專利名稱：：基于核酸適體的靶物質的檢測方法及其固相生物感應器的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物感應器領域，特別涉及一種基于核酸適體的用于檢測和定量耙物質的方法以及檢測用的固相生物感應器。
背景技術：
：蛋白質是構成生物體的重要組成部分之一，檢測和定量某些特定蛋白質在疾病診斷、治療和新藥研制等方面具有重要意義。目前，研究和醫(yī)療診斷中常用的是基于抗體的蛋白檢測方法(如ELISA，WesternBlotting),這些傳統(tǒng)方法具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點，但是往往需要放射性標記、凝膠電泳和放射自顯影等煩雜操作，也不適用于快速、高通量的多元檢測。而最近發(fā)展起來的核酸適體(Aptamer)，不僅具有類似抗體的高度特異性，而且可以篩選，可以直接固相化學法合成，成本較低并且化學穩(wěn)定性好，為檢測蛋白質傳感器的設計提供了新的途徑。核酸適體(Aptamer)是一類通過SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技術體外篩選出來的可以與特定的配體分子(ligand)相結合的一段DNA或RNA分子。由于對于某一種特定的目標分子，總能找到一種或多種與之特異結合的核酸適體，并且它們與目標靶分子具有高度的親和力和特異性。核酸適體被認為是生物傳感器領域最理想的識別元件之一。目前，核酸適體已被用于很多傳感檢測領域。體外篩選核酸適體不僅增強了人們對核酸、蛋白質相互作用的認識，也為蛋白質生物傳感器的設計提供了一條新的途徑。迄今為止，己篩選到HIV、HCV、腫瘤相關因子、凝血酶、彈性蛋白酶等多種蛋白質分子的核酸適體?？股氐暮怂徇m體已在治療中展示了良好的應用前景?？梢灶A測，核酸適體在蛋白質生物傳感器領域將大有可為。作為蛋白質之一的凝血酶，與其核酸適體之間的特異性反應己有大量研究。1992年Bock等(L.C.Bock，L.C.Griffin,J.A.Latham,E.H.Vermaas，J.J.Toole，A^fww1992，355，564)首次在體外分離并篩選到了具有抗凝血酶凝集活性的15mer的單鏈DNA核酸適體5，-GGTTGGTGTGGTTGG-3，。該核酸適體的解離常數(shù)Kd可達25200nM。1997年Tasset等(D.M.Tasset，M.F.Kublik,W.Steiner，《/Mo/.所o/.1997，272,688)篩選到另一個29mer的凝血酶單鏈DNA核酸適體，體外也能抑制凝血酶催化的血纖維蛋白凝集反應，其解離常數(shù)Kd可達到0.5nM，較15mer的核酸識體結合更為緊密。在這兩種核酸適體中，對15mer的核酸適體的研究尤為具體，該核酸適體與凝血酶結合后呈G—四聚體結構，而這也是大多數(shù)實驗設計的基礎。目前已發(fā)展了很多凝血酶檢測的新方法，如光學檢測，電化學檢測、石英晶體微天平和表面等離子共振。在這些方法中，Xiao等(Y.Xiao，A.A.Lubin，A.J.Heeger,K.W.Plaxco，Label-freeelectronicdetectionofthrombininbloodserumbyusinganaptamer-basedsensor.爿"gevuC72，.紋2(905，44,5456)報道的免標記的電化學方法對凝血酶的檢測，無需其它試劑，選擇性高。但是在血液中檢測的靈敏度有限的，并且它是一種"singal-off，的工作模式。以這種模式進行檢測時，由于核酸適體或還原標記物的降解產生的雜質常常會產生假陽性信號，從而使靶的特異結合所產生的信號很難分辨出來。其他的如以石英晶體微天平(S.Fukusho,H.Furusawa,Y.Okahata，CTzew.Comm"".2002,88)或表面等離子體共振(S.H.L.Verhelst，P.J.A,Michiels，G.A.v.d.Marel,C.A.A.v.Boeckel，J.H.v.Boom,C7zew6/oc/zem2004，5，937;S.Tombelli，M.Minunni，M.Mascini,爿wa/.Le".20W，35，599)為檢測方式的核酸適體生物傳感器雖具有較高的靈敏度和較短的檢測時間，但是都容易引起非特異吸附從而產生假陽性結果；而另外報道(T.Hianik,V.Ostatoa，Z.Zajacova,E.Stoikova，G.Evtugyn,B/oorg.Afed.C/zem.2005，15，291)的一種基于核酸適體檢測凝血酶的電化學方法，需要多步操作過程，并且需要外加還原指示劑，也具有難以克服的缺點?？梢?，發(fā)展高特異性、高靈敏度的生物檢測方法是實現(xiàn)蛋白質檢測與定量所面臨的重要挑戰(zhàn)之一。
發(fā)明內容因此，本發(fā)明要解決的技術問題就是針對現(xiàn)有技術中靶物質檢測存在的不足，提供一種用于檢測和定量靶物質的方法及檢測用的固相生物傳感器，其具有更高特異性和靈敏度。本發(fā)明解決上述第一個技術問題所采用的技術方案是一種基于核酸適體的用于檢測和定量靶物質的方法，包括以下步驟1)以磁性顆粒為固相載體，將捕獲探針連接在磁性顆粒表面，得磁性顆粒-捕獲探針復合物；該捕獲探針為一單鏈核酸，其序列包括耙物質的核酸適體序列；2)在磁性顆粒-捕獲探針復合物中加入待測樣品進行反應，然后磁性分離，去除游離成分；3)將信號探針與橋梁分子雜交所得雙鏈核酸加入到步驟2)所得的反應體系中進行反應，然后磁性分離，去除游離成分，包括游離的信號探針；該信號探針是熒光標記的一任意序列的單鏈核酸，橋梁分子也是一單鏈核酸，其序列包括一端為與信號探針互補的序列，另一端為耙物質的核酸適體序列；4)通過核酸變性的方法將信號探針從磁性顆粒表面分離下來，對該信號探針上的熒光信號進行檢測。本發(fā)明所述的靶物質，可以是任何物質，只要其至少有一個核酸適體，且當只有一個核酸適體時，該靶物質與該核酸適體至少有兩個結合位點。根據本發(fā)明，步驟l)為以磁性顆粒為固相載體，將捕獲探針連接在磁性顆粒表面，得磁性顆粒-捕獲探針復合物；該捕獲探針為一單鏈核酸，其序列包括靶物質的核酸適體序列。其中，本發(fā)明所述的磁性顆粒(magneticmicro-particles,MMP)是常規(guī)的由有機或無機基質與磁性超細粉末(包括磁性金屬、金屬氧化物等)反應形成的納米或微米級膠態(tài)顆粒。該材料具有超順磁性使其通過運動保持在膠體溶液中的穩(wěn)定性，并有磁響應性可保證在外加磁場中顆粒與懸浮介質的分離，當撤去其外磁場后，微粒本身會重新懸浮分散不聚集，不具有磁記憶性。通過高分子或有機試劑與磁性粉末的復合，可在顆粒表面引入氨基、羧基、巰基或羥基等功能基團，通過共價作用將酶、抗體、細胞和核酸等生物分子固定在表面，進而應用于酶的固定化、免疫監(jiān)測、細胞分選、藥物載體和核酸的純化與分離等生物、醫(yī)學領域。磁性顆粒的制備方法有許多，目前已有眾多商品化的磁性顆粒上市。本發(fā)明所述的磁性顆粒的種類包括常規(guī)的有超順磁性的金屬氧化物磁性顆粒、復合材料磁性顆粒，優(yōu)選金屬氧化物磁性顆粒。本發(fā)明所述的磁性顆粒的直徑為800nm1200nm，優(yōu)選的為800nm1000nm，更優(yōu)選的為1000nm。所述的捕獲探針與磁性顆粒的連接較佳的通過磁性顆粒表面帶有的配體(或受體)與捕獲探針帶有的受體(或配體)之間的特異性親和作用連接。更佳的通過常規(guī)的生物素-親和素作用連接。本發(fā)明所述的捕獲探針為一單鏈核酸，其序列中包括一靶物質的核酸適體序列。較佳的，捕獲探針的序列在核酸適體與磁性顆粒連接處之間還包括一間隔序列(spacer)。所述的間隔序列為本領域常規(guī)重復腺嘌呤堿基或胸腺嘧啶堿基序列，較佳的為重復腺嘌呤堿基或胸腺嘧啶堿基。間隔序列的長度較佳的為5bp20bp，更佳的為12bp15bp。所述的磁性顆粒與捕獲探針的反應比例較佳的為lmg:1.25nmollmg:lnmo1，更佳的為lmg:1.25nmo1。根據本發(fā)明，在步驟2)所述的磁性顆粒-捕獲探針復合物與待測樣品進行反應前，較佳的還包括以下步驟在磁性顆粒-捕獲探針復合物中加入封閉液進行反應，以封閉磁性顆粒表面的空余的結合位點。所述的封閉液可以是本領域中常用的封閉試劑，較佳的選自牛血清白蛋白(BSA)、PEG(聚乙二醇)、酪蛋白、脫脂奶粉和小牛血清等，更佳的為BSA。封閉方法為本領域的常規(guī)技術。封閉液的反應濃度較佳的為0.510wt%，更佳的為l2wt%，最佳的為2wt%。封閉反應的溫度較佳的為20°C30°C，更佳的為23°C~27°C。封閉反應的時間較佳的為2060分鐘，更佳的為2030分鐘。根據本發(fā)明，步驟2)為在磁性顆粒-捕獲探針復合物中加入待測樣品進行反應，然后磁性分離，去除游離成分。其中，所述的磁性顆粒-捕獲探針復合物與待測樣品的反應中，待測樣品的反應濃度較佳的為lnM500nM，更佳的為10nM250nM。磁性顆粒-捕獲探針復合物的反應濃度較佳的為0.5UM1.25UM，更佳的為luM1.25uM。反應溫度較佳的35°C~42°C，更佳的為35°C37°C。反應時間較佳的60min90min，更佳的為50min70min。磁性分離的方法是本領域常規(guī)的磁性顆粒磁性分離的方法。根據本發(fā)明，步驟3)為將信號探針與橋梁分子雜交所得雙鏈核酸加入到步驟2)所得的反應體系中進行反應，然后磁性分離，去除游離成分，包括游離的信號探針；該信號探針是帶熒光標記的一任意序列的單鏈核酸，橋梁分子也是一單鏈核酸，其序列包括一端為與信號探針互補的序列，另一端為靶物質的核酸適體序列。其中，所述的信號探針的序列是任意序列，長度較佳的為10bp20bp，更佳的為12bp15bp。所述的熒光標記為本領域常規(guī)的熒光標記，較佳的選自FAM(熒光素)、FITC(異硫氰酸熒光素)、Alexa488、羅丹明110和Cy2，更佳的選自FAM和FITC。所述的橋梁分子的序列包括與信號探針互補的序列和耙物質的核酸適體序列。在與信號探針互補的序列和靶物質的核酸適體序列之間較佳的還包括一間隔序列。所述的間隔序列為本領域常規(guī)重復腺嘌呤堿基或胸腺嘧啶堿基序列，較佳的為重復腺嘌呤堿基或胸腺嘧啶堿基。間隔序列的長度較佳的為4bp12bp，更佳的為5bp10bp。所述的信號探針與橋梁分子雜交的方法同常規(guī)，較佳的，雜交反應溫度為25。C37'C，反應時間為10min30min。將信號探針與橋梁分子雜交所得的雙鏈核酸加入到步驟2)所得的反應體系中進行反應，雙鏈核酸的反應濃度為0.5uM~2.5uM，較佳的為0.5wM1.25tiM。步驟2)所得的磁性顆粒復合物的反應濃度為0.5uM1.25lxM，較佳的為0.5pM1"M。雙鏈核酸的濃度較佳的為在相同體系中磁性顆粒復合物中捕獲探針濃度的12倍。反應溫度較佳的為35°C~42°C，更佳的為35°C~37°C，反應時間較佳的為60min90min，更佳的為50min70min。本發(fā)明中，捕獲探針和橋梁分子中都必須有一段序列是待檢測靶物質的核酸適體序列。這兩個捕獲探針和橋梁分子中的序列是否相同，取決于靶物質有幾個核酸適體，還取決于靶物質與核酸適體有幾個結合位點。這兩個序列，滿足以下條件當靶物質只有一個核酸適體，且靶物質與該核酸適體有兩個結合位點時，這兩個序列相同，即同為該核酸適體序列；當靶物質存在兩個及以上不同序列的核酸適體，且靶物質與每個核酸適體只有一個結合位點時，這兩個序列不相同，即分別為選自該不同的核酸適體序列中不同的兩個；當靶物質有兩個及以上核酸適體，且靶物質與每個核酸適體的結合位點不止一個時，這兩個序列可以相同也可以不相同，即分別為選自該不同序列的核酸適體序列中的任何一個。根據本發(fā)明，步驟4)為核酸變性的方法將信號探針從磁性顆粒表面分離下來，對該信號探針上的熒光信號進行檢測。其中，所述的核酸變性的方法為本領域常規(guī)的變性方法，優(yōu)選堿變性方法。變性劑可以為本領域常用的各種堿溶液，較佳的為20~100mM的NaOH，最佳的為50mMNaOH。所述的熒光信號的檢測方法可以是本領域常用的熒光信號檢測法，本發(fā)明優(yōu)選分光光度法。其中，在檢測熒光信號時，較佳的先在熒光標記的信號探針中加入具有熒光信號倍增功能的水溶性的共軛聚合物，再進行熒光信號檢測。利用共軛聚合物與熒光素之間的熒光共振能量轉移(FRET)實現(xiàn)信號倍增，從而提高檢測靈敏度。所述的共軛聚合物(ConjugatedPolymers):是指碳鏈骨架上含有單、雙鍵交替共軛體系的聚合物。共軛聚合物存在著7C電子共軛體系，具有很強的光捕獲能力，具有熒光信號倍增功能。所述的共軛聚合物較佳的為選自聚芴衍生物、聚噻吩衍生物、聚苯撐乙烯、聚苯撐乙炔和聚吡咯中的一種或多種。具體選用哪種聚合物，與所使用的標記信號探針的熒光基團有關，只要聚合物與熒光基團之間能發(fā)生高效的熒光共振能量轉移即可。本發(fā)明的熒光標記優(yōu)選FAM和FITC，故共軛聚合物優(yōu)選水溶性聚荷，其結構式如下上述結構中，R=(CH2)3N+(CH3)2CH2CH3Br，n》10。加入熒光信號倍增的共軛聚合物進行熒光信號檢測時，所述熒光標記的信號探針的濃度較佳的為lnM500nM，更佳的為10nM250nM;共軛聚合物的濃度較佳的為200nM1000nM，更佳的為10nM250nM;共軛聚合物的濃度為信號探針濃度的12倍，更佳的為11.5倍，優(yōu)選1倍。本發(fā)明解決上述第二個技術問題所采用的技術方案是一種采用所述的方法進行檢測和定量靶物質的固相生物傳感器，包含固相載體、捕獲探針、信號探針和橋梁分子，其中所述的固相載體為磁性顆粒，表面結合著能發(fā)生特異性親和作用的配體或受體；所述的捕獲探針為一結合著能與所述磁性顆粒表面的配體或受體發(fā)生特異性親和作用的受體或配體的單鏈核酸，其序列包括靶物質的核酸適體序列；所述的信號探針是熒光標記的一任意序列的單鏈核酸；所述的橋梁分子也是一單鏈核酸，其序列包括一端為與信號探針互補的序列，另一端為耙物質的核酸適體序列。其中，所述的磁性顆粒如上所述，本發(fā)明優(yōu)選本領域常規(guī)的磁性顆粒中直徑為800nm1200nm的種類為Fe304、Y-Fe203的磁性顆粒。所述的能發(fā)生特異性親和作用的配體或受體，優(yōu)選親和素或生物素。所述的捕獲探針的序列包括靶物質的核酸適體序列，其中在核酸適體序列和結合著受體或配體的結合處之間較佳的還包括一間隔序列；間隔序列優(yōu)選為12bp15bp的重復腺嘌呤堿基或胸腺嘧啶堿基。所述的信號探針是熒光標記的一任意序列的單鏈核酸，優(yōu)選的序列長度為12bp15bp，所述熒光標記優(yōu)選的為FAM或FITC。所述的橋梁分子的序列，較佳的在與信號探針互補的序列和耙物質的核酸適體序列之間還包括一間隔序列，間隔序列優(yōu)選為5bp10bp的重復腺嘌呤堿基或胸腺嘧啶堿基。較佳的，本發(fā)明的固相生物傳感器還包括封閉液、變性劑和/或共軛聚合物。所述封閉液較佳的選自質量百分比0.510%的BSA和0.5~10%的PEG，最優(yōu)選質量百分比2%BSA，變性劑較佳的選自20~1OOmM的NaOH和KOH，最優(yōu)選50mMNaOH，共軛聚合物優(yōu)選如上所述的水溶性聚銜。本發(fā)明的固相生物感應器采用上述本發(fā)明的檢測方法。理論上，任意物質都能找到一種或多種與之特異結合的核酸適體。事實上，已經有眾多物質找到了其核酸適體，如蛋白質(凝血酶、生長因子、HIV相關多肽等)、有機小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金屬離子(K+、Hg2+、Pp+等)。這些物質都可以作為待檢的靶物質，只要該待測樣品至少有一個核酸適體，且當其只有一個核酸適體時，該待測樣品與核酸適體至少有兩個結合位點，均可采用本發(fā)明的固相生物感應器及檢測方法，用相應的核酸適體進行定量或檢測。優(yōu)選的，所述的靶物質為蛋白質，更佳的如凝血酶。本發(fā)明以凝血酶(thrombin)為例來說明本發(fā)明的具體實施方式，其中，捕獲探針為5'-生物素一TTTTTTTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3'，或5'-生物素-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3，，信號探針為5'-熒光素-GTATGCTGATCTGAT-3'，橋梁分子為5'-GGTTGGTGTGGTTGGTTTTTATCAGATCAGCATAC-3，。本發(fā)明凝血酶方案的檢測原理可簡述為圖1所示。本發(fā)明除特別說明之外，所用的百分比都是質量百分比。相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的可適用于檢測各種不同種類的靶物質，如蛋白質、有機小分子和金屬離子等。只要該耙物質至少有一個核酸適體，且當其只有一個核酸適體時，該待測樣品與核酸適體至少有兩個結合位點，均可采用本發(fā)明的固相生物感應器及檢測方法，用相應的核酸適體進行定量或檢測。本發(fā)明對靶物質的檢測靈敏度很高，如對凝血酶的檢測靈敏度為500pM。本發(fā)明不僅具有較高的靈敏度，而且還解決了非特異性問題，在生物檢測、疾病的早期診斷和治療中有著重要的意義。以下結合本發(fā)明的特征和有益效果。圖1為本發(fā)明優(yōu)選的基于磁性顆粒和水溶性共軛聚合物的靶物質檢測方法的工作原理圖。圖2為未用水溶性共軛聚合物進行信號放大時的檢測結果對比。a為空白；b為濃度為lOOnM的凝血酶。圖3為是否采用封閉措施時的兩種體系檢測凝血酶的結果對比。A圖為FRET圖譜，B圖為對應的FRET效率。a，b分別為未封閉的空白和靶；c，d分別為封閉后的空白和靶。靶濃度為25nM。圖4為使用封閉的磁性顆粒檢測凝血酶的靈敏度分析。A圖為FRET圖譜，B圖為對應的FRET效率。a為空白對照，b為500pM的凝血酶。具體實施例方式下面結合附圖，用凝血酶的檢測實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。所述的"室溫"是指2(TC25'C。所用儀器為熒光分光光度計(HitachiF-4500,日本)。熒光光譜測量條件氙燈激發(fā)，激發(fā)和發(fā)射狹峰寬度均為2.5nm，電壓PMT950V，響應時間2S。激發(fā)波長為380nm，發(fā)射波長掃描范圍390—700nm。用3mL石英比色皿進行測量，樣品體積lmL，室溫。本發(fā)明實施例中所用鏈親和素修飾的超順磁性顆粒購于Promega公司，顆粒直徑為1.0pm，固含量為lmg/mL，結合能力為1.25nmo1探針/mgMMPs。本發(fā)明實施例中所用的水溶性共軛聚合物為陽離子的聚荷衍生物(PF)，根據文獻(F.Huang,H.Wu,D.Wang,W.Yang，YCao,Chem.Mater.2004,16，708)合成，其結構式如下RR上述結構中，R=(CH2)3N+(CH3)2CH2CH3Br，n>10。本發(fā)明實施例中所用的各種DNA序列(購自上海生物工程技術有限公司)如表1所示，所用各種溶液成分如表2所示。表l.寡聚核苷酸序列名稱堿基組成長度捕獲探針15'-生物素-丁丁丁t丁丁丁丁tt丁丁tt丁GGTTGGTGTGGTTGG-3'30bp捕獲探針25，-生物素-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3，44bp橋梁分子5'-GGTTGGTGTGGTTGGTTTTTATCAGATCAGCATAC-3'35bp信號探針5'畫熒光素-GTATGCTGATCTGAT-3'15bp表2.各種溶液組成成分表溶液名稱溶液組成0.5XSSC75mMNaCl，7.5mM檸檬酸鈉，pH7.4TTL100mMTris-HCl，0.1%Tween20，1MLiCl，pH8.014<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例1制備磁性顆粒-捕獲探針復合物按產品說明書要求，MMPs在使用前首先用0.5xSSC緩沖液洗滌3次，然后將5n1濃度為25uM的生物素標記的捕獲探針2加入到100"1含有10ugMMPs的TTL緩沖液的中，在室溫下輕輕混合10分鐘。捕獲探針的表面密度約為46x1011鏈/cm2。然后將MMPs和捕獲探針的復合物(MMPs-captureprobe，記為MMPs-cp1)用TTA緩沖液洗兩次，懸浮于結合液中，懸浮濃度為1.25uM，4"C冷藏備用。實施例2橋梁分子與信號探針雜交2.17lU濃度為46uM的橋梁分子與1.62ii1濃度為62uM的信號探針加入到50tU的雜交緩沖液(雜交緩沖液的成份為750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉，pH7.4)中，室溫雜交20分鐘，得雙鏈信號探針。實施例3磁性顆粒-捕獲探針復合物空余位點的封閉取上述制備所得的于fC冷藏備用的磁性顆粒-捕獲探針復合物(MMPs-cp1)的懸浮液0.1ml，然后用TTA緩沖液洗滌三次，磁性分離并吸去上清液后，加入0.1ml濃度為2wt^的牛血清蛋白(BSA)溶液，室溫封閉30分鐘。然后用TTA緩沖液洗兩次，懸浮于結合液中，懸浮液中磁性顆粒—捕獲探針復合物的懸浮濃度和封閉前相同，4'C冷藏備用(記為MMPs-cp2)。實施例4檢測檢測1:將2.5u1濃度為500nM的凝血酶加入到50u1實施例1制備所得的MMPs-cp1的懸浮液中，37。C反應l小時，磁性分離，去除游離組分。然后加入50iU實施例2制備所得的雜交的雙鏈信號探針，37"C反應1小時。然后用結合液洗滌35次，直至洗滌得到的分離上清液中無熒光信號為止。然后向經磁性分離，吸走上清液后的磁性顆粒復合物中加入100pL濃度為50mM的NaOH，室溫變性5分鐘，磁性分離，收集變性上清液，向其中加入等摩爾量HC1進行中和，再加入0.8ml的10mMTris-HCl(pH8.0)緩沖溶液(10mMTris-HCl，0.5MNaCl，2mMMgCl2)進行熒光檢測(Ex:480nm，Em:490~700nm)，然后再加入5pl濃度為27.08pM的PF溶液進行共軛聚合物信號放大的檢測(Ex:380nm，Em:390~700nm)。同時，做如下試驗作為對比。檢測2:用等體積的相同濃度的癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)(生產廠商Sigma公司)抗體代替凝血酶進行試驗，作為陰性對照，其它條件與檢測1中相同。檢測3:用等體積水代替凝血酶進行試驗，作為空白對照，其它條件與檢測1中相同。檢測4:用一生物素修飾的任意DNA序列(5'-生物素-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCTGGTTAGTCGTGGTTCGAATGCTTA-3')代替捕獲探針2進行試驗，作為特異性對照，其它條件與上相同。檢測5:用捕獲探針1代替捕獲探針2進行試驗，其它條件與上相同。將2.5^1濃度為500nM的凝血酶加入到實施例3制備所得的封閉過的MMPs-cp2的懸浮液中進行試驗，其他步驟與條件同"檢測1"中的條件。同時，做如下試驗作為對比。檢測7:用等體積水代替凝血酶進行試驗，為空白對照，其它步驟和條件與檢測6中相同。檢測8:用濃度為500pM的凝血酶代替濃度為25nM的凝血酶進行試驗，其它步驟和條件與檢測6中相同。結果陰性對照CEA抗體(即檢測2)與空白對照(即檢測3)的兩種熒光檢測的熒光信號相當?？梢姳景l(fā)明的該傳感器對凝血酶的檢測具有高度的特異性。用一生物素修飾的任意DNA序列為捕獲探針(即檢測4)進行檢測的信號與空白對照的信號相當?？梢姳景l(fā)明的該傳感器具有較好的序列特異性。以較長的捕獲探針2為探針時，對凝血酶的檢測結果比捕獲探針1時的檢測結果更好。捕獲探針1中的核酸適體序列是凝血酶的核酸適體序列(apl)，與凝血酶有兩個特異性親和位點(參考文獻為L.C.Bock，L.C.Griffin,J.A.Latham,E.H.Vermaas，J.J.Toole,Selectionofsingle-strandedDNAmoleculesthatbindandinhibithumanthrombin.Nature1992,355，564-566.)。捕獲探針2中的核酸適體序列是凝血酶的另一個核酸適體序列(ap2)，與凝血酶有一個特異性親和位點(參考文獻為D.M.Tasset,M.F.Kublik,W.Steiner，Oligonucleotideinhibitorofhumanthrombinthatbinddistinctepitopes.J.Mol.Biol.1997,272,688-698.)。橋梁分子中的核酸適體序列都是apl。捕獲探針1的核酸適體與凝血酶有兩個不同的結合位點，而捕獲探針2的核酸適體與凝血酶只有一個結合位點。當以捕獲探針1為探針時，連接了凝血酶之后，橋梁分子只能和凝血酶的另外一個位點進行結合，結合的幾率較??；當以捕獲探針2為探針時，連接了凝血酶之后，橋梁分子可以和凝血酶的兩個不同的結合位點中的任一位點結合，結合幾率較高。因此，本發(fā)明優(yōu)選捕獲探針與橋梁分子中所含的序列是不相同核酸適體序列?？梢姡景l(fā)明的基于磁性顆粒和核酸適體-靶物質結合機制的傳感策略，具有較高的特異性。以任意一種核酸適體為捕獲探針時，都可實現(xiàn)對凝血酶的定性檢測。圖2為熒光檢測(Ex:480nm，Em:490700nm)結果?？梢?，未加入具有熒光信號倍增功能的水溶性的共軛聚合物，進行信號放大時，無法區(qū)分空白對照和靶的信號。其中圖中約580nm處的微弱的峰不是所要的特征峰，可能是緩沖液引起的，信號強時這個峰自然就被掩蓋了，故可不予考慮。加入PF溶液進行共軛聚合物信號放大的檢測(Ex:380nm，Em:390一700nm)結果見圖3。圖2和3中，曲線a為封閉前的空白對照試驗結果(即檢測3);曲線b為封閉前的25nM凝血酶試驗結果(即檢測l);曲線c為封閉后的空白對照試驗結果(即檢測7);曲線d為封閉后的25nM凝血酶試驗結果(即檢測6)。由圖可見，采用封閉措施以后，空白對照(曲線a)的信號顯著降低，表明體系中的非特異性吸附明顯減少；而相同濃度靶(曲線d)的信號則略有升高。這是由于非特異性吸附的減少使凝血酶的結合效率增加的緣故?？梢姡褂肂SA對磁性顆粒表面進行了封閉以后，降低了該傳感器檢測凝血酶時的本底信號，檢測的信噪比大大提高，進一步提高了凝血酶檢測的靈敏度。圖4為加入PF溶液進行共軛聚合物信號放大的檢測(Ex:380nm，Em:390—700nm)的結果，其中曲線a為封閉后空白對照試驗結果(即檢測7);曲線b為封閉后500pM凝血酶的試驗結果(即檢測8)。如圖所示，使用BSA對磁性顆粒表面進行了封閉以后，可檢測500pM凝血酶，比未封閉時提高了至少兩個數(shù)量級。這與Heyduk(E.Heyduk,T.Heyduk,爿wa/.2005，77,1147)等報道的基于分子信標的熒光檢測方法的靈敏度相當。與Xiao等(Y.Xiao,A.A.Lubin,A.J.Heeger，K.W.Plaxco，C7em.M2005,44,5456)報道的電化學傳感器相比，靈敏度也提高12個數(shù)量級。18權利要求1、一種基于核酸適體的用于檢測和定量靶物質的方法，包括以下步驟1)以磁性顆粒為固相載體，將捕獲探針連接在磁性顆粒表面，得磁性顆粒-捕獲探針復合物，該捕獲探針為一單鏈核酸，其序列包括靶物質的核酸適體序列；2)在磁性顆粒-捕獲探針復合物中加入待測樣品進行反應，然后磁性分離，去除游離成分；3)將信號探針與橋梁分子雜交得雙鏈核酸，以該雙鏈的形式將信號探針加入步驟2)所得的反應體系中進行反應，然后磁性分離，去除游離成分；該信號探針是熒光標記的一任意序列的單鏈核酸，橋梁分子也是一單鏈核酸，其序列包括一端為與信號探針互補的序列，另一端為靶物質的核酸適體序列；4)通過核酸變性的方法將信號探針從磁性顆粒表面分離下來，對該信號探針上的熒光信號進行檢測。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的核酸適體與磁性顆粒的連接通過表面的配體或受體與受體或配體之間的特異性親和作用連接。3、根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟2)所述的磁性顆粒-捕獲探針復合物與待測樣品進行反應前，還包括步驟在磁性顆粒-捕獲探針復合物中加入封閉液進行反應，以封閉磁性顆粒表面的空余的結合位點.4、根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述的核酸變性的方法為常用的堿變性方法。5、根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)檢測熒光信號時，先在熒光標記的信號探針中加入具有熒光信號倍增功能的水溶性的共軛聚合物，再進行熒光信號檢測。6、根據權利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述的熒光信號的檢測方法是常用的分光光度法。7、一種采用權利要求1所述的方法進行檢測和定量耙物質的固相生物傳感器，包含固相載體、捕獲探針、信號探針和橋梁分子，其特征在于，其中所述的固相載體為磁性顆粒，表面結合著能發(fā)生特異性親和作用的配體或受體；所述的捕獲探針為一結合著能與所述磁性顆粒表面的配體或受體發(fā)生特異性親和作用的受體或配體的單鏈核酸，其序列包括靶物質的核酸適體序列；所述的信號探針是熒光標記的一任意序列的單鏈核酸；所述的橋梁分子也是一單鏈核酸，其序列包括一端為與信號探針互補的序列，另一端為靶物質的核酸適體序列；所述的靶物質至少有一個核酸適體，且當靶物質只有一個核酸適體時，靶物質與該核酸適體至少有兩個結合位點。8、根據權利要求7所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的能發(fā)生特異性親和作用的配體或受體為親和素或生物素。9、根據權利要求7所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的捕獲探針的序列在核酸適體與磁性顆粒連接處之間還包括一間隔序列，所述的橋梁分子中在與信號探針互補的序列和靶物質的核酸適體序列之間還包括一間隔序列。10、根據權利要求9所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的間隔序列重復腺嘌呤堿基或胸腺嘧啶堿基。11、根據權利要求7所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的熒光標記選自FAM和FITC。12、根據權利要求7所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的捕獲探針中的靶物質的核酸適體序列與橋梁分子中的靶物質的核酸適體序列，滿足以下條件當靶物質只有一個核酸適體，且靶物質與該核酸適體有兩個結合位點時，這兩個序列相同，即同為該核酸適體序列；當靶物質存在兩個及以上不同序列的核酸適體，且靶物質與每個核酸適體只有一個結合位點時，這兩個序列不相同，即分別為選自該不同的核酸適體序列中不同的兩個；當靶物質有兩個及以上核酸適體，且靶物質與每個核酸適體的結合位點不止一個時，這兩個序列相同或不相同，即分別為選自該不同序列的核酸適體序列中的任何一個。13、根據權利要求7所述的固相生物傳感器，其特征在于，還包括選自封閉液、變性劑和共軛聚合物中的一種或多種。14、根據權利要求13所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的封閉液為牛血清白蛋白，所述的變性劑選自NaOH溶液和KOH溶液，所述的共軛聚合物是水溶性聚芴，其結構式如下上述結構中，R=(CH2)3N+(CH3)2CH2CH3Br，n>10。15、根據權利要求7所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的靶物質為蛋白質。16、根據權利要求15所述的固相生物傳感器，其特征在于，所述的靶物質為凝血酶。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于核酸適體的用于檢測和定量靶物質的方法以及檢測用的固相生物感應器，該方法包括以下步驟1)將捕獲探針連接在磁性顆粒表面，該捕獲探針的序列包括靶物質的核酸適體序列；2)加入待測樣品進行反應；3)將信號探針與橋梁分子雜交得雙鏈核酸，以該雙鏈的形式將信號探針加入步驟2)所得的反應體系中反應，然后磁性分離，去除游離的信號探針；4)通過核酸變性的方法將信號探針從磁性顆粒表面分離下來，對該信號探針上的熒光信號進行檢測。本發(fā)明適合檢測靶物質種類廣，包括蛋白質、有機小分子和金屬離子等。本發(fā)明不僅具有較高的靈敏度，而且還解決了非特異性問題，在生物檢測、疾病的早期診斷和治療中有著重要的意義。文檔編號G01N33/53GK101430334SQ20081020227公開日2009年5月13日申請日期2008年11月5日優(yōu)先權日2008年11月5日發(fā)明者劉興奮,樊春海,王麗華申請人:中國科學院上海應用物理研究所