專利名稱：：一種單克隆抗體的制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備及其用途，具體說涉及一種適用于同時(shí)檢測蘇丹紅I和對位紅殘留的單克隆抗體的制備及其用途，屬于免疫化學(xué)分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：蘇丹紅(Sudan)為親脂性偶氮化合物，是一種紅色的工業(yè)合成染色劑，屬于化工染料，主要用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板、彩色蠟、焰火禮花等的增色增光。由于蘇丹紅化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有偶氮基團(tuán)，人體攝入后，在還原酶的作用下體內(nèi)會(huì)生成相應(yīng)的胺類物質(zhì)，從而對人體具有致癌性。雖然我國以及絕大多數(shù)國家都早已明令禁止蘇丹紅作為添加劑用于食品中，但其能夠使食物色澤更鮮亮持久，提高食品的價(jià)值，而被少數(shù)生產(chǎn)廠家違規(guī)當(dāng)作了食用色素，蘇丹紅引起的食品安全問題在各大媒體報(bào)紙上也是時(shí)有報(bào)道。2004年6月14日，英國食品標(biāo)準(zhǔn)管理局就此前在超市一批新食品中發(fā)現(xiàn)含有潛在致癌物的蘇丹紅I號色素，向消費(fèi)者和貿(mào)易機(jī)構(gòu)發(fā)出了警示，禁用產(chǎn)品目錄中的蘇丹紅I號。2005年2月，英國食品標(biāo)準(zhǔn)署下令將亨氏、聯(lián)合利華等30家企業(yè)生產(chǎn)的可能含有蘇丹紅I號的400余種食品召回，弓l發(fā)了全球的"蘇丹紅"風(fēng)暴。我國自2005年3月開始，也相繼在辣椒調(diào)味品、雞蛋、鴨蛋、番茄醬等食品中發(fā)現(xiàn)蘇丹紅(孫文匯等，蘇丹紅與食品安全，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(4):103-105)。不僅是食品，2007年2月6日，國家質(zhì)檢總局對外發(fā)布了最新的唇膏、口紅產(chǎn)品的質(zhì)量專項(xiàng)抽査結(jié)報(bào)告，發(fā)現(xiàn)3種蘇丹紅首現(xiàn)國產(chǎn)唇膏的結(jié)果使得蘇丹紅的陰影蔓延到了化妝品領(lǐng)域。因此，蘇丹紅已經(jīng)成為人類健康的一個(gè)潛在危險(xiǎn)，對它的認(rèn)識、研究和檢測是非常必要，而且刻不容緩的(王繼臣和楊繼遠(yuǎn)，蘇丹紅的毒性及檢測，商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,7(2):97-99)。目前，對蘇丹紅的檢測方法主要是高效液相色譜分析法。將含有蘇丹紅成分的待測物經(jīng)乙腈提取后，以波長可變的紫外可見光度檢測器檢測，可以定性定量地對食品中的蘇丹紅含量進(jìn)行測定。2005年3月29日，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和國家標(biāo)準(zhǔn)委聯(lián)合發(fā)布《食品中蘇丹紅染料的檢測方法一高效液相色譜法》(國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T19681-2005))，用于我國的各食品用品中蘇丹紅的檢測。另外，還有薄層色譜-紫外可見分光光度法(龐艷玲和王懷友，薄層色譜-紫外可見分光光度法測定食品中的蘇丹紅I號，分析實(shí)驗(yàn)室，2008，27(1):60-62)。色譜分析法確實(shí)能準(zhǔn)確地定量分析出食品中的蘇丹紅殘留，且靈敏度較高，但是其儀器成本高，實(shí)驗(yàn)樣品處理步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于大批量的樣品檢測。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)具有樣品操作便捷、成本低廉、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能更好地運(yùn)用于蘇丹紅和對位紅添加劑量的快速檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可以單獨(dú)或者同時(shí)定性和定量檢測蘇丹紅I和對位紅及其含量的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供該單克隆抗體在作為檢測蘇丹紅I和對位紅殘留的用途。本發(fā)明利用蘇丹紅I和對位紅在結(jié)構(gòu)上的部分相似性，采用蘇丹紅衍生物即羧基蘇丹紅作為半抗原與常規(guī)蛋白載體偶聯(lián)得到相應(yīng)的免疫抗原和包被抗原，制備出可以同時(shí)識別蘇丹紅I和對位紅的單克隆抗體，并建立定性和定量檢測蘇丹紅I和對位紅及其含量的酶聯(lián)免疫間接競爭測定法。首先，本發(fā)明提供一種蘇丹紅衍生物與常規(guī)蛋白載體偶聯(lián)得到的免疫抗原和包被抗原(即檢測抗原)免疫抗原由羧基蘇丹紅分別與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)反應(yīng)，再與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)的復(fù)合物。包被抗原(即檢測抗原)由羧基蘇丹紅分別與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)反應(yīng)，再與卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)的復(fù)合物。蛋白載體除了與BSA、OVA偶聯(lián)外，還可以與人血清的蛋白(HAS)和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)等偶聯(lián)。本發(fā)明用到的一株雜交瘤細(xì)胞株SU-211-10，保藏在CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:C200813，是骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與產(chǎn)生抗羧基蘇丹紅抗體的Balb/C小鼠B淋巴細(xì)胞融合后篩選獲得的細(xì)胞株，所述的B淋巴細(xì)胞來自于上述羧基蘇丹紅-BSA免疫的Balb/C小鼠。本發(fā)明所述的單克隆抗體是由上述雜交瘤細(xì)胞株SU-211-10(CCTCCNO:C200813)產(chǎn)生的，對蘇丹紅I和對位紅具有特異性結(jié)合的特點(diǎn)，屬于IgGl類抗體，最高抗體效價(jià)達(dá)到6.4X105。所述的單克隆抗體是將雜交瘤細(xì)胞株SU-211-10(CCTCCNO:C200813)接種Balb/C小鼠腹腔后，從產(chǎn)生的腹水中純化獲得的免疫球蛋白。本發(fā)明的提供一種基于上述方法制備的抗原及其單克隆抗體特性適用于定性和定量檢測蘇丹紅I和對位紅及其含量的酶聯(lián)免疫測定(ELISA)方法。本發(fā)明所述的一種檢測蘇丹紅I和對位紅及其含量的方法，優(yōu)先為間接競爭ELISA方法，樣品中的蘇丹紅I和對位紅可以與包被抗原(羧基蘇丹紅-OVA)對有限量的抗體發(fā)生競爭性結(jié)合，根據(jù)其吸光度的數(shù)值可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品中蘇丹紅I和對位紅的含量。該方法的靈敏度可以達(dá)到蘇丹紅I的ICso值為0.8ug/L、對位紅的IC5o值為4.0ug/L。圖1是羧基蘇丹紅-BSA抗原紫外吸收光譜；圖2是羧基蘇丹紅-OVA抗原紫外吸收光譜；圖3是單抗腹水與蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品競爭ELISA曲線，腹水稀釋50000倍；圖4是單抗腹水與對位紅標(biāo)準(zhǔn)品競爭ELISA曲線，腹水稀釋100000倍；具體實(shí)施例方式本發(fā)明人對蘇丹紅I和對位紅的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，擬利用蘇丹紅衍生物即羧基蘇丹紅在結(jié)構(gòu)上與蘇丹紅I和對位紅存在的部分相似性，以此作為半抗原與常規(guī)蛋白載體BSA偶聯(lián)得到相應(yīng)的免疫抗原(羧基蘇丹紅-BSA)，免疫Balb/C小鼠，將其脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，獲得了能分泌抗羧基蘇丹紅抗體的雜交瘤細(xì)胞株SU-211-10(CCTCCNO:C200813),再將該細(xì)胞株接種Balb/C小鼠腹腔后，從產(chǎn)生的腹水中經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨方法純化獲得免疫球蛋白IgGl。用羧基蘇丹紅偶聯(lián)蛋白載體OVA獲得的羧基蘇丹紅-OVA作為包被抗原，包被于聚乙烯酶標(biāo)板，用一定量的上述單克隆抗體與蘇丹紅I或?qū)ξ患t進(jìn)行間接競爭ELISA反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，間接競爭ELISA反應(yīng)在檢測蘇丹紅I或?qū)ξ患t時(shí)其靈敏度分別為間接競爭ELISA反應(yīng)在檢測蘇丹紅I或?qū)ξ患t時(shí)其ICso值分別為蘇丹紅I號0.8ug/L、對位紅4.0ug/L。與蘇丹紅II、III、IV號的交叉反應(yīng)率為1.24%~2.12%，與其他同類食品添加劑的交叉反應(yīng)率均小于0.2%。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本
發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一歩說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。材料(1)試劑羧基蘇丹紅購于廣州創(chuàng)偉生物科技有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、聚乙二醇PEG4000、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購于美國SIGMA公司；HAT(次黃嘌呤、氨甲喋呤、胸腺嘧啶核苷)、新生小牛血清為美國GIBCO公司產(chǎn)品；RPMI-1640干粉劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；鄰苯二胺(OPD，購自上海華美公司)；二甲基亞砜為美國Amersham-Phamacia公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為Difco進(jìn)口分裝產(chǎn)品。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。(2)實(shí)驗(yàn)器材和設(shè)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC，USA)，酶標(biāo)板(COSTAR，USA),二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO,JAPAN),光學(xué)顯微鏡(OLYMPUSBH-2，JAPAN)、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,JAPAN)、酶標(biāo)儀(PowerWaveXS，美國Bio-Tek公司，)-30°。和-80°(:冰箱(SANYO,JAPAN)、高速離心機(jī)(日本HITACHI20PR-52D)、恒溫振蕩器(太倉市醫(yī)療械廠，TH2-95型)、臺(tái)式離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所，TL5.0型)、超凈工作臺(tái)(上海上凈凈化設(shè)備有限公司)等。(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/C小鼠，46周齡雌性，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(4)其他細(xì)胞培養(yǎng)和ELISA實(shí)驗(yàn)和試劑配制按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，主要參考材料為《當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用》(巴德年，1998，北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社)、《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第2版)》(沈關(guān)心、周汝麟主編，2002，湖北科學(xué)技術(shù)出版社)等。實(shí)施例l:抗原的合成羧基蘇丹紅分子結(jié)構(gòu)式如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>100-mL燒杯中加入140mg羧基蘇丹紅溶于3mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，邊攪拌邊加入103.2mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和75mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫?cái)嚢柽^夜。次日離心除去沉淀，取上清液備用。另取100-mL燒杯，加入5mL0.1mol/LPBS(pH7.2)、340mgBSA，置于磁力攪拌器上攪拌，加入0.5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)至BSA溶解，然后邊攪拌邊緩慢滴加入上述上清液，將燒杯口密封，4'C下攪拌反應(yīng)4h。離心后除去沉淀，將上清液裝入透析膜于4'C下用生理鹽水透析3天，每天換液2次，以去除未反應(yīng)的DMF、DCC、NHS和羧基蘇丹紅小分子化合物。最后得到羧基蘇丹紅-BSA抗原溶液，小瓶分裝，凍干后保存于-2(TC冰箱中，供免疫用。將上述牛血清白蛋白(BSA)換成卵清白蛋白(OVA)即得到羧基蘇丹紅-OVA偶聯(lián)物?？乖b定(1)肉眼觀察羧基蘇丹紅-BSA抗原、羧基蘇丹紅-OVA抗原外觀為紅色；(2)利用紫外吸收光譜掃描鑒定抗原為我們所需要的抗原。實(shí)施例2:單克隆抗體的制備(1)動(dòng)物免疫將10只雌性Balb/C小鼠分化2組，免疫組為5只，陰性對照組為5只。羧基蘇丹紅I-BSA免疫抗原用生理鹽水稀釋，每次小鼠的免疫劑量為50ug/只。免疫程序采用2次基礎(chǔ)免疫以及3次加強(qiáng)免疫，每次免疫間隔時(shí)間為15天。第一次基礎(chǔ)免疫用福氏完全佐劑乳化抗原進(jìn)行免疫，采用小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射；第二次基礎(chǔ)免疫和以后兩次加強(qiáng)免疫用福氏不完全佐劑乳化抗原，采用小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射或腹腔內(nèi)注射；最后一次加強(qiáng)免疫用不加佐劑的抗原，釆用小鼠尾靜脈或腹腔內(nèi)注射。每次加強(qiáng)免疫后第5天，小鼠尾部靜脈采血，分離得血清，采用抗原包被的間接ELISA法檢測血清的抗體效價(jià)。制備單克隆抗體的小鼠是選擇最后一次免疫后，取抗體效價(jià)最高的Balb/C小鼠。(2)細(xì)胞融合以及雜交瘤細(xì)胞的篩選飼養(yǎng)細(xì)胞的制備在細(xì)胞融合當(dāng)天，取Balb/C小鼠頸椎脫臼法處死，70%酒精浸泡后，用眼科剪刀剪開小鼠腹部皮膚，在腹腔內(nèi)注射10ml的1640培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次后，吸回所有的液體，放入離心管內(nèi)，3000rpm離心10min，細(xì)胞沉淀用HAT-1640完全培養(yǎng)液懸浮，混勻后加入96孔培養(yǎng)板100ul/孔。脾臟細(xì)胞的獲得免疫小鼠以頸椎脫臼法處死，70%酒精浸泡后，將小鼠放于紙上，右側(cè)臥左側(cè)向上，用鑷子提取小鼠的腹壁，用眼科剪刀圍繞脾臟外面作一個(gè)"U"形切口，用鑷子提起脾臟，剪斷脾血管和結(jié)締組織，分離脾臟放入培養(yǎng)皿中，加少量冷Gey液，用鑷子輕輕刮擠脾臟，讓脾細(xì)胞釋放出來(或用組織研磨器研磨成脾細(xì)胞懸液)，取上清液于試管中，調(diào)整細(xì)胞濃度為107/ml(每只脾臟約加35mlGey液)，4'C冰箱備用。融合細(xì)胞的制備小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0提前復(fù)蘇，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天細(xì)胞處于對數(shù)生長期。將SP2/0細(xì)胞與上述獲得的免疫小鼠脾臟細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)1:5的比例在50ml離心管中混勻，1000卬m離心10min，棄上清液，將離心管置于37。C水浴鍋中保溫，邊搖晃邊緩慢滴加37'C預(yù)熱的5(mPEG-1640培養(yǎng)液lml，在lmin內(nèi)完成，繼續(xù)搖晃30sec，靜置lmin。然后邊搖晃邊緩慢滴加37。C預(yù)熱的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液10ml，在5min左右加完。輕輕混勻，最后緩慢加入30ml的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1000卬m離心10min，棄上清液，于37。C水浴鍋中保溫5min。加入HAT-1640完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種入上述加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板100ul/孔，然后放置37'C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的篩選按照上述方法制備好飼養(yǎng)細(xì)胞，加入96孔培養(yǎng)板100u1/孔。取出融合細(xì)胞培養(yǎng)板，將存活下來的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔中輕輕吹打并吸出，計(jì)數(shù)后用1640完全培養(yǎng)液稀釋至5、10、50個(gè)細(xì)胞/ml，分別接種入上述加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板100ul/孔，使培養(yǎng)孔中的雜交瘤細(xì)胞數(shù)平均每孔分別為0.5、1、5個(gè)細(xì)胞/孔，然后放置37。C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞的生長情況，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔的1/2時(shí)，取上清液進(jìn)行間接ELISA方法測定，檢測是否產(chǎn)生抗體及其效價(jià)和特異性。從抗體陽性的培養(yǎng)孔中，選擇抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)、且細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞孔，繼續(xù)進(jìn)行再克隆，獲得單克隆抗體分泌細(xì)胞株，大量培養(yǎng)后，分裝小管凍存于液氮中。(3)腹水誘生和抗體純化腹水的誘生取Balb/C小鼠數(shù)只，在接種雜交瘤細(xì)胞前10天左右，每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml滅菌液體石蠟油。同時(shí)將單克隆抗體分泌細(xì)胞株置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對數(shù)期，1000rpm離心10min，取沉淀用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1Xl()6個(gè)細(xì)胞/ml，在上述小鼠腹腔內(nèi)接種0.5ml的雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部明顯腫大后，用酒精棉球消毒腹部皮膚，用5ml注射器抽取腹水，將腹水4t、1000rpm離心10min，取上清，分裝后-3(TC保存?zhèn)溆??？贵w的純化取10ml上述制備的腹水，加入20ml0.06mol/L醋酸緩沖液，用lmol/LNaOH調(diào)pH至4.8，室溫下邊攪拌邊逐滴加入330ul辛酸，繼續(xù)攪拌30min，然后4。C下靜置2h。然后溶液4。C下，1000rpm離心30min，棄沉淀，在上清液中加入3ml0.1MPBS(pH7.4)，混勻后，用lmol/LNaOH調(diào)pH至7.2。在4'C下，在溶液中邊攪拌邊緩慢加入飽和硫酸銨27ml，使硫酸銨的最終飽和度為45%，繼續(xù)攪拌30min，然后4'C靜置lh以上。8000rpm離心30min，棄上清，沉淀重懸于3ml0.01M，PBS(pH7.4)中，然后置于0.01MPBS中透析，4。C透析2天，其間換水4次以上。透析過的溶液，8000rpm離心30min，除去不溶性沉渣，分裝小管lml/管后-8(TC凍存?zhèn)溆?。?shí)施例3:單克隆抗體的鑒定——間接ELISA方法(1)最佳抗原包被濃度和抗體最適稀釋倍數(shù)(工作濃度)的確定采用間接ELISA檢測方法的棋盤滴定試驗(yàn)進(jìn)行，以吸光度值(OD)約為1.0左右的點(diǎn)為參照點(diǎn)，綜合考慮抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)等因素，最后確定最佳抗原包被濃度和抗體最適稀釋倍數(shù)(即工作濃度)。間接ELISA檢測方法的操作程序取96孔酶標(biāo)板，每孔加入用包被緩沖液稀釋的包被濃度的包被抗原羧基蘇丹紅-OVA100ul，4'C包被過夜后，用洗滌液0.05y。PBST洗板3次，每孔加入封阻液300ul，37。C封阻lh，取出洗板3次，每孔加入稀釋的蘇丹紅腹水100ul，37'C反應(yīng)lh，洗板5次后，加入二抗(兔抗鼠酶標(biāo)抗體，1:5000稀釋)，37X:反應(yīng)lh。洗板5次后，每孔加入底物顯色液100ul，37'C避光顯色20min。最后加入終止液50ul終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD值(490nm)。操作步驟在96孔酶標(biāo)板上的第一列包被8ug/孔的包被原，第二至第六列依次包被4、2、1、0.5、0.25ug/孔的包被原，4。C過夜。次日，用洗滌液0.05%PBST洗滌3次，5%脫脂乳封閉液37°(:封閉lh，洗滌2次，拍干。在酶標(biāo)板的第一行至第八行依次加入100u1稀釋倍數(shù)為1,000、2,000、4,000、8,000、16,000、32,000、64,000、128,000的蘇丹紅腹水溶液，37'C孵育lh，洗滌5次，拍干。各孔加入100yl兔抗鼠酶標(biāo)二抗，37'C孵育lh，洗滌5次，拍干。各孔加入100ul底物顯色液，避光顯色15min，加入50ul終止液，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定光密度值。結(jié)果見表l。表1最佳抗原包被濃度和抗體最適工作濃度的滴定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果說明OD值在l.O左右的抗原包被量為4lig/孔、2ug/孔；蘇丹紅腹水最適稀釋倍數(shù)范圍在32,000128,000倍。(2)HRP標(biāo)記兔抗鼠酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)(工作濃度)的確定以實(shí)施例3的步驟(1)確定的抗原包被濃度和蘇丹紅腹水濃度為參照，并以商品HRP標(biāo)記兔抗鼠抗體推薦的工作濃度為參照，設(shè)計(jì)稀釋倍數(shù)為2,500、5,000、10,000三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。操作步驟在96孔酶標(biāo)板上從第1列到第6列包被抗原，包被量依次間隔為4wg/孔、2ug/孔，4'C過夜。次日洗板3次，用5%脫脂乳封閉液37。C封閉lh，洗滌2次，拍干。在酶標(biāo)板的第一行至第八行依次加入100u1稀釋倍數(shù)為40，000、60,000、80,000、100，000的蘇丹紅腹水溶液(每個(gè)稀釋度設(shè)兩個(gè)復(fù)孔)，37'C孵育lh，洗滌5次，拍干。按設(shè)計(jì)表加入不同稀釋倍數(shù)的HRP標(biāo)記兔抗鼠酶標(biāo)二抗，每孔100yl，37t:孵育lh，洗漆5次，拍干。各孔加入100u1底物顯色液，避光顯色15min，加入50y1終止液，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定光密度值。結(jié)果見表2。表2HRP標(biāo)記兔抗鼠羊酶標(biāo)二抗最佳工作濃度試驗(yàn)測定結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果說明OD值在1.0左右的最佳HRP標(biāo)記兔抗鼠抗酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為5000倍；最佳包被濃度為2"g/L，蘇丹紅腹水最佳稀釋倍數(shù)為60,000100,000倍。實(shí)施例4:蘇丹紅I和對位紅間接競爭ELISA檢測方法的建立從酶標(biāo)二抗的最適工作濃度、包被原的包被濃度、抗體的工作濃度及工作量、競爭反應(yīng)時(shí)間等方面確定了ELISA最佳反應(yīng)條件，建立了蘇丹紅I和對位紅間接競爭ELISA方法。(1)蘇丹紅I競爭ELISA檢測方法蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品間接競爭ELISA的程序與間接ELISA程序大部分相同，不同之處是在封阻并且洗板3次后，將蘇丹紅腹水原液稀釋50,000倍，蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到0ug/L，0.01ug/L，0.03ug/L，0.1ug/L，0.3ug/L，0.9ug/L六個(gè)濃度梯度。在一個(gè)孔中加入50ul蘇丹紅腹水稀釋液和50ul蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，37。C溫育lh。0.05%PBST洗5遍后，加入二抗(兔抗鼠酶標(biāo)抗體，1:5000稀釋)，37。C溫育lh。0.05%PBST洗5遍，加底物顯色液，充分顯色后，加入終止液2MH2S0450ul/孔，酶標(biāo)儀490nm波長讀數(shù)。_表3蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品的酶標(biāo)孔光密度值測定結(jié)果_蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品競爭ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)對位紅競爭ELISA檢測方法對位紅標(biāo)準(zhǔn)品間接競爭ELISA的程序與蘇丹紅I間接競爭ELISA程序類似，不同之處是將蘇丹紅腹水原液稀釋100,000倍，對位紅標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到Oug/L，0.1ug/L，0.3ug/L，0.9ug/L，2.7ug/L，8.1ug/L六個(gè)濃度梯度。在一個(gè)孔中加入50ul蘇丹紅腹水稀釋液和50ul對位紅標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，其余步驟均一致。表4對位紅標(biāo)準(zhǔn)品的酶標(biāo)孔光密度值測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.4470.4430.4230.3650.2620.203OD平均值0.4380.4320.4180.3740.2600.202(3)單抗腹水的特異性鑒定選擇蘇丹紅II、III、IV號和四種常用添加劑(克倫特羅、孔雀石綠、結(jié)晶紫、胭脂紅)，進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。計(jì)算ICsc值和交叉反應(yīng)率。結(jié)果見表5。ICso值為各標(biāo)準(zhǔn)品最大信號值降低50%所對應(yīng)的待測物濃度。交叉反應(yīng)率(CR%)=蘇丹紅I的ICso值/測試物質(zhì)的ICso值X100%。表5單抗腹水與不同待測物的ICso值和交叉反應(yīng)率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1.一種單克隆抗體的制備方法，其特征在于以蘇丹紅衍生物與牛血清白蛋白交聯(lián)的復(fù)合物作為免疫抗原，將免疫抗原免疫Balb/C小鼠，將小鼠的致敏脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞株注射于小鼠腹腔生產(chǎn)單克隆抗體，其中，間接ELISA篩選中使用的包被抗原是指蘇丹紅衍生物與卵清白蛋白交聯(lián)的復(fù)合物，蘇丹紅衍生物為羧基蘇丹紅。2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于免疫抗原是由羧基蘇丹紅分別與N-羥基琥珀酰亞胺NHS和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺DCC反應(yīng)，再與牛血清蛋白偶聯(lián)的復(fù)合物。3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包被抗原是由羧基蘇丹紅分別與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)反應(yīng)，再與卵清白蛋白偶聯(lián)的復(fù)合物。4.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于雜交瘤細(xì)胞株SU-211-10，保藏在CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:C200813。5.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體采用間接競爭ELISA檢測法檢測蘇丹紅I殘留的應(yīng)用。6.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體采用間接競爭ELISA檢測法檢測對位紅殘留的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體采用間接競爭ELISA檢測法同時(shí)檢測蘇丹紅I和對位紅殘留的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備及其用途，具體說涉及一種適用于同時(shí)檢測蘇丹紅I和對位紅殘留的單克隆抗體的制備及其用途，屬于免疫化學(xué)分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以蘇丹紅衍生物與牛血清白蛋白交聯(lián)的復(fù)合物作為免疫抗原，將免疫抗原免疫Balb/C小鼠，將小鼠的致敏脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞株注射于小鼠腹腔生產(chǎn)單克隆抗體。本發(fā)明的提供一種基于上述方法制備的抗原及其單克隆抗體特性適用于定性和定量檢測蘇丹紅I和對位紅及其含量的酶聯(lián)免疫測定(ELISA)方法。文檔編號G01N33/531GK101393218SQ20081020146公開日2009年3月25日申請日期2008年10月21日優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日發(fā)明者愷李,冰杜,磊汪,群王,旻錢,韓紅輝,顧虹潔申請人:華東師范大學(xué)