限公司
[0188] (4)測定
[0189] 按儀器說明書進行。
[0190] 結(jié)果：經(jīng)鑒定，所得HSP90 α -2抗原表位肽⑴和⑵的序列分別為：
[0191] (1)Y-E-K-E-S-E-D-K-P-E-I-E-D-V-G-S-D-E ;和
[0192] (2)Y-R-G-I-D-E-D-D-P-T-A-D-D-T-S-A-A-V-T-E。
[0193] 該結(jié)果與目標合成肽段一致。
[0194] 實施例2 :分別將實施例1所得的HSP90 α -2抗原表位肽（1)和⑵與載體蛋白 連接以制備HSP9〇a-2抗原（1)和（2)，利用所得抗原（1)和（2)分別免疫動物，從而利用 抗原（1)制備特異性的單克隆抗體和多克隆抗體，并且利用抗原（2)制備特異性的單克隆 抗體和多克隆抗體。
[0195] 1.抗原的制備：用 BDB (Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法將 HSP90 α-2 肽段⑴和⑵分別與載體蛋白KLH(鑰孔血藍蛋白）（得自sigma公司）連接制備成 HSP90 α -2 抗原（1)和（2)。
[0196] 取 HSP90 α -2 肽段（1)或（2) 10.0 mg，用 lmlO. 1Μ PBS 緩沖液（ρΗ7· 4)溶解； KLHIOmg，用0. 2Μ硼酸鹽緩沖液（ρΗ9. 0) 20ml溶解；然后將兩者混合，冷卻至0 °C，取 BDBCl2110y L，室溫下反應(yīng)1. 5h，透析過夜后分裝，-20°C保存。
[0197] 在本實施例中，PBS緩沖液的配方為：0. 2mol/L的Na2HP0481ml加0. 2mol/L的 NaH2P0419ml混合而成。
[0198] 硼酸鹽緩沖液的配方為：0· 05mol/L硼砂80ml，加 0· 2mol/L硼酸20ml混合而成。
[0199] 2.免疫動物制備單克隆抗體：
[0200] 2. 1.取上述制備的HSP90 α -2抗原（1)和（2)(免疫原）分別與等體積的弗氏完 全佐劑（購自上海源聚生物公司）充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50 μ g抗原/只，皮下多 點注射。4周后測血清效價，選擇免疫反應(yīng)性好的小鼠再加強免疫：取抗原與等體積的不完 全弗氏佐劑（購自上海源聚生物公司）充分混合后，抗原劑量25 μ g/只，皮下多點注射，加 強免疫的次數(shù)為6次，每次間隔2-3周，融合前另外連續(xù)加強免疫兩次，每次間隔1-2周，之 后取脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞按常規(guī)方法用50% PEG(MW4000)(購自中原化工公司）介 導(dǎo)進行融合，并用HAT條件培養(yǎng)基（購自sigma公司）選擇培養(yǎng)。融合后放入C0 2培養(yǎng)箱中 37°C培養(yǎng)9~11天后，孔內(nèi)出現(xiàn)較大的細胞克隆。11天開始用間接ELISA進行篩選。對初 篩陽性的孔利用有限稀釋法進行4次克隆化培養(yǎng)（即使篩選后的細胞大量分裂繁殖），之后 擴增細胞、凍存、制備腹水。
[0201] 2. 2.將Balb/c小鼠用降植燒（購自sigma公司）0. 5ml/只處理，一周后腹腔接種 雜交瘤細胞2X 106個/只，10天后收集腹水。
[0202] 2. 3.測定抗體效價：用間接ELISA方法測定利用HSP90 α -2抗原（1)制備的單克 隆抗體（1)的效價，結(jié)果顯示單抗的效價達到1:32000以上。
[0203] 利用HSP90 α -2抗原（2)制備的單克隆抗體（2)的效價也利用相同的方法進行測 定，其效價也達到1:32000以上。
[0204] 3.免疫動物制備多克隆抗體：
[0205] 3. 1.選用三個月齡、體重約為2kg左右的新西蘭白兔作為免疫動物?；A(chǔ)免疫中， 將l-2mg上述制備的HSP90 α -2抗原（1)和（2)(免疫原）分別與等體積的完全弗氏佐劑 (購自上海源聚生物公司）混合-充分乳化后在兔子背部進行多點皮下注射。每隔4周加 強免疫一次，加強免疫6次，抗原與不完全弗氏佐劑（購自上海源聚生物公司）充分乳化 后，以100 μ g/只于背部多點皮下注射。末次加強免疫后第10天頸動脈放血，分離血清。
[0206] 3. 2.測定抗體效價：用間接ELISA法測定利用HSP90 α -2抗原（1)制備的多克隆 抗體（1)的效價，結(jié)果顯示抗體效價達到1:32000以上。
[0207] 利用HSP90 α -2抗原（2)制備的多克隆抗體（2)的效價也利用相同的方法進行測 定，其效價也達到1:32000以上。
[0208] 3. 3.取血及分離血清：頸動脈插管取血，分離血清。
[0209] 4.分離純化抗體：硫酸銨沉淀后，再經(jīng)Protein G(購自sigma公司）親和純化。
[0210] 5.抗體分裝后凍干，低溫保存。
[0211] 實施例3 :人HSP90 α -2單克隆抗體（1)和⑵的特異性鑒定
[0212] 以ELISA進行檢測。分別以人HSP90a -2蛋白、S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇 化酶NSE (均購自上海聯(lián)碩公司）為檢測抗原包被ELISA板，通過ELISA分別檢測所制備的 HSP90 a -2單克隆抗體（1)和（2)與該人HSP90 a -2蛋白的特異性反應(yīng)，以正常BALB/c小 鼠血清作陰性對照，PBS液作空白對照。
[0213] 結(jié)果：HSP90 a -2單克隆抗體⑴和⑵分別只與HSP90 a -2反應(yīng)為陽性 (P/N>2. 1)，而與S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE反應(yīng)為陰性，說明本發(fā)明的 HSP90 a-2單克隆抗體（1)和（2)分別具有特異性。
[0214] 實施例4 :人HSP90 a -2多克隆抗體⑴和⑵的特異性鑒定
[0215] 利用與上述鑒定單克隆抗體特異性相同的方法進行鑒定。
[0216] 結(jié)果顯示：HSP90 a -2多克隆抗體⑴和⑵分別與HSP90 a -2反應(yīng)為陽性 (P/N>2. 1)，而與S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE反應(yīng)為陰性，說明本發(fā)明的 HSP90 a-2多克隆抗體（1)和（2)分別具有特異性。
[0217] 實施例5 :利用HSP90 a -2單克隆抗體和HSP90 a -2多克隆抗體制備HSP90 a -2體 外診斷試劑盒。
[0218] 在本實施例中，將實施例2中利用HSP90 a -2抗原表位肽（1)制備的單克隆抗體 (1)作為本試劑盒中的包被抗體；將實施例2中利用HSP90 a -2抗原表位肽（2)制備的多 克隆抗體（2)作為結(jié)合抗體。
[0219] HSP90 a -2體外診斷試劑盒的制備和操作如下：
[0220] 1.各種緩沖液及試劑的配制：
[0221 ] A、包被緩沖液：0. 050M、pH9. 6的CB (碳酸鹽緩沖液）
[0222] Na2C03:16.0 克
[0223] NaHC03 :29· 0 克
[0224] 蒸餾水溶至1000ml
[0225] B、樣品 / 洗滌緩沖液：ρΗ7· 2 的 10XPBS_Tween20
[0226] Na2HP04 · 12H20 :58 克
[0227] KH2P04 :4 克
[0228] NaCl:100 克
[0229] KC1 :4 克
[0230] 蒸餾水溶至1000ml
[0231] 加 Tween20 :20ml
[0232] C、酶標記物稀釋液：
[0233] 10 XPBS_Tween20 :10ml
[0234] FCS (小牛血清）：20ml
[0235] 蒸餾水溶至1000ml
[0236] 酶穩(wěn)定劑（可購自上海西寶公司）：1克
[0237] 生物防腐劑（可購自上海西寶公司）：1ml
[0238] D、顯色劑 A:
[0239] 梓檬酸：35. 5克
[0240] 過氧化脲：10克
[0241] 蒸餾水溶至1000ml
[0242] Tween20 :10ml
[0243] E、顯色劑B:
[0244] 檸檬酸：120克
[0245] EDTAJNa : 1 克
[0246] TMB · 2HC1 :2 克
[0247] 蒸餾水溶至1000ml
[0248] F、終止液：2M H2S04
[0249] 濃硫酸（95-98% ) :22. 2ml
[0250] 蒸餾水：177.3ml
[0251 ] 配時將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中，邊加邊搖勻。
[0252] 2.預(yù)包被板的制備：
[0253] 將HSP90 α -2單克隆抗體（1)溶于pH = 9. 6的0. 05M的碳酸鹽緩沖液中，制成預(yù) 包被液，在酶標板（可購自深圳金燦華公司）上每孔按〇. 1 μ g/孔加入100 μ 1，置4°C放置 18-24小時，取出，甩掉包被液，用樣品/洗滌緩沖液洗滌，經(jīng)1 (w/v) % BSA-0. 05M乙醇胺封 閉16小時、過夜干燥后裝入鋁鉬袋中抽真空密封，并置于4°C保存。
[0254] 3.結(jié)合抗體（HSP90 α -2多克隆抗體（2))和酶聯(lián)物（辣根過氧化物酶標記的羊抗 兔IgG抗體）（購自北京中杉金橋公司）的稀釋比例均由方陣滴定實驗確定，辣根過氧化物 酶標記的羊抗兔IgG抗體使用酶標記物稀釋液稀釋。
[0255] 4.試劑盒的組成：
[0256] 預(yù)包被板：48/96孔
[0257] HSP90 α -2校準品（原料購自上海聯(lián)碩公司）：7個：7 X 1. 0ml (濃度分別為25ng/ ml、10ng/ml、5ng/ml、2. 5ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml、0. 25ng/ml)
[0258] HSP90 a -2 結(jié)合抗體：1 X 10ml (經(jīng) 1:5000 稀釋）
[0259] 酶聯(lián)物：1 X 10ml (經(jīng) 1:5000 稀釋）
[0260] 濃縮洗滌液（25XPBS_Tween20) :lX20ml
[0261] 顯色劑 A :1X 6.0ml
[0262] 顯色劑 B :1 X 6.0ml
[0263] 終止液：1 X 6. 0ml
[0264] 5.試劑盒的操作步驟：
[0265] 在預(yù)包被板的各孔中分別加入待檢血樣以及標準品100 μ 1/孔，均為雙孔，37°C 孵育60分鐘，用1 X洗滌緩沖液洗滌5次，拍干。在各孔內(nèi)加入HSP90 a -2結(jié)合抗體100 μ 1/ 孔，37°C孵育30分鐘，用IX洗滌緩沖液洗滌5次，拍干。再在各孔內(nèi)加入酶聯(lián)物100 μ 1/ 孔，37°C孵育30分鐘，用1 X洗滌緩沖液洗滌5次，拍干。加入顯色劑Α、Β液，每孔各50 μ 1， 混勻，37°C孵育15分鐘。加終止液50μ 1/孔終止反應(yīng)，用酶聯(lián)檢測儀（型號RT-6000,可購 自雷杜公司）用雙波長（450nm、620nm)檢測吸光度。
[0266] 6.結(jié)果判定：
[0267] 表1 :標準品濃度和對應(yīng)的平均吸光度（0D)值
[0268]
[0269] 以標準品濃度和對應(yīng)吸光度的對數(shù)值繪制標準曲線，標準曲線的R2 = 0. 978。
[0270] 根據(jù)標準曲線計算所檢測的標本中的HSP90 α -2濃度結(jié)果。
[0271] 對30例腫瘤病人和81例健康者按上述方式進行血清HSP90 α -2檢測，腫瘤病人 血清中的HSP90 α -2含量明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ρ〈0. 01)，見表2。
[0272] 表2 :兩組樣本HSP90 α -2濃度比較
[0273]
[0274]