專利名稱：：涉及發(fā)光化合物的組合物、方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明公開而來涉及發(fā)光化合物的組合物、方法和試刑盒，具體而言，涉及一種檢測熒光素酵的酶活性的方法.
背景技術：
：報道分子通常在生物、生化、免疫、細胞生物學和分子生物學領域中用于監(jiān)測分子狀態(tài).例如，報道分子在分析中使用，其中報道分子的水平是由從與報道分子連接的特定啟動子進行轉錄而引起的.報道分子分析可以用于研究生物學過程，包括基因表達、受體活性、轉錄因子、胞內(nèi)信號傳導、mRNA處理和蛋白質折疊。通常用于這種分析的報道分子的分析包括檢測放射性同位素、酶活性、熒光或發(fā)光分析法。該技術一般由Akhavan-Tafti等在"BioluminescenceandChemiluminescence-FundamentalsandAppliedAspects*Proceedingsofthe8(hInternationalSymposiumonBioluminesceneandChemiluminescene"Cambridge,1994年9月,Campbel，Kricka,Stanley,JohnWileyandSons1994中討論*在生物分析中的發(fā)光通常涉及發(fā)光(luminogenic)蛋白質的活性，用于分析體系中的發(fā)光蛋白質包括、但不限于Renilla熒光素醉，Oplophorus熒光素酶，Vargula(Cypridina)熒光素酶，Gaussia熒光素醉和水母蛋白.在發(fā)光反應中，發(fā)光蛋白質與適宜分子(稱為發(fā)光體)之間的相互作用產(chǎn)生作為反應產(chǎn)物之一的光.可以檢測在該反應中產(chǎn)生的光量(即光子的數(shù)目).這種檢測可以用于定性地檢測在樣品中是否存在特定的物質。這種檢測還可以用于定量地計算在反應中發(fā)光蛋白質和/或發(fā)光體的濃度。發(fā)光反應可以用于檢測非常少量的特定分析物，該物質在分析中確認和檢測。例如，發(fā)光反應可以用于檢測和定量蛋白酶、脂酶、磷酶、過氣化酶、糖苷酶、各種代謝物例如ATP或NADH,和報道分子.發(fā)光反應還可以用于通過結合相互作用檢測和定量分析物，例如通過抗體和核苷酸探針介導的那些，發(fā)光反應的另一個應用是生物發(fā)光共振能量轉移(BRET),它能測定兩個分子是否能互相結合或在細胞內(nèi)共定位(Angers等，Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.A.97(7):3684—9，2000).通常，發(fā)光反應可以用于檢測在樣品中存在的小于約1x10"摩爾、通常小于lxlO"摩爾的分析物.當使用發(fā)光檢測分析物時，優(yōu)選由與分析物的存在無關的反應產(chǎn)生的光極少或沒有.例如，在通常用于Renilla熒光素酶的分析條件下，即使當發(fā)光蛋白質不存在時也通常能檢測到光.與發(fā)光蛋白質的催化活性無關的發(fā)光稱為自動發(fā)光.這種自動發(fā)光被認為是"背景"，因為它不提供關于體系的有用信息，而是對整個發(fā)光輸出有貢獻.自方法的有用性(即"信號")。如果噪音的幅度與實際信號的幅度相比是顯著的，則這是成問題的。這種檢測的不確定性可以通過信號(S)和背景(B)的幅度之比或信號/背景之比(S/B)來定量化.自動發(fā)光可以例如是由發(fā)光體的自發(fā)氣化作用引起，而且，向分析體系加入各種組分，例如類脂(特別是在臨界膠束濃度或CMC之上)、疏水性蛋白質(特別是具有特定三維結構的那些)以及含有疏水性微環(huán)境的細胞或其它生物物質，可大大提高自動發(fā)光.一類顯示自動發(fā)光性的發(fā)光體是水母水通道蛋白輔因子(coelenterazine).水母水通道蛋白輔因子與許多海生的熒光素醉相互作用，由于水母水通道蛋白輔因子氣化成各自的coelenteramide而產(chǎn)生光.如果該氧化作用通過發(fā)光蛋白質來促進，則光子與基質和蛋白質之間的相互作用對應，從而產(chǎn)生信號.水母水通道蛋白輔因子還可以對背景作出貢獻，這是因為當處于溶液中時有自發(fā)發(fā)光氣化作用，即使當不存在發(fā)光蛋白質時也是如此.除了產(chǎn)生背景之外，這種不穩(wěn)定性還會導致發(fā)光信號的壽命短.這導致需要在短時間內(nèi)檢測許多樣品的發(fā)光，進而在總體分析中引入了不確定性.已經(jīng)試圖通過改進水母水通道蛋白輔因子的發(fā)光響應來研究對水母水通道蛋白輔因子的改進.受影響的水母水通道蛋白輔因子性能包括對鈣離子(Ca")的敏感性(Shimomura等，Biochem.J.296:549-551，1993;Shimomura等，Biochem.J.261:913-920,1989);對過氣化物陰離子(02)的敏感性(Teranishi等，Anal.Biochem.249:37-43，1997);對于單獨發(fā)光蛋白質的特異性(Inouye等，Biochem，Biophys.Res.Comm.233:349-53，1997);和細胞膜的滲透作用(Shimomura,Biochem.J.326:297-298，1997).通常，衍生物與天然水母水通道蛋白輔因子的區(qū)別在于與咪唑并哌喚核結構連接的取代基的性質。盡管在特定分析環(huán)境中有改進，但是沒有報道這些改進的水母水通道蛋白輔因子能遊免自動發(fā)光的問題.所以，希望提供能直接或間接地用作發(fā)光體并能在常規(guī)使用條件下提供自動發(fā)光較少的組合物，這些組合物可以進一步顯示相對于常規(guī)發(fā)光體而言提高的穩(wěn)定性，還希望提供對不屬于發(fā)光蛋白質的物質敏感的組合物。這種組合物與這些物質的相互作用能夠將組合物轉化成發(fā)光體.這種多功能組合物因此能提供一種通過發(fā)光方法分析非發(fā)光物質或過程的方式，
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明的一個方面，提供式(XII)的化合物在該化合物中，R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH廣C晶0R";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-C^OR15;R'。是-H、-CH3、或-CH(CH丄；和R"、R14和R"獨立地是酶可除去的基團；前提是R"、R"和R"不都是乙酰基.在本發(fā)明的另一個方面，提供式(XII)的化合物，其中IT是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH廣CAOR";W是H、坑基、雜烷基或芳基；R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-C晶0R";R"是-H、-CH"或-CH(CH3)2;和R11、R"和R"獨立地是酶可除去的基團。在22TC下含有F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清的混合物中，該化合物的濃度在45分鐘后降低小于50、在本發(fā)明的另一個方面，提供式an)的化合物，其中r是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH廣C晶0R";R8是H、烷基、雜烷基或芳基；R'是H、烷基、雜烷基或-C^OR'5;R'。是-H、-CH3、或-CH(CH^;和R11、R"和R"獨立地是酶可除去的基團，除去至少一個酶可除去的基團提供了母體化合物(parentcompound)，和使在221C下含有F12培養(yǎng)基和10X胎牛血清的混合物中該化合物的濃度降低50X所需的時間大于使得在221C下在含有F12培養(yǎng)基和IOX胎牛血清的混合物中母體化合物的濃度降低50X所需的時間.在本發(fā)明的再一個方面，提供式(XIII)或(XIV)的化合物(XIII)(XIV)在該化合物中，IT是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH2-C^0R";r是H、坑基、雜烷基或芳基；R"和R"獨立地是-H、-OH、烷基、雜烷基、芳基或-0R";n是0、1或2;和R11、R"和R"獨立地是酶可除去的基團.在本發(fā)明的另一個方面，提供在溶液中含有上述化合物之一的組合物.在本發(fā)明的另一個方面，提供受保護的發(fā)光體，它是修飾的水母水通道蛋白輔因子，其中烯醇基團已經(jīng)被轉化成含有酶可除去的基團的醋或鍵；所述酶可除去基團的除去提供了母體水母水通道蛋白輔因子.使得在22TC下含有Fl2培養(yǎng)基和10X胎牛血清的混合物中的修飾的水母水通道蛋白輔因子的濃度降低50S所需的時間大于使得在221C下在含有F12培養(yǎng)基和IOX胎牛血清的混合物中母體水母水通道蛋白輔因子的濃度降低50X所需的時間.在本發(fā)明的另一個方面，提供包含受保護的發(fā)光體和發(fā)光蛋白質的試刑盒，在本發(fā)明的另一個方面，提供包舍受保護的發(fā)光體和脫保護的酶(deprotectingenzyme)的試刑盒.發(fā)光體和脫保護酶處于獨立的容器中.在本發(fā)明的另一個方面，提供一種檢測發(fā)光蛋白質的酶活性的方法，包括使發(fā)光蛋白質、脫保護的酶和受保護的發(fā)光體在溶液中接觸以形成組合物；和檢測由該組合物產(chǎn)生的光.在本發(fā)明的另一個方面，提供一種在包含熒光素醉的活細胞中產(chǎn)生發(fā)光的方法，該方法包括使溶液中的細胞與受保護的發(fā)光體接觸.在本發(fā)明的另一個方面，提供一種檢測非發(fā)光性酶的酶活性的方法，包括使非發(fā)光性酶與含有發(fā)光蛋白質和受保護的發(fā)光體的液體混合物接觸以形成組合物；和檢測由該組合物產(chǎn)生的光，具體實施例方式本發(fā)明提供通過化學方式改變發(fā)光體以獲得具有比未改變的基質更高的穩(wěn)定性的受保護發(fā)光體的方法.還提供能用作發(fā)光蛋白質的受保護發(fā)光體的各種組合物。受保護的發(fā)光體可以至少部分被轉化成發(fā)光體，使得所得的基質與發(fā)光蛋白質相互作用.受保護的發(fā)光體提供了降低的自動發(fā)光，例如在培養(yǎng)基中，且不會相似地降低在細胞內(nèi)的發(fā)光蛋白質依賴性發(fā)光.這種效應通過提高信號/背景之比幫助增加分析靈敏度.本發(fā)明的組合物用于各種分析應用中，對于使用培養(yǎng)的細胞的現(xiàn)場應用，這些組合物可以提供發(fā)光體和發(fā)光蛋白質的共定位.這些組合物可以用于檢測和定量發(fā)光分析物，這些分析物可以是基質或蛋白質.這些組合物可以進一步用于檢測和定量用于將受保護發(fā)光體轉化成發(fā)光體的酶.現(xiàn)場檢測還包括基因報告基因(reporter)的分析，例如多重報告基因，其中至少一個報告基因使用發(fā)光體.對于在有機體內(nèi)的體內(nèi)應用，共定位可以用于提供研究細胞生長.用于非發(fā)光性酶的受保護發(fā)光體的特異性可以用于檢測在特定器官、組織或細胞類型中的發(fā)光分析物，或用于檢測其中的非發(fā)光性酶.對于體外應用，可以檢測各種物質和隨時間的進程.這些分析包括例如發(fā)光蛋白質的表達，分析物的濃度，和用于將受保護發(fā)光體轉化成發(fā)光體的非發(fā)光性酶的表達.基質用于本發(fā)明的發(fā)光體包括稱為水母水通道蛋白輔因子的一類化合物，術語水母水通道蛋白輔因子定義為具有咪唑并噥喚結構的分子，其特征在于當與給定的發(fā)光蛋白質在溶液中接觸時能發(fā)光。已經(jīng)知道水母水通道蛋白輔因子當與各種發(fā)光蛋白質作用時能發(fā)光，特別是海生的熒光素酶.海生的熒光素酶的例子包括Renilla熒光素酶，水母蛋白，Gaussia熒光素醉，0plophorus熒光素醉和Cypridina熒光素酶.水母水通道蛋白輔因子的例子是下面的結構I-Ill:(I)(")(川)其中R'、R2、IT和R4獨立地是H、烷基、雜烷基、芳基或其組合.f和R'可以獨立地是H、0H、烷基、雜烷基、芳基或其組合.對于結構II，n可以是0、1或2，優(yōu)選是1.優(yōu)選R'A-CH2-C6H5、-CH2—C6H4OH、-CH2-C6H4P、CH(CH3)CH2CH3或萘基(結構IV-A),優(yōu)選R2是-CH廣C晶、-(CH2)3NHC(-N)NH2、-CH2C6H(結構IV-B)或-CH2C5H,(結構IV-C)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>優(yōu)選R3是-C晶0H、一C晶跳、-C6H5、-C晶F或吲哚基(結構V),<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(V)優(yōu)選^是H、CH]或CH(CH])2,優(yōu)選R5和W獨立地是H或0H,在這里使用的"烷基"是含有1-20、優(yōu)選1-15個碳原子的烴鏈，可以是直鏈、支鏈的或環(huán)狀的；例如-CH3、-CH2(CH2)nCH3、-(CH2)nCH(CH3)2、_(CH2)nC(CH3)3(其中n是整數(shù))，金剛烷基，和結構IV-B和IV-C。"雜烷基"是還舍有一個或多個雜原子例如0、N、S和鹵素的烷基；例如-(CH2)n-0-(CH2),CH3、-(CH2)n-C(=0)-N(CH3)2、-(CH2)3NHC(-N)NH2和-(CH丄-C(-0)OH，其中n和m是整數(shù)。"雜環(huán)"是含有2-30個碳原子和至少一個雜原子(0、N或S)的烴，使得形成含有該雜原子的環(huán)。該環(huán)可以是飽和的、部分不飽和的或芳族的，可以是被取代的。該環(huán)可以是單-、雙-或多環(huán)的.例子包括吖咬、苯并噢唑啉、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噱唑、苯并疏代苯基、呼唑、噌啉、呋喃、咪唑、1H-吲唑、吲哚、異吲哚、異喹啉、異噻唑、嗎啉、喝唑(即1，2，3-喝二唑)、吩嗪、吩嚷嗪、吩哺喚、2，3-二氮雜萘、哌嗪、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、噠嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、喹唑啉、喹啉、喹喔啉、噻唑、1，3，4-噻二唑、噱汾、1，3，5-三喚、三唑(即1，2，3-三唑)等，"芳基"是含有6-30個碳原子和至少一個芳族碳環(huán)基團的烴，任選地具有含有雜原子例如0、N或S和鹵素的取代基；例如-C晶(苯基)、-C6,、-C6H4-C6H5、-C9H7、-C6H4OCH3、-C6H4NH2、-C6H,SH、哉-。5和萘基.水母水通道蛋白輔因子包括天然水母水通道蛋白輔因子和修飾的水母水通道蛋白輔因子，可從PROMEGACORPORATION(Madison,WI)和從MOLECULARPROBES,INC(Eugene,OR)獲得，水母水通道蛋白輔因子也可以合成，例如Shimomura等在Biochem.J261:913-20，1989;Inouye等，Biochem，Biophys.Res.Co,.233:349-53，1997;和Teranishi等，Anal.Bioche邁.249:37-43，1997中所迷。天然水母水通道蛋白輔因子和修飾的水母水通道蛋白輔因子統(tǒng)稱為"水母水通道蛋白輔因子"，并用作發(fā)光蛋白質的發(fā)光體。這些發(fā)光體的具體例子包括基于在下表A中列出的結構I的那些，以及基于在下表B中列出的結構II和III的那些.具有結構VI的水母水通道蛋白輔因子統(tǒng)稱為"水母水通道蛋白輔因子"，結構VII統(tǒng)稱為"水母水通道蛋白輔因子-h"，結構VIII統(tǒng)稱為"二脫氣基水母水通道蛋白輔因子"，分別對應于表A中的笫1、2和3列.<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>水母水通道蛋白輔因子可以用作各種發(fā)光蛋白質的發(fā)光體.影響這一相互作用的因素包括發(fā)光蛋白質的性質和周圍環(huán)境的特性.例如，發(fā)光蛋白質例如Renilla或Oplophorus熒光素酶或水母蛋白與水母水通道蛋白輔因子在氧氣和至少痕量輔因子Ca"的存在下的相互作用將產(chǎn)生光.水母水通道蛋白輔因子在該過程中被氧化成其相應的Coelenteramide，如下所示，(VI)來自這些相互作用的光可以檢測，和在一些體系中與蛋白質的量、水母水通道蛋白輔因子和/或涉及的輔因子相關。發(fā)光檢測通常是通過將從具有給定表面積的樣品發(fā)出的光的強度積分來進行，用于檢測發(fā)光的儀器包括發(fā)光計、電荷耦合設備(CCD)和光電倍增管.受保護的發(fā)光體受保護的發(fā)光體能提高發(fā)光分析的應用性。"受保護的發(fā)光體"定義為已經(jīng)被修飾使得它不再與發(fā)光蛋白質相互作用而發(fā)光的水母水通道蛋白輔因子。如果修飾方式是向水母水通道蛋白輔因子中引入酶可除去的基團，則受保護的發(fā)光體與適宜的酶發(fā)生相互作用，產(chǎn)生能發(fā)光的活性水母水通道蛋白輔因子.能將受保護的水母水通道蛋白輔因子轉化成發(fā)光體的酵優(yōu)選是非發(fā)光性酶。所有上述水母水通道蛋白輔因子可以被轉化成受保護的發(fā)光體。術語"基團"是指化合物的任何部分。一般而言，這種衍生作用涉及官能團例如苯盼(-C晶OH)、羰基(>O0)和苯胺(_C6H4NH2)基團轉化成對其環(huán)境不太活潑的基團。因為官能團的正常反應性被酶可除去基團的存在所抑制，所以酶可除去的基團可以稱為保護基團?？赡艿谋Ｗo基團包括酯，它能通過與酯酶的相互作用而除去，可能的保護基團還包括磷?；?，它能通過與磷酸酶(包括磷酸二酯酶和堿性磷酸醉)的相互作用而除去.可能的保護基團還包括葡糖基，它能通過與糖苷酶、a-D-半乳糖苷、p-D-半乳糖苷、a-D-葡糖苷、D-葡糖苷、ot-D-甘露糖苷、p-D-甘露糖苷、P-D-呋喃果糖苷和P-D-葡糖苷酸的相互作用而除去.本領域技術人員將能認識到其它可用于本發(fā)明的酶可除去基團，酶與酶可除去基團之間的相互作用例如描述在美國專利5831102以及Tsien，R.Y.Nature,290:527-28，1981.'Redden,P丄等，IntJPharm，180:15卜60，1999;和Annaert，P等，Pha函ceutRes，14:492-96,1997中，酶可除去的基團可以設計成使得它們只能通過與特定醉的作用而除去.例如，特定的脂肪酸可以用作酶可除去的基團，和僅僅特定的酯酶將這些受保護的發(fā)光體轉化成發(fā)光體.可以使用具有高位阻的保護基團，例如叔丁基.這種保護基團可以用于屏蔽能對體積大的位阻醋起作用的新型酯酶，氨基酸也可以用作保護基團.受保護的發(fā)光體可以進一步通過用與保護基團連接的氮原子取代烯醇氣原子來進一步修飾.這種保護基團然后可以用蛋白酶除去，隨后將受保護的發(fā)光體水解成烯醇/羰基，從而提供發(fā)光體.這些酶可除去的基團優(yōu)選是醇官能團的衍生物，在水母水通道蛋白輔因子中的羰基官能團的情況下，衍生作用可以涉及將羰基轉化成烯醇基團(-C-C-0H),水母水通道蛋白輔因子的羰基和烯酵形式可以是在溶液中的動態(tài)平衡，使得總是有一定比例的處于烯醇形式的基質.烯醇的幾基(-0H)可以衍生，經(jīng)由用跣化刑形成醋的衍生作用在下面示意性地說明。具有結構VI的水母水通道蛋白輔因子含有兩個盼基和一個羰基，任何這些基團的組合可以受保護.用醚保護基團進行的衍生反應可以例如通過用烷基化劑例如乙酰氣基甲基溴處理水母水通道蛋白輔因子來進行.用酯保護基團進行的衍生可以例如通過用酰化刑例如乙酰酸酐或乙酰氯處理水母水通道蛋白輔因子來進行。這些衍生作用是在堿性條件下進行，即pH為7-14.在這些條件下，酚羥基以及咪唑啉稱氧(imidazoloneoxygen)都可以反應形成相應的酯或醢.認為咪唑稱氣當處于烯醇形式時發(fā)生反應.保護/脫保護方法以及各種保護基團的例子描述在"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis"中，Greene,Wuts編輯，JohnWileyandSons,紐約，1991.衍生方法的一個例子是從水母水通道蛋白輔因子VI合成受保護的發(fā)光體IX.受保護的發(fā)光體IX也稱為三乙?；?水母水通道蛋白輔因子，這是因為存在三個乙?；Ｗo基團.已經(jīng)報道了具有結構IX的化合物用作中間體以試圖形成天然水母水通道蛋白輔因子VI的結構(Inoue等，TetrahedronLetters31:2685-2688(1977)).預期受保護的發(fā)光體IX將具有比其它受保護發(fā)光體稍低的穩(wěn)定性，這是考慮到由乙跣基衍生的烯醇基團的易反應性.對于給定的保護基團，衍生的烯醇比類似衍生的紛更易反應.這種烯醇衍生物的增加的反應能力允許烯醇衍生物進行選擇性水解以再次提供咪唑啉稱的羰基.這類化合物稱為部分受保護的物質，因為一部分官能團受保護，而另一部分則不受保護.這些部分受保護的物質可以用于生物學分析，或它們可以進一步與不同的酰化劑或烷基化劑反應形成不對稱的化合物，即具有多于一種保護基團的化合物.適宜保護基團的選擇取決于所考慮的細胞類型和所需的水解速率。選摔性水解可以例如如Inoue等，TetrahedronLetters31:2685-2688(1977)中所述進行.這表示在下面的反應路線中，其中將三乙?；?水母水通道蛋白輔因子(IX)選擇性水解成二乙跣基-水母水通道蛋白輔因子(X)和隨后形成不對稱的受保護發(fā)光體(XI).結構ni-xiv顯示了在羰基上具有保護基的受保護發(fā)光體。(x")(x川)(xiv)R7、R8、R'和R'?？梢元毩⒌厥荋、烷基、雜烷基、芳基或其組合,R"和R"可以獨立地是-0R"、H、0H、烷基、雜烷基、芳基或其組合，對于結構XIII，n可以是0、l或2，優(yōu)選是l.優(yōu)選，R'是如對于R'所述的含義或是-CH「C晶OR".優(yōu)選，W是如對于R2所述的含義，和R'。是如對于R4所述的含義.優(yōu)選，R'是如對于^所述的含義或是-C6H40R15.R11、R"、R"和R"—起表示為IT,是保護基團，可以獨立地是各種保護基團的任何一種.優(yōu)選，這些物質與其相應的氣原子一起是酸、醋或其組合.例如，保護基團可以是乙酰基(Rp=-C(=0)-CH3)、丁?；?RP--C(-0)-C3H7)、乙酰氣基甲基(Rp=-CH廣O-C(-0)-CH3)、丙酰氧基甲基(IT--CH2-0-CH))-C2H5)、丁酰氣基甲基(-CH廣O-C(=0)_C3H7)、新戊酰氣基甲基(Rp=-CH廣O-C(-0)-C(CH3)3)或叔丁?；?Rp=-C(-0)-C(CH3)3),受保護發(fā)光體的具體例子包括三乙酰基-水母水通道蛋白輔因子(IX)、三丁酰基-水母水通道蛋白輔因子(XV)、二乙?；?水母水通道蛋白輔因子-h(XVI)、乙酰氧基甲基二乙酰基-水母水通道蛋白輔因子(XVII)、乙酜氧基甲基乙?；?水母水通道蛋白輔因子-h(XVIII)、新戊酰氧基甲基-水母水通道蛋白輔因子-h(XIX)和乙耽氣基甲基-二脫氧基水母水通道蛋白輔因子(XX)'(xv")(xv"i)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>當受保護的發(fā)光體與適宜的脫保護醉相互作用時，保護基團被除去，恢復了初始官能團.對于酯和瞇保護基團，脫保護酶可以例如是任何水解酶，包括酯酶。對于水母水通道蛋白輔因子，在其脫保護形式中具有羰基官能團(即羰基)使得與發(fā)光蛋白質發(fā)生發(fā)光相互作用，發(fā)光蛋白質包括Renilla熒光素酶，0plophorus熒光素酵，Cypridina熒光素酶和水母蛋白。受保護的發(fā)光體可以僅僅需要在羰基位置被脫保護而轉化成發(fā)光體。但是，保護基團在紛羥基上的存在可能仍然阻礙或防止發(fā)光相互作用。受保護發(fā)光體的性能受保護的發(fā)光體顯示在正常使用條件下比其相應發(fā)光體更高的穩(wěn)定性.水母水通道蛋白輔因子通常在溶劑化時、特別是在具有中性pH以上的水溶液(例如細胞培養(yǎng)基)中是不穩(wěn)定的，這種不穩(wěn)定性導致自動發(fā)光。自動發(fā)光為體系中的檢測背景作出貢獻，降低了檢測的靈敏度.而且，這種不穩(wěn)定性會引起信號的持續(xù)時間較短.這種持續(xù)時間通過信號的半衰期來定量，半衰期定義為信號衰減到其初始幅度一半時所需的時間，對于受保護發(fā)光體和發(fā)光體而言，"穩(wěn)定性"定義為特定化合物在特定環(huán)境中的半衰期。半衰期為化合物濃度減低到其初始濃度一半時所需的時間.特定化合物的存在和/或濃度可以通過各種本領域技術人員公知的技術來檢測，這些技術包括例如核磁共振謙(NMR)和高效液相色謙(HPLC).優(yōu)選，穩(wěn)定性通過首先將受保護發(fā)光體或發(fā)光體與含水混合物混合以得到初始濃度來檢測.所述含水混合物優(yōu)選是在22TC下含有10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基。然后按照特定時間間隔從該混合物中取出小份樣品，通過HPLC檢測化合物的濃度.測量濃度降低到初始濃度的50X所需的時間是半衰期.較長的半表期對應于更穩(wěn)定的化合物.本發(fā)明的受保護發(fā)光體比其相應的發(fā)光體更穩(wěn)定.在對比穩(wěn)定性的過程中，發(fā)光體稱為受保護發(fā)光體的"母體化合物"，這是因為所有酶可除去的基團已經(jīng)被除去，受保護發(fā)光體的其它"母體化合物"是部分脫保護的衍生物.也就是說，母體化合物包括其中至少一個酶可除去基團已被除去的受保護發(fā)光體.例如，化合物VI和X都是化合物IX的母體化合物.受保護發(fā)光體的顯著穩(wěn)定性提供了對發(fā)光分析的各種改進.例如，受保護的發(fā)光體在與發(fā)光蛋白質接觸時不會發(fā)光，而是必須先與適宜的脫保護酶發(fā)生相互作用。因此，受保護的發(fā)光體可以在發(fā)光蛋白質的附近被轉化成發(fā)光體.不如受保護發(fā)光體穩(wěn)定的發(fā)光體免受去穩(wěn)定化的影響(即自動發(fā)光)，這是因為該發(fā)光體不是處于其活性形式，直到與脫保護酶發(fā)生相互作用為止.如果將脫保護酶限定到細胞或有機體中的特定區(qū)域，則可以僅僅在該區(qū)域中檢測發(fā)光。受保護的發(fā)光體在發(fā)光分析中的應用可以提供許多其它優(yōu)點，包括提高分析的信號/背景之比和改進發(fā)光信號的穩(wěn)定性.分析體外在本發(fā)明的具體實施方案中，受保護的發(fā)光體可以用作分析試劑。使用熒光素酶的分析是本領域公知的。這些分析特別用于分析生物機制，例如基因表達和調(diào)節(jié)。通常，細胞與編碼熒光素酶的核酸轉染，然后分解生產(chǎn)蛋白質提取物.熒光素酶在蛋白質提取物中的存在通過添加試劑(包括基質)來檢測.在優(yōu)選實施方案中，受保護的發(fā)光體在包括Renilla熒光素酶的分析中使用。Renilla熒光素酶可以是在分析中使用的唯一發(fā)光蛋白質(Srikantha等，J.Bacteriol，178(1):121-9，1996;LiuandEscher,Gene237(1):153-9，1999)可以與一種或多種其它發(fā)光蛋白質一起存在(Skarpidi等，Blood96(1):321-6，2000;Parsons等，Anal.Biochem.281(2):187-92，2000;Stables等，J.Recept.SignalTransduct.Res.19(H):395—410，1999;Grentzmann等，RNA4(4):479-86，1998)，或可以是融合蛋白質與另一種發(fā)光蛋白質的一部分(Liu等，Luminescence15(1):45-9，2000),在一些實施方案中，受保護的發(fā)光體用于這樣的分析中，其中脫保護酶在添加分析試劑之前就存在于樣品中.這種分析可以用于檢測脫保護酶在樣品中的存在的方法中.例如，Renilla熒光素酶和受保護發(fā)光體可以加入樣品中。如果脫保護酶存在于樣品中，則受保護發(fā)光體將被活化，并可以達到熒光素酶而產(chǎn)生光，如果脫保護酶不存在，則受保護的發(fā)光體保持不能達到熒光素酶，從而不能產(chǎn)生光.這些分析還可用于檢測脫保護酶在樣品中的相對濃度，在另一個實施方案中，脫保護酶包含在分析試刑中.例如，在包含甲蟲和Renilla熒光素酶的雙重熒光素酶分析中，ATP、熒光素和受保護的發(fā)光體可以先加入樣品中.甲蟲熒光素酶將利用ATP和熒光素，并檢測產(chǎn)生的光。隨后加入脫保護酶.脫保護酶通過從烯醇/羰基基團除去至少一個保護基而活化了水母水通道蛋白輔因子.因此，基質具有能參與水母水通道蛋白輔因子-ReniUa熒光素酶的發(fā)光相互作用的羰基，并檢測產(chǎn)生的光.在另一個實施方案中，使用甲蟲和Renilla熒光素酶，這些分析用于檢測或定量樣品中的細胞.因為甲蟲熒光素酶取決于ATP的活性，所以它用于檢測樣品中的ATP.這種依賴性已經(jīng)被利用來用甲蟲熒光素酶產(chǎn)生ATP分析、細胞檢測分析和細胞活性分析.使用具有受保護的發(fā)光體的單一雙重熒光素酶分析，可以檢測在ATP和脫保護酶在樣品中的存在.分析現(xiàn)場本發(fā)明的化合物特別用于分析細胞的現(xiàn)場方法.使用熒光素醉進行細胞現(xiàn)場分析的方法是本領域公知的，參見美國專利5998204.本發(fā)明的受保護發(fā)光體需要除去保護基團而成為熒光素酶的基質.但是，一旦除去了保護基團，這些化合物可以立即用作熒光素酶的基質.因此，可以通過現(xiàn)場成像測定脫保護酶在細胞中的位置.這可以通過使表達熒光素酶例如Renilla熒光素酶的細胞與受保護發(fā)光體接觸來進行.無論能使受保護發(fā)光體脫保護的酶位于細胞中的何處位置，都將發(fā)光.這種發(fā)光可以通過成像系統(tǒng)檢測到.受保護發(fā)光體也用于分析報道基因表達.用于將受保護發(fā)光體轉化成發(fā)光體所要求的脫保護酶的生產(chǎn)受到許多因素的影響.因為脫保護酶的存在和量可以通過使用受保護發(fā)光體來檢測，所以可以研究這種酶的表達。使用生物發(fā)光共振能轉移(BRET)，可以檢測兩個分子是否能互相結合或者共定位在細胞中(Angers等，Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A97(7):3684-9，2000)。BRET涉及使用兩個生物發(fā)光分子或者一個生物發(fā)光分子和一個熒光分子.選擇這些分子，使得給體的發(fā)射波長處于受體的激發(fā)范圍中。此外，兩個分子的激發(fā)和發(fā)射范圍應該最小程度地重疊。當分子彼此接近時，給體的激發(fā)導致能量轉移到受體而不是發(fā)射光。然后，受體發(fā)射出光形式的轉移能量.因此，當分子彼此接近時，從給體檢測的光弱，而從受體檢測的光強。當分子不是彼此接近時，從給體檢測的光強，而從受體檢測的光弱(PCT出版物W099/66324),通過將給體與笫一種蛋白質結合并將受體與第二種蛋白質結合，兩種蛋白質之間的相互作用可以通過BRBT檢測來測定.(Angers等，2000),在優(yōu)選的實施方案中，給體是Renilla熒光素酶，受體是綠色熒光蛋白質.當受保護的發(fā)光體在這些分析中使用時，分析的準確性大大提高，這是因為由發(fā)光體的去穩(wěn)定化所產(chǎn)生的光減少。生化過程的分析不限于體外或現(xiàn)場環(huán)境，而是可以擴展到體內(nèi)研究.受保護的發(fā)光體在體內(nèi)發(fā)光分析中的應用對本領域技術人員而言是顯然的.試劑盒本發(fā)明的一個重要方面包括包含本發(fā)明的受保護發(fā)光體的試刑盒.試刑盒可以用于基本上任何其中使用發(fā)光體的分析，包括在這里詳細描述的優(yōu)選方法。在優(yōu)選的實施方案中，用于特定分析的基本試刑由試刑盒提供。這些試刑可以包括硤脲或硫脲衍生物、一種或多種緩沖水溶液和酶.試劑還可以包括DMSO和/或醇以幫助溶解受保護發(fā)光體.各試刑可以具有其自身的容器，或幾種試刑可以預先混合并一起包裝在容器中.在特定的實施方案中，試刑盒包含編碼熒光素酶的基因。在另一個實施方案中，提供熒光素酶蛋白質本身?；衔锉景l(fā)明還提供式xn、xni和xiv的新型化合物.對于化合物xn，R'是-CH廣C^0C(-0)CH3和R'是-C晶0C(-0)CH,，R'。是H,W是-CH2-C6H5，則R"不是-C(-0)CH3.優(yōu)選，本發(fā)明提供式XII、XIII和XIV的新型化合物，其進一步具有在22t:下含有F12培養(yǎng)基和10、胎牛血清的混合物中的半衰期為至少45分鐘，優(yōu)選，式xn、xin和xiv的受保護發(fā)光體比其母體化合物更穩(wěn)定，這通過化合物在含水環(huán)境中的半襲期來測定.具體而言，本發(fā)明提供式xv、xvi、xvn、xviii、xix和n的新型化合物。實施例所有溶劑和試劑從FISHERSCIENTIFIC獲得，但下述情況除外.Mathew緩沖劑按照以下方式形成，從SIGMACHEMICALS獲得pH為7.4的lOOmM辨酸鉀緩沖液；500mM氯化鈉；ImM的乙二胺四乙酸(EDTA);和O.lXw:v明膠型A(75-100Bloom),Ham的F12培養(yǎng)基和胎牛血清是從LIFETECHNOLOGIES獲得，兔酯酶是從SIGMACHEMICALS獲得，Renilla熒光素酶是從C服MICONCORP.獲得,實施例1在此實施例中，具有三個乙?；Ｗo基團的受保護發(fā)光體是從具有結構VI的水母水通道蛋白輔因子合成.向化合物VI(STOPANDGLOSUBSTRATE,P醒EGACORPORATION)(500mg;1,2mM)在無水他咬(20ml)中的溶液中加入乙酸酐(1.lml;UmM)，使反應保持在惰性氣氛和室溫下.l小時之后，向反應中加入30ml二氯甲烷，然后加入80ml水.該混合物攪拌5分鐘，然后分離各層.有機層蒸發(fā)至干，然后如下用柱色詳法提純.常規(guī)相硅膠(20g)溶解在二氣甲烷中，然后裝入適宜尺寸的玻璃柱中。提取的反應混合物溶解在最小量的二氣甲烷中，并加入柱頂部。采用逐步梯度，開始是在二氯甲烷中的1%乙酸乙酯(EtOAc)，增加極性直至所需的化合物洗脫出來(二氯甲烷中的10XEtOAc).收集所有HPLC提純的級分(>95X),蒸發(fā)至干，獲得410mg的純化合物IX.實施例2在此實施例中，具有三個丁?；Ｗo基團的受保護發(fā)光體是從具有結構VI的水母水通道蛋白輔因子合成.向化合物VI(300mg;0.7mM)在無水吡啶(30ml)中的溶液中加入丁酸肝(1.Ug;7mM)，使反應保持在惰性氣氛和室溫下.l小時之后，將反應混合物置于真空中以便除去溶劑，直至形成漿液.向漿液中加入30ml二氯甲烷，然后加入80ml水.該混合物攪拌5分鐘，然后分離各層.有機層蒸發(fā)至干，然后如下用柱色譜法提純.常規(guī)相硅膠(20g)溶解在二氣甲烷中的2XEtOAc中，然后裝入適宜尺寸的玻璃柱中。提取的反應混合物溶解在最小量的二氯甲烷中，并加入柱頂部，流動相是恒溶刑成分的，所有所需的化合物用在二氯甲烷中的EtOAc洗脫出來.收集所有HPLC提純的級分(〉95X)，蒸發(fā)至干，獲得225mg的純化合物XV.實施例3在此實施例中，合成具有結構VII的水母水通道蛋白輔因子.合成過程是Inoue等報道的改進方法(Inoue和Kakoi，Heterocycles48(8)，1669(1998))向2-氨基-3-芐基-5(4-羥基苯基)吡嗪(2g，7.2mM)在二甲苯(80ml)中的溶液中一次加入所有的苯基丙粥酸(8.3g;50.5mM)，將反應混合物加熱回流(130-140TC)l小時，然后冷卻到室溫.將混合物減壓蒸發(fā)成黑色固體泡沫體.將泡沫體在300g的N.P.硅膠用二氯甲烷中的甲醇逐步梯度進行色譜分離.所需的產(chǎn)物用二氯甲烷中的5X甲醇洗脫，獲得2g化合物Vn，通過HPLC提純到80X純度，重復進行色語分離，獲得900mg的化合物VI1("水母水通道蛋白輔因子-h"，HPLC提純〉95X)，是棕色固體.實施例4在此實施例中，具有兩個乙酜基保護基團的受保護發(fā)光體是從具有結構VII的水母水通道蛋白輔因子合成.向化合物VII(300mg;0.74mM)在無水吡咬(lSml)中的溶液中加入乙酸肝(lml;llmM)，使反應保持在惰性氣氛和室溫下。l小時之后，將反應混合物蒸發(fā)成粘性漿液，然后如下用柱色謙法提純該粘性漿液.常規(guī)相硅膠(40g)溶解在EtOAc和庚烷的1:3混合物烷中，然后裝入適宜尺寸的玻璃柱中，將漿液溶解在最小量的二氯甲烷中，并加入柱頂部。流動相是恒溶刑成分的，所有所需的化合物用1:3的EtOAc/庚垸洗脫.收集所有HPLC提純的級分095X),蒸發(fā)至干，獲得170mg的純化合物XVI.實施例5在此實施例中，具有一個乙?；Ｗo基團(在紛基上)的受保護發(fā)光體是從實施例4的受保護發(fā)光體(XVI)合成.將化合物XVI在吡啶和二氦甲烷的l:1混合物中的1X溶液冷卻到Or.向該溶液中，滴加入預先冷卻的1X甲醇氨溶液。氨溶液的體積等于用于溶解XVI的吡啶/二氣甲烷混合物的體積。在反應幾分鐘后，用HPLC檢測樣品，確定脫保護的完成程度.通過HPLC測得形成新的峰，它比原料的極性更強(即在C18硅膠上更容易洗脫)，但比化合物VI的親油性更強(即在C18硅膠上更晚洗脫出來)。一旦通過HPLC檢測不到化合物XVI，將反應混合物蒸發(fā)至干，然后如下用柱色謙法提純.常規(guī)相硅膠按照硅膠化合物=75:1的比例溶解在EtOAc和庚烷的1:2混合物中，流動相是呈步進梯度的，通過增加EtOAc的濃度來提高溶劑體系的極性，直至洗脫出所有所需的化合物.收集所有HPLC提純的級分(>95^)，濃縮獲得純化合物XXI。化合物XXI具有結構I,其中Rl--CH2-C6H5;R2--CH-C6H5;R3--C6H4—0-C(-0)-CH3;和R4-H,化合物XXI因此具有脫保護的烯醇/羰基，其可以被保護以提供不對稱的受保護發(fā)光體.例如，與乙酸溴甲醋的反應將獲得受保護的發(fā)光體XVIII.實施例6在此實施例中，具有兩個乙?；Ｗo基團(在盼基上)和一個乙跣氣基甲基保護基團的受保護發(fā)光體是從實施例1中合成的受保護發(fā)光體(IX)合成，向化合物IX在無水吡啶中的1X溶液中加入NaH(5.0當量)，使該溶液在惰性氣氛和室溫下攪拌。IO分鐘之后，將乙酸溴甲酯(5.0當量)滴加入該混合物中，將該反應混合物于室溫再攪拌30分鐘.向反應中加入二氯甲烷，其體積是吡啶體積的兩倍，然后加入水，其體積等于吡啶的體積。將該混合物再攪拌5分鐘，然后分離各層.有機層蒸發(fā)至干.該物質可以使用常規(guī)相硅膠用EtOAc/庚烷作為流動相進行柱色謙法提純，獲得化合物xvn.實施例7在此實施例中，具有結構xix的受保護發(fā)光體是從具有結構ni的水母水通道蛋白輔因子使用Aungst等(PharmaceuticalResearch,12(5)，763(1995))的改進方法合成。向KI(0.122g;0.74mM)、碳酸鐘(O.031g;0.44mM)和新戊酸氯甲酯(1.lg，7.3mM)在無水DMF(3ml)中的混合物中加入化合物VII(0.3g，0.73mM)，將該反應于室溫在惰性氣氛下攪拌過夜.通過HPLC分析，顯示化合物VII完全被消耗，出現(xiàn)了與化合物XIX相關的極性較弱的峰.DMF在減壓下蒸發(fā).將固體溶解在二氯甲烷中，在50gN.P硅膠上進行色詳提純，獲得255mg的化合物XIX(98V用HPLC提純)。實施例8在此實施例中，具有結構VIII的水母水通道蛋白輔因子("二脫氣基水母水通道蛋白輔因子")是從2-氨基-3-芐基-5-苯基吡嗪和2-乙酰氧基-3-笨基丙烯醛合成.化合物2-氨基-3-芐基-5-苯基吡嗪是根據(jù)前面描述的方法制備(Kishi,Y等，Tet.Lett,2747(1972);Cormier,M等，Biochemistry,18(11)，2204(1979);Hirano,T等，Tetrahedron53(38)12903-12916(1997)).化合物2-乙酰氣基-3-苯基丙烯醛是如下合成'向苯基丙嗣酸("g，l"mM)在無水吡啶(250ml)中的溶液中加入乙酸酐(UOml).將溶液在情性氣氛下攪拌過夜，通過薄層色謙(TLC)使用在二氯甲烷中的IOX甲醇進行監(jiān)控.吡啶在減壓下蒸發(fā)，所得的漿液溶解在二氯甲烷(700ml)中，并用200inl份的0.1N鹽酸水溶液洗滌3次.有機相用疏酸鈉干燥，并過濾，濾液在減壓下濃縮，得到粘性琥珀色漿液，該漿液在N.P硅膠上用二氯甲烷進行色譜提純，獲得24g的2-乙酰氣基-3-苯基丙烯酸.將該乙酸烯醇酯中間體溶解在150mlTHF中，并冷卻到O匸.然后在攪拌下滴加入草耽氯(51ml，580mM)，并將該溶液于OC再攪拌20分鐘.滴加入二甲基甲酜胺(DMF)(7.5ml),然后將該溶液于OX:攪拌4小時，在減壓下濃縮，用甲苯共蒸發(fā)兩次，得到酰氯。將該酰氣中間體(14.5g，87mM)溶解在200邁1的二氯甲烷/THF的1:l混合物中，將該'溶液冷卻到-70TC，滴加入LiAl(OtBu)3H(152ml,152mM)，同時保持反應溫度低于-70iC.LiAl(OtBuhH的添加完成之后，于-70t:繼續(xù)攪拌2小時.除去冷卻浴，加入鹽酸水溶液(2N，100ml)，將反應加熱到室溫.該混合物萃取入500ml瞇中，組合的有機相用硤酸鈉干燥，并過濾.濾液進行減壓濃縮，得到粘性油，用N.P,硅膠(250g)和在己烷中的乙酸乙酯梯度通過柱色譜提純.所需的化合物在庚烷中的lOi乙酸乙酯中洗脫出來，得到13.5g的2-乙酰氣基-3-苯基丙烯醛，是琥珀色的油(80X產(chǎn)率，在'HNMR中的醛單峰位于9ppm,ms.-189),二脫氧基水母水通道蛋白輔因子是從2-氨基-3-節(jié)基-5-苯基吡喚和2-乙酰氧基-3-苯基丙烯醛根據(jù)Kishi等描述的方法制備(Tet.Lett.，1972),其中有以下改進，向2-氨基-3-爺基-5-苯基吡嗪(2g，8.lmM)在乙醇(125ml)中的溶液中一次加入2-乙酰氣基-3-苯基丙烯醛(3g，16.2mM)。通過向該溶液中通入氮氣將該溶液脫氣30分鐘。加入濃鹽酸水溶液Mml),反應加熱回流18小時。在冷卻到室溫之后，過濾收集淺灰色沉淀物，用40ml乙醇洗滌，真空干燥，獲得1,28g的化合物VIII，即二脫氧基水母水通道蛋白輔因子(80X產(chǎn)率).化合物VIII因此具有脫保護的烯醇/羰基，其受到保護以提供受保護的發(fā)光體.例如，與乙酸溴甲酯的反應將獲得受保護的發(fā)光體XX.體外分析實施例9-各種受保護發(fā)光體的穩(wěn)定性水母水通道蛋白輔因子或受保護發(fā)光體的樣品以約3mM的濃度溶解在甲醇中.這些儲備溶液稀釋到在FU培養(yǎng)基；PU培養(yǎng)基+10X胎牛血清；或F12培養(yǎng)基+0.OlVTween20中至lpM.在不同時間提取樣品，用HPLC檢測保留在樣品中的化合物的量(水母水通道蛋白輔因子或受保護發(fā)光體)。在各溶液中的化合物的半衰期通過用吸收率的log值對時間作圖獲得的線性函數(shù)進行回歸分析來確定.然后計算化合物濃度降低到初始濃度的50X所需的時間.表c<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>現(xiàn)場分析在這些實施例中，發(fā)光體和受保護發(fā)光體的性能在各種培養(yǎng)的細胞中現(xiàn)場檢測.細胞暫時地或穩(wěn)定地與編碼Renilla熒光素酶的質粒子轉染.在與水母水通道蛋白輔因子(VI或VII)接觸的細胞或受保護的發(fā)光體(IX、XV或XVI)之間比較發(fā)光。通過檢測隨著時間的發(fā)光和比較其中不存在細胞情況下的發(fā)光.證明了和與未修飾的水母水通道蛋白輔因子接觸的細胞相比，細胞與受保護發(fā)光體的接觸導致通常較少的發(fā)光，具有較長的半衰期和較高的信號/背景之比。中國田鼠的卵巢(CH0)細胞保持在Ham的含有IOX胎牛血清(FBS)的F-12培養(yǎng)基中。HeLa和293細胞保持在含有IOS胎小牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中.所有細胞系在5"02存在下于"1C生長.細胞暫時性地與15pg的pUC19或pRL-控制質粒(PROMEGACORPORATION,E6271)在7.5x1()5細胞/10cm板的濃度下用Tfx-20(PROMEGACORPORATION,E2391)或TransFast"轉染劑(PROMEGACORPORATION,E2431)進行轉染，第二天，收集轉染物，分到白色DYNEX96孔型發(fā)光計板的48個孔中.CHO細胞也獨立地用pHRL-控制和pPGKNeo(用于克隆選擇的質粒表達Neomycin基因)使用TransFastTM試劑進行穩(wěn)定性轉染。在500pg/mlNeomycin(PROMEGACORP.)的克隆選擇之后，使用在完全F12培養(yǎng)基中的水母水通道蛋白輔因子選擇用于Renilla熒光素酶活性的穩(wěn)定克隆.如此制備的細胞然后進行各種分析，用于這些分析的反應緩沖刑使用DMEM或F12培養(yǎng)基用FBS或FCS(10體積X)制備.然后加入水母水通道蛋白輔因子VI、水母水通道蛋白輔因子VII或受保護發(fā)光體IX、XV或XVI之一達到60pM的濃度。這些緩沖刑然后用于在下列分析中進行發(fā)光檢測.用ORION發(fā)光計檢測發(fā)光.實施例10-活細胞分析，隨著信號/背景之比增加在轉染之后的24或48小時之后，從細胞中吸出培養(yǎng)基.細胞用100p1/孔的IX磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌.通過half-logs將含有VI或IX的反應緩沖刑滴入完全的培養(yǎng)基中，并將這些溶液加入空孔中和含有已轉染的細胞的孔中，在替換培養(yǎng)基之后5分鐘檢測發(fā)光.立即在初始檢測之后，加入TERGITOLNP-9(SIGMACHEMICALS)到最終濃度為1、樣品混合約15秒，以1秒/孔將發(fā)光積分.在將TergitolNP-9加入含有氷母水通道蛋白輔因子VI或VII的樣品中之后，從細胞樣品檢測的發(fā)光增加.在將TergitolNP-9加入含有水母水通道蛋白輔因子IX、XV或XVI或XIX的樣品中之后，從細胞樣品檢測的發(fā)光幾乎降低到自動發(fā)光的水平。對于僅含有培養(yǎng)基和血清的樣品測得的發(fā)光作為自動發(fā)光.發(fā)光與自動發(fā)光之比作為信號/背景之比(S/B).被pHRLCMV，E6271轉染的CH0細胞的結果列在表D中。表D化合物/參比化合物的比率化合物參比化合物自動發(fā)光發(fā)光S/NIXVI0.21.59.1XVVI0.20,73，9XVIVI0.41.13.4XVIVII0.91.41.7XIXVII0.20.3217實施例ll-自動發(fā)光的對比CHO細胞在用合成Renilla熒光素酶基因在CMV啟動子(PR0MEGA，目錄)控制下穩(wěn)定地轉染之后，在5%0)2的存在下在37TC下在含有10XFBS的F12培養(yǎng)基中生長.將細胞種在96孔板的3行(A-C行)中，并靜置過夜生長.將水母水通道蛋白輔因子VI或乙跣氧基甲基二乙?；杆ǖ赖鞍纵o因子XVII在Fl2培養(yǎng)基+10XFBS中稀釋到60pM.含有水母水通道蛋白輔因子XVII的F12用于代替A行中的培養(yǎng)基，并加入E行的空孔中(檢測自動發(fā)光)，含有水母水通道蛋白輔因子的F12用于代替C行中的培養(yǎng)基，并加入G行的空孔中.B行用于確保在水母水通道蛋白輔因子或乙酰氣基甲基二乙酰基水母水通道蛋白輔因子不存在下不產(chǎn)生發(fā)光。在3小時內(nèi)，每10分鐘檢測在該板上的孔中的發(fā)光，并繪制各化合物的發(fā)光(發(fā)光蛋白質依賴性發(fā)光)和自動發(fā)光(非發(fā)光蛋白質依賴性發(fā)光，從不含細胞的孔檢測)隨時間變化的曲線。發(fā)光隨時間變化的情況在圖1中顯示。信號/背景之比表示在圖2中.實施例12-半衰期短的基因報告分子該實施例顯示了阻隔兩部分蛋白質合成通路的作用.嘌呤審素和環(huán)己酰亞胺都能抑制蛋白質合成，但它們以不同的方式在通路中的不同點進行。在體外，酶的強度將降低超過IOO倍，在22"C下的半衰期為3-5分鐘。CHO細胞在用合成人化Renilla熒光素酶基因在CMV啟動子(Promega，目錄)控制下穩(wěn)定地轉染，并在5XC02的存在下在37匸下在含有IOX胎牛血清的F12培養(yǎng)基中在96孔板中生長。將一系列l(wèi)2-16個板僅僅種在A行，并靜置以過夜生長.除去該培養(yǎng)基，并用含有600pM的POM水母水通道蛋白輔因子-h(XIX)的F12培養(yǎng)基+10XFBS代替.檢測在一個板上的細胞的發(fā)光，將所有板放回培育器中.每1小時檢測在一個板上的細胞的發(fā)光，進行1、2和3小時的后培養(yǎng)基替換.也在大約3.5小時的后培養(yǎng)基替代下檢測發(fā)光.將嘌呤霉素和環(huán)己酰亞胺加入每個板上的一半孔中，將這些板放回培育器中，此時作為時刻0.在時刻0，檢測在一個板上的細胞的發(fā)光.以5分鐘的間隔，將這些板放回培育器中，取出新板，并檢測發(fā)光。這種循環(huán)每5分鐘重復進行，直至變化速度降低.此時，除去單板，并檢測其發(fā)光.然后將該板立即放回培育器中.這種循環(huán)每15分鐘重復進行。在所有這些板中檢測的發(fā)光平均為"未處理的細胞"(不暴露于蛋白質抑制劑的那些)和"經(jīng)過處理的細胞"(暴露于環(huán)己酰亞胺或噪呤霉素的那些).數(shù)據(jù)顯示在圖3中，其中顯示每次歸一化到未處理的細胞的平均發(fā)光(同時檢測)的發(fā)光。對于未處理的細胞的絕對發(fā)光保持從時刻0保持不變，直至分析結束.實施例13-用于從水母水通道蛋白輔因子衍生物與水母水通道蛋白輔因子母體化合物的發(fā)光的定位的分析.A.P0M-h(XIX)與水母水通道蛋白輔因子-h(VII)將CH0hRL25細胞(它表達焚光素酶)(4.5ml的(7.5^105個細胞)/(板/5x1(T個細胞/ml)再懸浮在5.5ml的培養(yǎng)基中，并加入96孔板中，第二天，吸出細胞，用100p1的PBS洗滌，然后再次吸出.然后將不含基質(背景)的100p1的培養(yǎng)基(F12)加入不含細胞的孔中.然后用0RI0N發(fā)光計(BERT冊0LD)以1秒/孔讀取這些孔的數(shù)據(jù)(表E;Bkg).類似地，將含有100mM的POM-h或水母水通道蛋白輔因子-h的100m1部分的培養(yǎng)基放入含有細胞的孔中或僅置于孔中.然后立即(水母水通道蛋白輔因子)和在IO分鐘后添加(POM-h)之后用ORION發(fā)光計(BERTHH0LD)以1秒/孔讀取這些孔的數(shù)據(jù)(表E;Subs)。然后，向每個孔中加入0.5m1的提純的Renilla熒光素酶(3.96xl(TM/反應(Chemicon).然后以1秒/孔讀取所有孔的數(shù)據(jù)(表B;RL).表E<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>使用表達熒光素酶的CHOhRL25細胞獲得的上述數(shù)據(jù)證明了P0M-h在從外部向培養(yǎng)基中添加熒光素酶之前和之后都被轉化成發(fā)光體(19584對35349)，表明該基質迅速在細胞內(nèi)定位.相比之下，在相似的條件下，與后添加外源熒光素酶相比，在添加外源熒光素酶之前水母水通道蛋白輔因子-h具有較低的發(fā)光(39342對331381)，表明該基質可以在細胞內(nèi)部以及外部使用，不需要含有醋酶的復合物，這些數(shù)據(jù)進一步證明在僅僅培養(yǎng)基(含極少的醋醉)中，P0M-h具有與含hRL25細胞的培養(yǎng)基相比更低的發(fā)光(3641對35349)，表明該水母水通道蛋白輔因子衍生物必須先在其被熒光素酶轉化成發(fā)光體之前被酯酶轉化。相比之下，水母水通道蛋白輔因子-h顯示與僅僅用培養(yǎng)基和用含hRL25細胞的培養(yǎng)基相當?shù)慕Y果(278467對331381)，表明在與外源熒光素酶反應之前沒有必要有細胞介導的轉化，B.三乙?；杆ǖ赖鞍纵o因子(IX)與水母水通道蛋白輔因子(VI)將未轉染的CH0(并不自然產(chǎn)生熒光素酶)和CHOhRL25細胞(它表達熒光素酶)(4.5ml的(7.5x105個細胞)/(板/5x10'個細胞/ml)再懸浮在5.5ml的培養(yǎng)基中，并加入96孔板中.第二天，吸出細胞，用100m1的PBS洗涂，然后再次吸出。然后將不含基質(背景)的100p1培養(yǎng)基(P12)加入不含細胞的孔中.然后用ORION發(fā)光計(BERTHHOLD)以1秒/孔讀取這些孔的數(shù)據(jù)(表F;Bkg).類似地，將含有l(wèi)OOyM的水母水通道蛋白輔因子或三乙?；杆ǖ赖鞍纵o因子的100nl部分的培養(yǎng)基放入含有細胞的孔中或僅置于孔中，然后立即(水母水通道蛋白輔因子)和在4分鐘后添加之后用(三乙?；杆ǖ赖鞍纵o因子)0RI0N發(fā)光計(BERTHH0LD)以l秒/孔讀取這些孔的數(shù)據(jù)(表F;Subs).然后，向每個孔中加入0.5m1的提純的Renilla熒光素酶(3.96xl(TM/反應(Chemicon)。然后以1秒/孔讀取所有孔的數(shù)據(jù)(表F;RL).表FBkgSubs(RLU)RL(RLU)hRL2+三乙?；杆ǖ赖鞍纵o因子(IX)23224353229111hRL2+水母水通道蛋白輔因子(VI)23139842110008374CH0+三乙?；杆ǖ赖鞍纵o因子(IX)238648910CH0+水母水通道蛋白輔因子(VI)236253119301474圖1實施例11中各化合物的發(fā)光(發(fā)光蛋白質依賴性發(fā)光)和自動發(fā)光(非發(fā)光蛋白質依賴性發(fā)光)隨時間變化的曲線。圖2實施例11中各化合物的發(fā)光(發(fā)光蛋白質依賴性發(fā)光)的信號噪音比隨時間變化的曲線。圖3實施例12中歸一化的細胞的的發(fā)光(相對于未處理的)隨時間變化的曲線。權利要求1、式(XII)的化合物其中，R7是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH2-C6H4OR14；R8是H、烷基、雜烷基或芳基；R9是H、烷基、雜烷基、芳基或-C6H4OR15；R10是-H、-CH3、或-CH(CH3)2；和R11、R14和R15獨立地是酶可除去的基團；前提是R11、R14和R15不都是乙?；?、權利要求1的化合物，其中R7是一CH廣C6Hs、萘基、-CH2—"H4OH、-CH2—C6H4Fi^-CH2-CJ4OR";R'是-CH2-C6H5、-CH2-C6H、-(^廣(:5119或-(CH2)3NHC(-NH)NH2;和R'是苯基、吲咮基、-C6H4OH、—C6H4NH2、-C6H4F或-(^IU)R'5.3、權利要求l的化合物，其中R'1、R"和R'5是醋。4、權利要求1的化合物，其中R"是乙?；?；和R"和R"獨立地是丁?；⒁阴Ｑ趸谆?、丙耽氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊酰氣基甲基.5、權利要求1的化合物，其中R"是丁酜基、乙耽氧基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊酰氣基甲基；和R"和R"獨立地是乙酰基、丁?；?、乙酰氣基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氧基甲基或新戊酰氧基甲基.6、式(XII)的化合物，其中IT是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH2-C晶0R";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R9是H、烷基、雜烷基、芳基或-C晶0R";IT是-H、-CH,、或-CH(CH3)2;和R"、R"和R"獨立地是酶可除去的基團，和其中在22"C下含有F12培養(yǎng)基和IOX胎牛血清的混合物中，該化合物的濃度在45分鐘后降低小于50%,7、權利要求6的化合物，其中R7是一CH廣C6H5、萘基、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4Fi^-CH2-C6H40R14;R'是-CH廣C^、-CH2-C6H,,、-CH廣C5H,或-(CH2)3NHC(-NH)NH2;和R'是苯基、吲哚基、-C晶OH、-C6H4NH2、-C6H4F或-C晶OR15,8、權利要求6的化合物，其中R11、R"和R"是酯.9、權利要求6的化合物，其中R11、R"和R"獨立地是乙酰基、丁?；⒁阴饣谆?、丙酰氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊酰氣基甲基.10、式(XII)的化合物，其中R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH2-C晶0R";Ri是H、烷基、雜烷基或芳基；R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-C晶0R";1T是-H、-CH3、或-CH(CH])2;和R"、R"和R"獨立地是酶可除去的基團，和其中除去至少一個酶可除去的基團提供了母體化合物；和其中使得在221C下含有Pl2培養(yǎng)基和IOX胎牛血清的混合物中該化合物的濃度降低50X所需的時間大于使得在22TC下含有Fl2培養(yǎng)基和10%胎牛血清的混合物中母體化合物的濃度降低5OX所需的時間.11、權利要求10的化合物，其中除去至少兩個醉可除去的基團，提供母體化合物.12、權利要求10的化合物，其中除去所有酶可除去的基團，提供母體化合物。13、權利要求10的化合物，其中R7是-CH廣"H5、萘基、—CH廣C6H4OH、一CH廣CJ^F或-CH廣C6H40R";Re是-CH廣CJl5、一CH廣C6Hh、-CH廣C5H,或-(CH2)3NHC(=NH)NH2;和R'是苯基、吲哚基、-C晶OH、-C6H4NH2、-C晶F或-CaU)R"'14、權利要求10的化合物，其中R"、R"和R"是酯.15、權利要求10的化合物，其中R"、R"和R"獨立地是乙?；?、丁醜基、乙酰氣基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氧基甲基或新戊酰氣基甲基.16、式(XIII)或(XIV)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>丁?；谆?其中，R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH廣C晶0lT;R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R"和R"獨立地是-H、-0H、烷基、雜烷基、芳基或-OR";n是0、1或2;和R11、R"和R"獨立地是酶可除去的基團.17、權利要求16的化合物，其中R'是-CH廣C6H5、萘基、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F或一012-(:6114011";和R'是-CH廣C^、-CH2-C6Hh、-012-(:5119或-(CH2)3NHC(=NH)NH2.18、權利要求16的化合物，其中R11、R"和R"是酯.19.權利要求16的化合物，其中R"、R"和R"獨立地是乙?；?、乙酰氣基甲基、丙酰氧基甲基、丁跣氣基甲基或新戊酰氣基20.權利要求16的化合物，其中n是l.21.一種組合物，含有在溶液中的權利要求1所述化合物，22.權利要求21的組合物，其中該溶液是水溶液。23.權利要求21的組合物，其中該溶液包含DMSO或醇.24.一種組合物，含有在溶液中的權利要求6所述化合物.25.權利要求24的組合物，其中該溶液是水溶液.26.權利要求24的組合物，其中該溶液包含DMSO或醇.27.一種組合物，含有在溶液中的權利要求IO所述化合物.28.權利要求27的組合物，其中該溶液是水溶液.29.權利要求27的組合物，其中該溶液包含DMSO或醇.30.一種組合物，含有在溶液中的權利要求16所述化合物.31、權利要求30的組合物，其中該溶液是水溶液.32、權利要求30的組合物，其中該溶液包含DMSO或醇.33、一種受保護的發(fā)光體，它是修飾的水母水通道蛋白輔因子，其中烯醇基團已經(jīng)被轉化成含有酶可除去的基團的酯或瞇；所述酶可除去基團的除去提供了母體水母水通道蛋白輔因子；和其中使得在22TC下含有Fl2培養(yǎng)基和IOX胎牛血清的混合物中修飾水母水通道蛋白輔因子的濃度降低50N所需的時間大于使得在221C下含有F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清的混合物中母體水母水通道蛋白輔因子的濃度降低5OX所需的時間.34、一種試刑盒，包含受保護的發(fā)光體；和發(fā)光蛋白質。35、權利要求34的試劑盒，進一步含有與發(fā)光體獨立的脫保護酶。36、權利要求34的試刑盒，其中受保護的發(fā)光體和發(fā)光蛋白質處于獨立的容器中.37、權利要求34的試劑盒，其中受保護的發(fā)光體和發(fā)光蛋白質處于同一容器中。38、一種試劑盒，包含受保護的發(fā)光體；和脫保護酶；其中發(fā)光體和脫保護酶處于獨立的容器中.39、一種檢測發(fā)光蛋白質的酶活性的方法，包括使發(fā)光蛋白質、脫保護酶和受保護發(fā)光體在溶液中接觸以形成組合物；和檢測由該組合物產(chǎn)生的光.40、權利要求39的方法，其中發(fā)光蛋白質是Renilla熒光素酶.41、權利要求39的方法，其中受保護發(fā)光體是式(XII)的化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R7是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH「C晶0R";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-C晶0R";R'。是-H、-CH3、或-CH(CH丄；和R11、R"和R"獨立地是酶可除去的基團.42、權利要求41的方法，其中R7是-CH2-"H5、萘基、-CH2_C6H,OH、-CH2—或一CH2-C6^0R";R8A-CH2-C6H5、-CH2-C6H"、-CH2-C5H9或-(CH2)3NHC(-NH)NH2;和R'是苯基、吲哚基、-C晶OH、-C6H4NH2、-C晶F或-C晶OR15，43、權利要求41的方法，其中R11、R"和R"是酯，44、權利要求41的方法，其中R'1、R"和R"獨立地是乙?；?、丁?；?、乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁跣氧基甲基或新戊醜氧基甲基.45、權利要求39的方法，其中受保護發(fā)光體是式(XIII)或(nV)的化合物(xm);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，r是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH廣C晶0R";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R"和R"獨立地是-H、-OH、烷基、雜烷基、芳基或-0R";n是0、1或2;和R"、R"和R"獨立地是酶可除去的基團。46、權利要求45的方法，其中R7是-CH廣C6H5、萘基、—CH2-C6^OH、-CH2-C6H4F或一CH廣C6H40R";和R'是一CH廣CJ1"—CH廣C6Hh、-CH廣CsH,或-(CH2)3NHC(-NH)NH247、權利要求45的方法，其中R11、R"和R"是醋。48、權利要求45的方法，其中R11、R"和R"獨立地是乙?；?、丁?；?、乙酰氣基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊跣氣基甲基，49、權利要求45的方法，其中n是l.50、權利要求39的方法，其中組合物包括細胞。51、權利要求39的方法，其中組合物包括含有脫保護酶的細胞.52、權利要求51的方法，其中檢測從該組合物產(chǎn)生的光，指出脫保護酶在細胞中的位置。53、權利要求39的方法，其中組合物包括細胞裂解物.54、權利要求39的方法，其中脫保護酶是酯酶.55、權利要求39的方法，其中該溶液是水溶液.56、權利要求39的方法，其中該溶液包含DMSO.57、權利要求39的方法，其中受保護發(fā)光體是修飾的水母水通道蛋白輔因子；其中烯醇基團已經(jīng)被轉化成含有酶可除去基團的酴或酸.58、一種在包含熒光素酶的活細胞中產(chǎn)生發(fā)光的方法，包括使溶液中的細胞與受保護的發(fā)光體接觸.59、權利要求58的方法，其中受保護發(fā)光體是修飾的水母水通道蛋白輔因子；其中烯醇基團已經(jīng)被轉化成含有酶可除去基團的酯或瞇，60、權利要求58的方法，其中受保護發(fā)光體是式(XII)的化合其中r是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH2-CJU)R";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-C晶0R";R"是-H、-CH]、或-CH(CH丄；和R"、R"和R"獨立地是酶可除去的基團。61、權利要求58的方法，其中受保護發(fā)光體是式(XIII)或(XIV)的化合物:(X川);R"ON、》N(XIV);其中，烷基、雜烷基、芳基或-CH廣CA0R";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R"和R"獨立地是-H、-OH、烷基、雜烷基、芳基或-OR";n是0、1或2;和R"、R"和R"獨立地是酶可除去的基團。62、一種檢測非發(fā)光性酶的酶活性的方法，包括使非發(fā)光性酶與含有發(fā)光蛋白質和受保護發(fā)光體的液體混合物接觸以形成組合物；和檢測由該組合物產(chǎn)生的光.63、權利要求62的方法，其中受保護發(fā)光體是修飾的水母水通道蛋白輔因子；其中烯醇基團已經(jīng)被轉化成含有由非發(fā)光性酶可除去的基團的酯或酸，64、權利要求62的方法，其中受保護發(fā)光體是式(XII)的化合10其中R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH廣C^OR";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R'是H、烷基、雜烷基、芳基或-CJU)R";R'。是-H、-CH3、或-CH(CH丄；和R"、R"和R"獨立地是酶可除去的基團，這些基團可通過非發(fā)光性酶除去.65、權利要求62的方法，其中受保護發(fā)光體是式(XIII)或(XIV)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(XIV);其中，IT是H、烷基、雜烷基、芳基或-CH廣C晶OR";R'是H、烷基、雜烷基或芳基；R"和R"獨立地是-H、-OH、烷基、雜烷基、芳基或-0R";n是0、1或2;和R"、R"和R"獨立地是酶可除去的基團，這些基團可通過非發(fā)光性酶除去.66、權利要求34的試刑盒，進一步包含DMSO或醇或其混合物.67、權利要求38的試劑盒，進一步在同一容器中包含DMS0或醉或其混合物作為受保護發(fā)光體.68、權利要求1的化合物，其中R11、R"和R"獨立地選自含有l(wèi)-20個碳原子的烷基和含有1-20個碳原子的雜烷基.69、權利要求1的化合物，其中R11、R"和R"獨立地選自含有l(wèi)-l5個碳原子的烷基和含有1-15個碳原子的雜烷基.70、權利要求1的化合物，其中R'1、R"和R"獨立地是含有l(wèi)-20個碳原子的雜烷基，和含有酯基和醚基中的至少一個.71、權利要求10的化合物，其中R"、R"和R"獨立地選自含有1-20個碳原子的烷基和含有1-20個碳原子的雜烷基.72、權利要求10的化合物，其中R"、R"和R"獨立地是含有1-20個碳原子的雜烷基，和含有酯基和醚基中的至少一個.73、權利要求16的化合物，其中R"、R"和R"獨立地選自含有1-20個碳原子的烷基和含有1-20個碳原子的雜烷基.74、權利要求16的化合物，其中R'1、R"和R"獨立地是含有1-20個碳原子的雜烷基，和含有酯基和酸基中的至少一個。75、權利要求41的方法，其中R11、R"和R"獨立地選自含有1-20個破原子的烷基和含有1-20個碳原子的雜烷基.76、權利要求41的方法，其中R11、R"和R"獨立地是含有1-20個碳原子的雜烷基，和含有酯基和瞇基中的至少一個。77、權利要求45的方法，其中R11、R"和R"獨立地選自含有1-20個碳原子的烷基和含有1-20個碳原子的雜烷基.78、權利要求45的方法，其中R11、R"和R"獨立地是含有l(wèi)-20個碳原子的雜烷基，和含有酯基和醚基中的至少一個。全文摘要涉及發(fā)光化合物的組合物、方法和試劑盒。一種檢測熒光素酶的酶活性的方法，包括使發(fā)光蛋白質例如熒光素酶與受保護發(fā)光體接觸以形成組合物；和檢測由該組合物產(chǎn)生的光。與相應的未修飾的水母水通道蛋白輔因子相比，受保護發(fā)光體提供了提高的穩(wěn)定性和改進的信號/背景之比。文檔編號G01N33/58GK101440089SQ20081016940公開日2009年5月27日申請日期2002年11月1日優(yōu)先權日2001年11月2日發(fā)明者D·克勞伯特,E·哈金斯,K·伍德,M·斯庫里亞申請人:普羅美加公司