專利名稱：三聚氰胺免疫層析試紙檢測方法
技術領域：
屬于食品安全檢測領域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測方法，特別
是一種三聚氰胺試紙檢測方法。
背景技術：
三聚氰胺(英文名Melamine)，簡稱三胺，又叫2 ， 4 ， 6-三氨基-1， 3, 5-三嗉、1， 3, 5-三嗪-2， 4, 6-三胺、2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰 脲三酰胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，是重要的氮雜環(huán)有機化工 原料。三聚氰胺分子式C美H6、 C3N3(NH2)3，分子量126. 12。
在食品的生產(chǎn)和銷售過程中，需要測定食品的蛋白質(zhì)含量，而直接測 量蛋白質(zhì)技術上比較復雜，所以通常采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，即 通過測定食品中氮的含量來間接推算蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺與蛋白 質(zhì)相比含有更多的氮原子，所以添加在食品中的三聚氰胺可以造成食品蛋 白質(zhì)含量較高的假象，因而被不法商販所利用。三聚氰胺被攝入人體后， 通過小腸吸收進入血液循環(huán)并最終進入腎臟，形成腎結石，尤其對于哺乳 期的嬰兒，更容易造成結石。
目前主要采用儀器檢測的方法檢測三聚氰胺。主要方法有GC-MS法、 Spectra-Quad在線檢測、超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法、反相高效 液相色譜法、高效液相色譜-二極管陣列法、高效液相色譜法(HPLC)、高效 液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用、固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用、液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜法(LC-MSMS)等。這些儀器方法價格昂貴，且方法操作復雜，需受過
專門訓練的人員才能操作，而且存在著適用范圍窄、設備昂貴、成本高等 問題。目前本技術領域還沒有一種特異性強、靈敏度高、且操作簡單方便、 適宜快速的現(xiàn)場檢測和大規(guī)模普查的要求的乳制品中三聚氰胺檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種特異性強、靈敏 度高、且操作簡單方便，對樣品經(jīng)過簡單處理即可檢測的三聚氰胺快速試 紙半定量檢測方法。
本發(fā)明的目的可通過以下技術方案來實現(xiàn)。
三聚氰胺免疫層析試紙檢測方法其技術要點是試紙的被襯上依次貼 有樣液吸收部分和膠體金標記部分和檢測反應部分和吸水部分，膠體金標 記部分被標記的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白與三聚氰胺檢測用抗原的混合物 或第二種屬動物蛋白與三聚氰胺抗體的混合物；檢測反應部分上面包被有 三聚氰胺抗體1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1 條作為參考線或包被有三聚氰胺檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被 有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條作為參考線。在試紙制備時通過調(diào)節(jié)檢 測線和參考線包被物的濃度，控制檢測時檢測線和參考線的顯色深淺，并 將其顯色深淺與標準物質(zhì)濃度對應起來，達到半定量檢測。
所述的檢測用抗原是指三聚氰胺與載體物質(zhì)明膠形成的偶合物，免疫 用抗原是指三聚氰胺與載體物質(zhì)匙孔血藍蛋白(KLH)形成的偶合物。
所述的載體物質(zhì)也可以選用其他大分子物質(zhì)，如脂蛋白、多聚氨基 酸、葡聚糖、卵清白蛋白等，但要求檢測用抗原與免疫用抗原的載體無交
叉免疫反應。
所述的第二種屬動物蛋白指非抗體來源屬動物的蛋白，例如，抗體為 兔源性，則第二種屬動物蛋白可以是卵清白蛋白、豬血清白蛋白等雞、豬 或其他非兔源性動物蛋白。
本發(fā)明所描述的試紙的各部分處理與功能如下
被襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支 持試紙其他組成部分的作用。
樣液吸收部分制備將濾紙或玻璃纖維紙浸入PH7. 0-8. 4的PBS中
2min，取出，8(TC烘干或其他方式干燥，即作為樣液吸收部分，檢測時起 吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動。
膠體金標記部分的制備該部分起固定膠體金標記的抗原或抗體的作
用。制備步驟包括膠體金溶液的制備、膠體金標記三聚氰胺抗原或三聚氰 胺抗體、膠體金標記部分處理。
(1) 膠體金溶液的制備將氯金酸(HauCl.O用超純水配制成1%的母 液，取lmL的母液，用超純水定容至100niL，配成0.01%的溶液，加熱至沸 騰，加入l-5mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱至出現(xiàn)透明的橙紅色為 止，即為膠體金溶液。
(2) 膠體金標記三聚氰胺抗原將三聚氰胺檢測用抗原和第二種屬動 物蛋白分別用PBS(O. 01mol/L， pH7. 0-7. 5)溶解稀釋至2-4mg/mL，每100mL 膠體金溶液加入1-3mL 2-4 mg/mL的檢測用抗原和1-1. 5mL 2-4 mg/mL第 二種屬動物蛋白震蕩2min，用0. 2mol/L的&(:0:,調(diào)節(jié)pH至8. 4，震蕩5min，
加入11% PEG-10000 2mL，震蕩5min， 8000-15000r/min離心15min，除去 上清，將沉淀用PBS (0. 01mol/L， pH7.0-7. 5)復溶，以6000-13000r/min 離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(O. 01mol/L，pH7. 0-7. 5)稀釋500-2000 倍，產(chǎn)物作為金標記三聚氰胺抗原(GAg)。
(3) 膠體金標記三聚氰胺抗體將三聚氰胺單克隆抗體或多克隆抗體 和第二種屬蛋白分別用PBS(O. 01mol/L，pH7. 0-7. 5)溶解稀釋至2-4mg/mL， 每100mL膠體金溶液加入l-3mL 2-4 mg/mL的三聚氰胺抗體和H. 5mL 2-4mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2min，用0. 2mol/L的&(:03調(diào)節(jié)pH至 8.4，震蕩5min，加入11% PEG-10000 2mL，震蕩5min， 8000-15000r/min 離心15min，除去上清，將沉淀用PBS (0.01mol/L， pH7. 0-7. 5)復溶，以 6000-13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS (0. 01mol/L， pH7. 0-7.5)稀釋500-2000倍，產(chǎn)物作為金標三聚氰胺抗體(GAb)。
(4) 膠體金標記部分處理將GAg或GAb倒入一槽中，將玻璃纖維或 濾紙浸入lmin，取出，室溫干燥后，即作為膠體金標記部分。
檢測反應部分制備用0. 8%的戊二醛溶液或0. 2%的碳二亞胺溶液浸泡 硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30min，取出，37。C烘干，上邊包被1 條不同濃度的三聚氰胺檢測用抗原線或三聚氰胺抗體線作為檢測線，同時 包被1條抗第二種屬動物蛋白的IgG線作為參考線。當膠體金標記部分標 記對象為三聚氰胺抗體和第二種屬動物蛋白時，檢測線則包被三聚氰胺檢 測用抗原；當膠體金標記部分標記對象為三聚氰胺檢測用抗原和第二種屬 蛋白時，檢測線則包被三聚氰胺抗體。此即為檢測反應部分，該部分主要
作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。
吸水部分制備將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫干燥后，即作為吸 水部分。該部分主要作用在于將移動上來的多余的樣品溶液吸收。
試紙組裝在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測 反應部分和吸水部分，即成三聚氰胺檢測試紙。
檢測原理檢測原理因膠體金標記的對象不同，而稍有差異。
當膠體金標記部分標記對象為三聚氰胺檢測用抗原和第二種屬動物蛋 白時，如果樣品中含有三聚氰胺，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并 通過毛細作用上移，樣品中的游離三聚氰胺分子量小移動速度快，先到達 檢測線，先與檢測線上包被的三聚氰胺抗體結合，因檢測線上包被的三聚 氰胺抗體只有特定的結合位點，而且樣品中游離的三聚氰胺結合能力比偶 合態(tài)的三聚氰胺檢測用抗原強，于是膠體金標記的檢測用抗原不能再被檢 測線上的三聚氰胺抗體捕獲，于是檢測線無色，此即為陽性；如果樣品中 無三聚氰胺，則膠體金標記的三聚氰胺檢測用抗原到達檢測線后就被檢測 線上包被的三聚氰胺抗體捕獲，形成肉眼可見的紅色，此即為陰性。無論 樣品中是否含有三聚氰胺，膠體金標記的第二種屬動物蛋白上移到達參考 線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見 的紅色，此即為參考線。
當膠體金標記部分標記對象為三聚氰胺抗體和第二種屬動物蛋白時， 如果樣品中含有三聚氰胺，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并通過毛 細作用上移到達膠體金標記部分，樣品溶液中的三聚氰胺與膠體金標記的
三聚氰胺抗體反應形成結合物，結合物繼續(xù)上移到檢測線，因膠體金標記 的三聚氰胺抗體只有特定的結合位點，樣品溶液中的三聚氰胺與之結合后， 檢測線上的檢測用抗原就不能再與膠體金標記的三聚氰胺抗體結合，于是 檢測線無色，此即為陽性；當樣品中沒有三聚氰胺時，膠體金標記的三聚 氰胺抗體到達檢測線時被檢測用抗原捕獲，則形成肉眼可見的紅色。無論 樣品中是否含有三聚氰胺，膠體金標記的第二種屬蛋白上移到達參考線時 都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅 色，此即為參考線。
以上兩種方式的試紙，在試紙制備時通過調(diào)節(jié)檢測線和參考線包被物 濃度，控制檢測時檢測線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺與標準物 質(zhì)濃度對應起來，即可達到半定量檢測目的。
本發(fā)明所具有的有益效果
① 特異性強。能特異性識別樣品中的三聚氰胺。
② 靈敏度高。本試紙條的最低檢測下限為5ug/kg。盡管我國尚未規(guī) 定食品中三聚氰胺的殘留限量，但本試紙條的最低檢測下限已經(jīng)大大低于 乳制品或其他食品中三聚氰胺的有意義的摻假量。
③ 能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測。本試紙可根據(jù)檢測線顏色與參考線顏色對比 達到半定量檢測目的。
④ 操作簡單方便。對液態(tài)乳制品可直接檢測，對固態(tài)或粉末狀食物樣 品經(jīng)溶解或簡單處理后即可檢測。本試紙不需專業(yè)培訓，不需要任何復雜 儀器設備，普通非專業(yè)人員即可檢測。
附圖為本發(fā)明檢測試紙的結構示意圖。圖中1為樣液吸收部分、2為 膠體金標記部分、3為檢測反應部分、4為檢測線、5為參考線、6為吸水部分。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述 1條檢測線+ 1條參考線形式的試紙
檢測線包被有濃度為0. l-30ug/mL的三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰 胺檢測用抗原l條，寬lmm;參考線包被有濃度為O. l-30pg/mL的抗第二 種屬動物蛋白的IgGl條，寬lmm;兩條線之間間隔2-6mm。當檢測線顏色
與參考線顏色相同時，則樣品為陰性；當檢測線比參考線顏色淺時，則樣 品為陽性，濃度大于A ug/kg， A為設定的檢測線，可以是大于或等于5 "g/kg的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
下面進一步說明
三聚氰胺偶合抗原合成
三聚氰胺偶合抗原分為免疫用抗原和檢測用抗原，前者用于免疫動物， 后者用于抗體制備中抗體的檢測和試紙制備中的膠體金標記或檢測線包被。
免疫用抗原制備采用戊二醛做交聯(lián)劑，使匙孔血藍蛋白(KLH)載體 和小分子半抗原三聚氰胺的氨基以共價鍵連接合成免疫全抗原。將200 mg 三聚氰胺溶于30 mL的吡啶中，取400 mg KLH溶于25 mL 0. 01 mol/L的
PBS(pH7.2)中，將三聚氰胺溶液在攪拌下緩慢加入KLH溶液中，再緩慢滴 入0. 40 mL 25%戊二醛溶液，室溫攪拌反應4 h后，在4。C下將合成產(chǎn)物用 0.01 mol *L-1 PBS (pH7. 2)透析3天，每天更換透析液4次，以除去未反 應的小分子物質(zhì)如戊二醛、三聚氰胺等。凍干后即可獲得三聚氰胺-KLH全 抗原。
檢測用抗原用明膠代替KLH，采用與三聚氰胺-KLH合成相同的步驟， 將三聚氰胺與明膠偶聯(lián)合成檢測用抗原三聚氰胺-明膠。 三聚氰胺多克隆抗體的制備
選擇體重2 kg左右的雄性新西蘭兔4只，應用免疫抗原三聚氰胺-KLH， 采用常規(guī)免疫程序免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。具體步驟為將 制備的免疫抗原用1%鹽水溶解，與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，使免 疫抗原終濃度為2 mg/mL。于兔子背部皮下注射，每只注射1 mL。兩周后， 用不完全弗氏佐劑取代完全弗氏佐劑按上述同樣方法乳化免疫抗原，乳化 后于兔足掌皮下注射，每只注射lmL。以后每7天進行一次強化免疫，每 次強化免疫采用不加任何佐劑的免疫抗原，所用免疫抗原的濃度為2 mg/mL，用量為1 mL，于兔足掌皮下注射。每次強化免疫前采用免疫沉淀 實驗檢測抗體效價，至抗體效價不再繼續(xù)升高時停止強化免疫，通常共進 行5-7次強化免疫。最后一次強化免疫后第3天即可采用頸動脈取血法收 集抗血清，辛酸-硫酸銨法純化抗體，0.01 mol/L PBS (pH7.2)透析直至 透析外液與氯化鋇反應無沉淀為止，加入終濃度為0.01%的疊氮鈉，分裝 后于-7(TC低溫保存。
樣液吸收部分處理
將濾紙或玻璃纖維紙等浸入0. lmol/L pH7. 4的PBS中2min，取出80°C 烘千或其他方式干燥，即成樣液吸收部分。 膠體金標記部分的制備和處理
膠體金標記部分的制備和處理包括膠體金溶液制備、膠體金標三聚氰 胺抗體、膠體金標記部分處理。
膠體金溶液制備將氯金酸(HAuCl4)用超純水配制成1%的母液，取 lmL的母液，用超純水定容至100mL,配成0.01%的溶液，加熱至沸騰，加 入一定量的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱到出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即 為膠體金溶液。
膠體金標記三聚氰胺多克隆抗體制備取10 mL膠體金溶液，加入10% 的K2C0:,溶液至pH7.4，然后加入120 tiL3mg/mL的三聚氰胺多克隆抗體， 室溫下磁力攪拌15 min，加入終濃度為0.2%的聚乙二醇20000，繼續(xù)攪 拌直至溶解，然后置4X:冰箱2h，于fC， 15000 rpm離心15min，在管 底可以看見流動的金標抗體沉淀，棄上清，然后用稀釋液(含8%蔗糖， 0. 05% Tween20， 0. 5%牛血清白蛋白的pH7. 4的0. 01 mol/LPBS)將沉淀恢 復到原體積，于4°C， 15000 rpm再次離心15 min，棄上清，沉淀用上述 稀釋液lmL混勻，加入疊氮鈉使終濃度為0.01%，放置在4。C冰箱備用。
膠體金標記部分處理將金標三聚氰胺多克隆抗體倒入一槽中，將玻 璃纖維紙或濾紙浸入lmin，取出，室溫干燥，即成為膠體金標記部分。
試紙檢測反應部分的處理
試紙檢測反應部分的處理
用0. 8%的戊二醛溶液或0. 2%的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜30min， 取出，37。C烘干，上邊用噴涂機噴涂包被1條三聚氰胺檢測用抗原線作為 檢測線，濃度為2" g/mL。包被1條羊抗兔免疫球蛋白的IgG線作為參考 線，濃度為2yg/mL。即為檢測反應部分。
吸水部分處理及試紙組裝
將吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。
在被襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分和 吸水部分，即成組合形式為1條檢測線+1條參考線的三聚氰胺的快速檢測試紙。
檢測液態(tài)乳制品根據(jù)樣品濃度及粘稠度用PBS溶液做適當稀釋(I-IO
倍)，所得溶液作為檢測液。然后直接將試紙檢測部分浸入檢測液2min后 取出，觀察顏色。若檢測線呈現(xiàn)紅顏色，表明樣品為陰性；若檢測線不顯 色，表明樣品中三聚氰胺含量為5 ug/kg以上。無論樣品中三聚氰胺含量
如何，參考線應該顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
固態(tài)乳制品用PBS溶液將樣品溶解并做適當稀釋(按固液比1:5-10)，
然后按液態(tài)乳制品相同方法檢測。
其他食物樣品含脂肪的樣品先去除脂肪，然后將樣品粉碎或搗碎成 粉末狀或溶解在PBS溶液中，再按照上述乳制品處理方法檢測；不含脂肪 的樣品，可直接將樣品粉碎或搗碎后，溶解在PBS溶液中，再按照上述乳 制品處理方法檢測。
權利要求
1. 三聚氰胺免疫層析試紙檢測方法，其特征在于在試紙的被襯上依次貼有樣液吸收部分和膠體金標記部分和檢測反應部分和吸水部分，膠體金標記部分被標記的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白與三聚氰胺檢測用抗原的混合物或第二種屬動物蛋白與三聚氰胺抗體的混合物；檢測反應部分上面包被有三聚氰胺抗體1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1條作為參考線或包被有三聚氰胺檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1條作為參考線。
2. 根據(jù)權利要求1所述的三聚氰胺免疫層析試紙檢測方法，其特 征在于三聚氰胺檢測用抗原為三聚氰胺與載體物質(zhì)形成的偶合物。
3. 根據(jù)權利要求2所述的三聚氰胺免疫層析試紙檢測方法，其特 征在于所述的載體物質(zhì)，為蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或合成多肽或半合成多肽或多糖。
4. 根據(jù)權利要求1所述的三聚氰胺免疫層析試紙檢測方法，其特 征在于所述的第二種屬動物蛋白為非抗體來源動物的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三聚氰胺免疫層析試紙檢測方法。該方法在試紙的被襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分及吸水部分。檢測反應部分上面包被有三聚氰胺多克隆抗體1條或檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條作為參考線。該快速檢測試紙條特異性強，能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測，環(huán)境溫度為4-40℃都可使用，適合于乳制品生產(chǎn)企業(yè)、個體養(yǎng)殖戶、食品衛(wèi)生質(zhì)監(jiān)部門、海關、超市等單位對乳制品及其他食品或飼料產(chǎn)品等可能污染三聚氰胺的食品、飼料進行快速檢測。本發(fā)明具有特異性強、靈敏度高、能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測，且操作簡單方便等有益效果。
文檔編號G01N33/558GK101387644SQ20081019709
公開日2009年3月18日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權日2008年9月27日
發(fā)明者劉志國 申請人:武漢工業(yè)學院