待測物中 人HSP90 a -2蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。
[0007] 具體而言，本發(fā)明提供了：
[0008] -種用于定量檢測待測物中人HSP90 a -2蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過 雙抗體夾心法檢測所述人HSP90 a -2蛋白，其中：
[0009] 所述雙抗體夾心法采用標記有熒光微球的第一 HSP90 a -2單克隆抗體作為捕獲 抗體，所述第一 HSP90 a -2單克隆抗體來源于人HSP90 a -2抗原表位肽（1)和（2)中的一 者；并且
[0010] 所述雙抗體夾心法采用第二HSP90 α -2單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二 HSP90 a -2單克隆抗體來源于人HSP90 a -2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者；
[0011] 所述人HSP90 a -2抗原表位肽⑴和⑵分別為：
[0012] (l)Tyr-Glu-Lys-Glu-Ser-Glu-Asp-Lys-Pro-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-G ly-Ser-Asp-Glu ；
[0013] (2) Tyr-Arg-Gly-11 e-Asp-Glu-Asp-Asp-Pr〇-Thr-Ala-Asp-Asp-Thr-Se r_A1a_A1a_Va1-Thr_G1u 〇
[0014] 優(yōu)選地，所述第一 HSP90 a -2單克隆抗體是由第一 HSP90 a -2抗原制備而成的，該 第一 HSP90 a -2抗原是通過使所述人HSP90 a -2抗原表位肽（1)和（2)中的一者與載體蛋 白偶聯(lián)制備而成的；并且
[0015] 所述第二HSP90 a -2單克隆抗體是由第二HSP90 a -2抗原制備而成的，該第二 HSP90 a-2抗原是通過使所述人HSP90 a-2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者與載體蛋白 偶聯(lián)制備而成的。
[0016] 優(yōu)選地，所述突光微球的粒徑為320nm至400nm。
[0017] 優(yōu)選地，所述熒光微球上的熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異 硫氰酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明；所述熒光微球的微球材料為聚苯乙 烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
[0018] 優(yōu)選地，所述突光微球的激發(fā)波長為350~600nm，優(yōu)選為390nm ;發(fā)射波長為 500 ~700nm，優(yōu)選為 615nm。
[0019] 優(yōu)選地，所述熒光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板上沿使用時的層析方向 依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標記 有熒光微球的第一 HSP90 a -2單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū) 包被有所述第二HSP90 a -2單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標記有熒光微球的 第一 HSP90 a -2單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。
[0020] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)膜為在大于550nm的波長下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素膜。
[0021] 優(yōu)選地，所述底板基本上不具有熒光性質(zhì)。
[0022] 優(yōu)選地，所述抗抗體為羊抗鼠 IgG單克隆抗體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選 為羊抗鼠 IgG單克隆抗體。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種制備所述的用于定量檢測待測物中人HSP90 a-2蛋白的熒 光免疫層析試紙的方法，其包括以下步驟：
[0024] 1)提供標記有熒光微球的第一 HSP90 a -2單克隆抗體；
[0025] 2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標記有熒光微球的第一 HSP90 a -2單克隆抗體；
[0026] 3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二 HSP90 a -2單克隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；
[0027] 4)在底板上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述 反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。
[0028] 優(yōu)選地，所述步驟1)包括：
[0029] a)用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球；
[0030] b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光 微球用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理；
[0031] c)用步驟b)所獲得的熒光微球標記第一 HSP90 a-2單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟 b)所獲得的熒光微球與第一HSP90 a -2單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心， 用BSA-吐溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標記有熒光微球的第一 HSP90 a -2單克 隆抗體。
[0032] 優(yōu)選地，在所述步驟2)中，所述的標記有熒光微球的第一 HSP90 a -2單克隆抗體 的包被濃度為〇. 5~2mg/ml。
[0033] 優(yōu)選地，在所述步驟3)中，所述檢測區(qū)和所述質(zhì)控區(qū)間隔3mm至8mm。
[0034] 優(yōu)選地，在所述步驟3)中，所述第二HSP90 a -2單克隆抗體和所述抗抗體的包被 濃度分別為〇. 5~2mg/ml。
[0035] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果：
[0036] 1.本發(fā)明的人HSP90 a -2抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制備的抗原（免疫 原）免疫動物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。
[0037] 2.用本發(fā)明制備的HSP90 a -2單克隆抗體和多克隆抗體能夠高度特異地與血液 樣本中的HSP90 a -2結(jié)合。
[0038] 3.本發(fā)明的人HSP90 a -2體外診斷試劑盒可以有效地檢測血清中的HSP90 a -2的 水平，可用來判斷腫瘤的惡性程度，并對轉(zhuǎn)移和預(yù)后進行預(yù)測。
[0039] 4.本發(fā)明將熒光分析技術(shù)與快速層析免疫技術(shù)相結(jié)合，提供了一種用于定量檢測 待測物中人HSP90 a -2蛋白的熒光免疫層析試紙，用該試紙檢測待測物中的人HSP90 a -2 蛋白，操作簡便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測，并且檢測范圍寬、特異性高、靈敏度 好，能夠迅速及時地幫助診斷病情，監(jiān)測預(yù)后。
[0040] 5.本發(fā)明在制備所述人HSP90 a -2蛋白的熒光免疫層析試紙的過程中，通過大量 的試驗摸索，優(yōu)化了各方面的制備條件，使得用本發(fā)明的熒光免疫層析試紙進行檢測時，熒 光信背比大大提高，從而提高了檢測靈敏度和結(jié)果可信度；此外，本發(fā)明還通過試紙的檢測 區(qū)與質(zhì)控區(qū)的熒光強度比值的變化來反應(yīng)樣品中HSP90 a -2的含量，這與傳統(tǒng)的層析技術(shù) 只考查檢測區(qū)的絕對熒光強度相比，最大程度上減少了外界條件和背景等的影響，進一步 提高了檢測結(jié)果可信度。
【附圖說明】
[0041] 圖1示意性示出本發(fā)明的一個實施方案的熒光免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0042] 以下通過【具體實施方式】的描述并參照附圖對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只 要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0043] 一、人HSP90 a -2抗原表位肽
[0044] 本文中所述的人HSP90 a -2蛋白是本領(lǐng)域已知的，其氨基酸序列是本領(lǐng)域已知 的，可以在NCBI等專業(yè)數(shù)據(jù)庫中查到。
[0045] 本發(fā)明提供了人HSP9〇a-2抗原表位肽（1)和（2)，其氨基酸序列分別如序列表 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，為：
[0046] (l)Y-E-K-E-S-E-D-K-P-E-I-E-D-V-G-S-D-E ;和
[0047] (2)Y-R-G-I-D-E-D-D-P-T-A-D-D-T-S-A-A-V-T-E。
[0048] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的理論研究和實驗摸索，最終篩選得到兩種具有良好的 抗原性的抗原表位肽。
[0049] HSP90 α -2 抗原表位肽（1)包含人 HSP90 α -2 蛋白（NCBI 登錄號 ΝΡ_005339· 3)N 端第249位至第265位的肽段，并且在該肽段的N段加上Y，從而構(gòu)成包含18個氨基酸的 HSP90 α -2抗原表位肽（1)。
[0050] HSP90 α -2 抗原表位肽（2)包含人 HSP90 α -2 蛋白（NCBI 登錄號 NP_005339. 3)C 端第697位至第714位肽段，并且在該肽段的N段加上Y和R，從而構(gòu)成包含20個氨基酸的 HSP90 α -2抗原表位肽（2)。
[0051] 這兩個肽段均具有親水性、抗原性強并且易于合成的特點。
[0052] 目前，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的HSP90 α -2抗原表位肽具有如下功能：
[0053] 1.具有抗原性；2.與載體蛋白連接后作為免疫原刺激動物產(chǎn)生特異性的抗體； 3.用抗原表位肽制備的抗體可特異性地與人HSP90 α -2結(jié)合。
[0054] 本發(fā)明的HSP90 α -2抗原表位肽的制備方法可用化學(xué)合成法：利用美國ΑΒΙ431Α 型多肽自動合成儀，通過固相法合成抗原表位肽。本發(fā)明的抗原表位肽（1)和（2)的分子 量分