專利名稱：測量糖化血色素的系統(tǒng)和方法
測量糖化血色素的系統(tǒng)和方法 相關(guān)申請的交叉引用
本申請是于2005年10月28日提交的題為"SYSTEM AND METHODS FOR MEASURING GLYCATED HEMOGLOBIN"的共同 在審的美國專利申請No. 11/261,741的部分連續(xù)申請，該專利申請引用 結(jié)合于此。
背景技術(shù)：
紅血球(RBC)或紅細胞負責(zé)將氧傳輸遍布身體.具體而言，為 健康紅血球一部分的血色素是一種含鐵的呼吸大夯子，其功能是以其
氧化形式將氧從肺部傳送到組織位置。如所知，紅血球具有能自由滲 透葡萄糖的隔膜。當(dāng)葡萄糖或其他糖基(sugar moiety)進入紅血球時， 會形成糖化血色素(GHb)。糖化血色素是指由糖基特別是葡萄糖的共 價結(jié)合而形成的各種血色素衍生物.形成的糖化血色素的數(shù)量與血液 中葡萄糖濃度以及暴露于葡萄糖的持續(xù)時間有關(guān).糖化血色素的常用 指數(shù)已知為HbAlc， HbAk與總血色素的比例已知為％HbAlc。
一般而言，紅血球壽命約為120天，血色素糖化的量以細胞的120 天壽命為函數(shù)而變化。由于葡萄糖與血色素分子的反應(yīng)緩慢且在體內(nèi) 通常是不可逆的，因此糖化血色素的量(HbAle)傳統(tǒng)上被視為過去3 -4個月的血液葡萄糖濃度的精確指數(shù)。因此，糖尿病患者被建議每3 -4個月檢查其HbA^值。例如，美國糖尿病協(xié)會(ADA)推薦每年進 行約2至4次HbA^測試，并進一步推薦低于7%的HbA,e水平。
通過簡單的吸收或反射測量可以確定總血色素，典型地，鐵被鐵 氰化鉀還原產(chǎn)生高鐵血紅蛋白，在565nm測量該高鐵血紅蛋白?？梢?通過本領(lǐng)域中已知的許多方法來確定糖化血色素的數(shù)量，例如通過竟 爭性或免疫化驗。在后一情形中，抗原在固相上不溶解，且標(biāo)記抗體 在存在這些抗原時被培育，抗體-抗原絡(luò)合物可以通過光學(xué)或熒光方 法探測。可以對約lOjil的血液實施該方法.然而，該方法是使用從血 液收集的隨機細胞樣品來實施的，因此提供了在特定時間點的平均葡 萄糖調(diào)節(jié)歷史的單個數(shù)據(jù)。測量平均值可能會朝較年輕的細胞傾斜，
因為較年輕的細胞更為主導(dǎo)。然而與較年老的細胞相比，較年輕的細 胞由于短暫暴露于葡萄糖而使得其血色素糖化數(shù)量的測量平均值經(jīng)常
被低估。因此，每3-4個月測試糖化血色素?zé)o法精確地反映某些糖尿 病患者的葡萄糖調(diào)節(jié)的質(zhì)量.例如，糖尿病患者可能系統(tǒng)性地欠調(diào)節(jié) 其葡萄糖水平l-3個月，而隨后在測試之前的最近30天過調(diào)節(jié)其葡 萄糖水平.由于最新的紅細胞對HbAlc測試的巨大影響，平均糖化血 色素可能看上去在正常范圍內(nèi)，因此在葡萄糖調(diào)節(jié)質(zhì)量上誤導(dǎo)患者和 護理者 因此，為從業(yè)者或受驗者提供有關(guān)更短時間階段內(nèi)患者葡萄 糖水平的更詳細信息，以及提供有關(guān)依照葡萄糖調(diào)節(jié)的更精確的信息， 這將是有益的。


參考下述詳細描述和圖示，本公開的實施例的特征和優(yōu)點將顯而
易見。為了簡化，具有先前描述的功能的參考數(shù)字或特征在其出現(xiàn)的
其他圖示中不一定被描述。
圖1為描述通常涉及細胞年齡的HbAk水平的曲線圖.
圖2為描述使用基于年齡的細胞分離來測量HbA^水平的常用方
法的實施例的流程圖。
圖3為微流體試樣(coupon)的實施例的示意性透視圖。
圖4為容納通過擋板分離的笫一溶液和第二溶液的毛細通道的實
施例的示意圖。
圖5為微流體試樣的另一實施例的示意性透視圖。
圖6為通過凍結(jié)和解凍溶液在毛細通道的實施例中建立溶液密度
梯度的示意圖。
圖7為微流體試樣的又一實施例的示意性透視圖。
圖8為基本上垂直取向的兩個毛細通道的實施例的示意圖。
圖9為將樣品添加到溶液密度梯度，隨后通過離心作用分離樣品
成份的示意性描述。
圖IO為分離的樣品成份的溶解(lysis)的示意性描述。
圖11為產(chǎn)生電場用于細胞溶解的簡單電路的電路圖。
圖12為結(jié)合一變壓器以產(chǎn)生電場用于細胞溶解的電路的電路圖。
圖13為微流體試樣的再一實施例的示意性描述，其中該試樣包括
滑動環(huán)用于施加電信號至該試樣上的電極。
圖14為錠子(spindle)的實施例的示意性透視圖和微流體試樣的 實施例的示意性俯視圖，其中該錠子包括滑動環(huán)用于通過該錠子施加 電信號至該試樣上的電極.
圖15為通過浮置于試樣上方和下方的固定電極來施加電場至微 流體試樣的系統(tǒng)的實施例的示意性描述.
圖16為系統(tǒng)的另一實施例的示意圖. 圖17為系統(tǒng)的再一實施例的示意圖。 圖18為描述分餾樣品成份的方法的實施例的流程圖.
具體實施例方式
應(yīng)理解，本文披露的實施例不限于此處所討論的具體過程和材料， 且可在一定程度上變化。還應(yīng)理解，本文中使用的術(shù)語是出于描述具 體實施例的目的，不是旨在限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其 等同特征限定。
本文中將使用下述術(shù)語。
單數(shù)形式的"一"、"一個"及"該"包括復(fù)數(shù)形式的指示物，除非上 下文明確表示不包含復(fù)數(shù)形式。
如此處使用的，術(shù)語"微流體試樣"或"試樣"是指用于離心分離和/ 或操縱一種或多種微流體的裝置，通常是出于在離心測試狀態(tài)中測試 該流體或液體的目的。合適的微流體試樣包括但不限于由聚甲基丙烯 酸甲酯(PMMA)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚碳酸脂等形成的 盤狀裝置。然而不限于此，這些盤在外觀上可以類似于例如緊湊光盤 (CD)的公知光盤。還應(yīng)理解，這些材料可選地包括涂層以最小化細 胞的粘附和聚集。此處使用的涂層可包括但不限于聚乙二醇(PEG)、 有機硅聚合物和聚二甲基硅氧烷(PDMS )，以及有機/珪嗣共聚物(PEG-硅烷)，這些涂層還可包括去污劑和表面活性劑，這些去污劑和表面活 性劑存在的數(shù)量足以防止粘附和聚集但不足以引起細胞溶解，除非在 期望如此的場合。
如此處使用的，術(shù)語"閥門"包括無源閥門和有源閥門。有源閥門 包括例如石蠟(paraffin or wax )的某種類型光學(xué)激活材料的機械閥閘、 熱激活閥門、機械閥門等；而無源閥門是沒有移動部件的靜態(tài)閥門，主要是由于其幾何配置和/或尺寸而用做流體閥門，例如，其中流體動 力學(xué)和/或流體上的力迫使流體通過微通道的微流體閥門等.
如此處使用的，術(shù)語"微流體的"及"微流體"應(yīng)理解為是指在系統(tǒng)
中被操縱的流體，這些系統(tǒng)將流體限制在至少一種尺度小于約lmm的 幾何通道、通路、j^存器及其他腔體中.類似地，術(shù)語"微流體通道" 或"微通道"應(yīng)理解為是指至少一種尺度小于約lmm的通道.
如此處使用的，術(shù)語"將...離心分離"及其相關(guān)術(shù)語"離心分離"和 "被離心分離的"應(yīng)理解為是指液體經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)存儲有該液體的貯存器而 引起的離心力的過程。盡管術(shù)語"離心分離"通常用于表示液體的兩種 或更多種成份由于離心力而被分離的過程，但是該術(shù)語的使用不限于 該液體成份的任意特定分離程度.因此，液體可以被離心分離，即使 當(dāng)該液體尚未呈現(xiàn)液體成份的看得見的分離.
當(dāng)提到紅細胞的"分年齡組(age specific group )"時，應(yīng)理解，一 分年齡組內(nèi)的細胞并不全部必須滿足該年齡分布(age profile),因為 在一分年齡組內(nèi)通常有一些細胞不符合該年齡分布。這至少部分是由 于通過年齡分離細胞的通常不精確方法所引起。就可以實施完美的年 齡分離這一方面而言，這種類型的分離當(dāng)然落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 然而，出于實用的目的，完美的分離是不可能的。因此，術(shù)語"分年齡 組"意味著與取自隨機樣品的紅細胞樣品相比，該紅細胞組在特定年齡 組內(nèi)統(tǒng)計學(xué)上包括更多的細胞.
當(dāng)提到諸如"液體"的流體時，應(yīng)理解，該液體的所有成份不一定 都是液體形式。例如，血液被視為液體，即使血液具有懸浮于其中的 固態(tài)細胞成份，還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語"液體"還包括所有成份都 是液體形式的情形。
依據(jù)本發(fā)明的實施例，糖化血色素的測量方法包括步驟建立紅 細胞的多個分年齡組，以及測量至少一個所述組的HbA!c水平.在另 一實施例中，糖化血色素的測量系統(tǒng)包括配置成將紅細胞分離成多 個分年齡組的分離裝置，以及配置成測量至少一個這些組的HbA,c水 平的測量裝置。在這些實施例中，通過另外確定總血色素也可以計算 %HbAle.本文所披露的方法和系統(tǒng)的實施例提供了解決與測量3-4 個月時間段的平均糖化血色素水平相關(guān)聯(lián)的問題的方案。
從圖1可以看出，約50%的HbAu是由年齡為30天以下的紅細胞
提供，約25%的HbA^是由年齡為30至60天的紅細胞提供，約25% 的HbA^是由年齡為60至120天的紅細胞提供，因此，在測量典型血 液樣品的HbA^水平時，獲得總體HbAk指數(shù)的傾斜圖像.
因此依據(jù)本公開，已經(jīng)意識到，期望獲得有關(guān)紅細胞分年齡組的 HbAlc水平的信息，而不是獲得幾個月時間段內(nèi)的平均HbAlc水平的信 息，換言之，除了獲得通常與血液樣品中未糖化血色素有關(guān)的HbAlc 值之外，更有益的是從未糖化血色素得知與紅細胞的離散年齡組相關(guān) 的血液樣品的HbAk水平，提供個體的血糖歷史的更精確的圖像.在 一個特定實施例中，使用一種容易使用的且可以置于家中或醫(yī)生辦公 室的小且便攜的裝置來實施該分析，這也是有益的.還期望這種裝置 能夠使用最小體積的血液例如小于50jU (約1至2滴)來工作.依據(jù) 本公開的各個方面，可以實現(xiàn)一個或多個這些期望特征.
已經(jīng)意識到，在測量血液中HbA^水平之前基于預(yù)定物理性能來 分離細胞，這可以提供在紅細胞的完整壽命內(nèi)有關(guān)患者依從的更精確 圖像。換言之，由于紅細胞樣品包含年輕和年老的血細胞，且由于年 輕血細胞與年老血細胞相比對HbAle水平的貢獻更大，通過依據(jù)細胞 的年齡沿一梯度分離這些細胞且隨后進行一個或多個HbA^分析，則 可以獲得3-4個月時間段的HbAic水平的更精確且時間敏感的圖像。
可以使用許多技術(shù)來實施紅細胞根據(jù)年齡的分離. 一種技術(shù)為逆 流離心分離(淘析)，這種技術(shù)將直徑或尺寸較小的粒子與直徑或尺寸 較大的粒子分離.對于紅細胞的情形，已知尺寸支配著沉淀和流動之 間的平衡。因此，盡管年老的紅細胞比年輕的紅細胞小且致密，年老 的紅細胞在離心分離期間首先洗提.其他技術(shù)可以依賴于細胞年齡的 其他化學(xué)或物理指示器，包括隔膜蛋白質(zhì)比例以及流變性能，這些在 后的因素會對細胞的電性能改變有貢獻。具體而言，電不透明度(射 頻阻抗與直流阻抗的比例)差異也與紅細胞年齡有關(guān).鑒于此，細胞 的介電性能也與其年齡相關(guān)聯(lián)，這意味著細胞可以基于其不同的介電 性能而被微觀分離。包括使用顯微鏡在內(nèi)的分離細胞的其他微觀手段 可以依賴于細胞密度和/或機械/流變性能，例如彈性和形變度。具體而 言，微通道裝置可以用于基于紅細胞的年齡來分離紅細胞群，因此， 存在許多基于年齡來分離紅細胞的方法，這些分離可以依據(jù)本公開的 方面出于確定HbA^水平的目的基于細胞年齡來實施。此外，應(yīng)理解，需要采取預(yù)防措施來最小化會導(dǎo)致細胞應(yīng)力的條 件，因為細胞應(yīng)力會降低分離的效率，這些預(yù)防措施包括但不限于在
緩沖劑中使用諸如肝磷脂或EDTA的抗凝結(jié)劑、避免過大的向心力、 避免過大的溫度偏差等等，
說明本公開的選定方面的一般方案示于圖2,其中血液樣品首先 基于年齡被分離，例如從年輕到年老的梯度或者相反.可以通過統(tǒng)計 學(xué)上在年齡方面可能比較接近的細胞分組(基于尺寸、密度、介電響 應(yīng)等中的一個或多個)，由此定義得到的細胞梯度.隨后可以分別評估 各組的HbAu水平.組的數(shù)目可以僅為兩組(例如，年齡為小于1至3 個月的細胞與年齡大于1至3個月的細胞相比較)，以及從業(yè)者認為合 適的許多不同的組(例如，3-10或更多的組).備選地，在該年齡梯 度任意一端或中間的一個或多個離散組可以被評估.
應(yīng)注意，本文描述的細胞分離不一定導(dǎo)致細胞組的完全分離，因 為細胞可以沿一梯度排列.此外，注意，當(dāng)使用物理的細胞性能來近 似年齡時，某些細胞會具有不符合用于沿該細胞梯度來排列細胞的物 理性能的統(tǒng)計學(xué)分布。然而，這些標(biāo)記趨于精確，因此細胞年齡不符 合用于分離細胞的物理分布的異常變得不顯著。此外，即使這種基于 年齡的梯度不完全精確，只要與隨機血液樣品相比該梯度提供了年齡 關(guān)聯(lián)性更強的年齡相關(guān)的細胞排列，則本文披露的方法提供了用于測 量HbA^水平的優(yōu)點，
如前文在美國專利公開No. US 2007/0099301 (引用結(jié)合于此)中 所描述，將感興趣的紅細胞依據(jù)其尺寸和/或密度的函數(shù)使用例如逆流 離心分離來分離。然而，使用密度梯度離心分離為紅細胞的分離提供 了另外的優(yōu)點，本公開因此提供了用于分餾樣品成份的系統(tǒng)和方法， 包括在毛細通道內(nèi)建立溶液密度梯度，將樣品應(yīng)用于該毛細通道，離 心分離該毛細通道中的樣品，以及通過密度來分餾該樣品的成份.該 方法可以用于測量分年齡組的紅細胞的HbA^水平，
密度梯度離心分離可包括差速區(qū)帶(rate zonal)離心分離或者等 密度離心分離.差速區(qū)帶離心分離典型地采用密度小于感興趣樣品的 溶液梯度。這種情況下，可以通過對樣品離心分離特定時間長度來實 現(xiàn)樣品的分餾。備選地，等密度離心分離利用具有寬的密度范圍的溶 液梯度，其密度范圍典型地寬于感興趣樣品的密度范圍，在等密度離
心分離期間，細胞通常遷移到其等密度點，由此建立在平衡時基于細 胞密度的分餾。
可以由溶劑和溶質(zhì)的任何恰當(dāng)組合來制備所期望的密度梯度溶 液，只要得到的溶液與感興趣的樣品兼容即可。在所披露的方法的一 個實施例中，用于分餾紅細胞的密度梯度溶液可以使用例如碘克沙醇
(OPTIPREPtm)或碘海醇(OMNIPAQUEtm )等的密度梯度試劑而 方便地制備.這些密度梯度試劑的溶液具有低的克分子滲透壓濃度及 合適的密度以用于分餾紅細胞.
選定的密度梯度試劑可通過任一各種方便的方法形成期望的密度 梯度。例如，可以使用一個或多個凍結(jié)-解凍周期來處理均勻溶液密 度的溶液. 一般而言，施加于溶液的凍結(jié)-解凍周期數(shù)目增大會導(dǎo)致 在頂部的梯度明顯較不致密.以這種方式產(chǎn)生的梯度可具有近似線性 的密度梯度。備選地，也可以產(chǎn)生其他非線性密度分布.梯度形成的 這種凍結(jié)-解凍周期方法可以產(chǎn)生完全可再現(xiàn)的密度梯度分布.
為了兼顧經(jīng)濟和效率，會期望利用需要小體積的溶劑和/或小體積 的樣品的方法，例如使用微流體裝置的方法，微流體裝置是利用小體 積的流體例如小至幾納升的流體的裝置。微流體裝置可以使用各種通 道、貯存器、腔體、和/或具有各種幾何的閥門來制備、傳輸和/或分析 樣品。微流體裝置可依靠各種力來傳輸流體通過該裝置，包括注射、 泵浦、施加的吸力、毛細作用、滲透作用、熱膨脹和收縮、離心力等， 在一種非限制性示例中，期望的微流體裝置配置成通過離心分離機被 旋轉(zhuǎn)，且離心力被用于按預(yù)期傳輸期望的流體通過該微流體裝置.
微流體試樣可包括微制作以限定用于感興趣的分析的各種期望通 道、井和/或腔體的基板。微流體試樣的通道和元件可以制作于基板表 面上，且隨后，蓋附著在基板表面上.通常，所述蓋是透明的，使得
流體裝置。
示例性微流體試樣IO示意性示于圖3.微流體試樣IO形式為盤的 形式，且包括多個按徑向圖案取向的毛細通道12,微流體試樣10配置 成使得可以在一個或多個通道12內(nèi)建立密度梯度。通道12的開口端 (朝向旋轉(zhuǎn)軸方向的端部)可以用一個或多個密封件14來密封.依據(jù) 微流體試樣10的一個方面，如圖3所示，單個密封件14覆蓋各個通
道12的開口端。備選地，每個通道12可以用獨立的帽或蓋密封.密 封件14可結(jié)合許多密封機制中的任意一種，包括一次或多次使用的插 塞或帽，或者粘合蓋.密封件14通常在將感興趣的樣品即將施加到通 道12之前被除去.
每個毛細通道12的入口可以是單獨或共享的貯存器.該貯存器可 以配置成接收純血液樣品或其他含紅細胞的樣品、緩沖的血液樣品、 或者諸如緩沖液的非血液樣品.可用于所披露方法的緩沖劑包括磷酸 鹽緩沖的鹽水(PBS)、 PBS的衍生物、以及其他生物兼容的援沖制劑.
每個毛細通道12配置成有利于在通道12內(nèi)形成溶液密度梯度。 依據(jù)微流體試樣10的一個方面，通道12配置成通過兩種或多種單獨 溶液的離心分離來建立密度梯度.依據(jù)微流體試樣10的另一方面，通 道12配置成通過一個或多個凍結(jié) 一 解凍周期來建立密度梯度.然而應(yīng) 理解，在微流體試樣10的至少一個通道12內(nèi)建立溶液密度梯度的所 有方法都是用于本公開的目的的合適方法.
在使用兩種(或多種)具有不同密度的單獨溶液來建立密度梯度 的情形中，這些溶液通常保持隔離直至期望形成梯度。例如，這兩種 溶液可存在于毛細通道12內(nèi)，但是可以通過閥門或臨時擋板來保持隔 離。
隔離兩種不同溶液的擋板可以是物理地防止兩種溶液混合的物理 擋板。這種擋板應(yīng)可以容易地去除而不干擾毛細通道12收納密度梯度 的能力。例如，該擋板可以是石蠟插塞的形式.石蠟插塞可以物理地 隔離存在于毛細通道12內(nèi)的兩種或多種溶液，但是在該石蠟插塞熔化 時，這些溶液隨后混合，從而能形成期望的密度梯度。在擋板可以通 過加熱來去除的情形中，該擋板可以通過電阻加熱、光學(xué)加熱、超聲 加熱、或者其他加熱手段來熔化。
備選地，該擋板可以是毛細通道12的區(qū)域，其中通道12的壁經(jīng) 處理以排斥毛細通道12內(nèi)的溶液。例如，在每種溶液為水溶液的情形 中，該擋板區(qū)域可以被處理，使得通道12的壁是疏水的.這種"液體 閥門，，可以包含具有疏水性的區(qū)域，其與毛細尺寸、施加的離心分離力、 以及流體表面張力中的 一種或多種匹配從而提供閥門機制。也就是說， 沒有離心分離時，該兩種或多種溶液仍是隔離的，而在進行離心分離 時，"上"溶液(朝向旋轉(zhuǎn)軸)藉由所施加的力而被迫通過疏水區(qū)域.
圖4描述了 一種示例性毛細擋板24.在配備有密封件18的毛細通 道16中，具有第一密度的第一溶液20通過擋板24與具有第二密度的 第二溶液22隔離，其中該擋板或者為物理擋板或者為疏水流體閥門. 在通過加熱或者離心分離來激勵以打開擋板24之后，毛細通道16的 進一步離心分離提供了一種呈現(xiàn)密度梯度的溶液26.
盡管也可以不進行離心分離來建立期望的梯度，該過程要花費顯 著更長的時間.作為內(nèi)部控制， 一種或多種用于制備密度梯度的這些 溶液可以結(jié)合密度標(biāo)準(zhǔn)或控制.例如，在建立該密度梯度之前，在毛 細通道12、 16中可存在具有已知密度的有色小珠.
作為離心分離的備選，通過使溶液經(jīng)歷一個或多個凍結(jié)-解凍周 期可建立密度梯度.盡管一個周期可能足以獲得期望的梯度，某些實 施例需要反復(fù)的凍結(jié)-解凍周期以獲得該梯度.與使用的周期數(shù)目無 關(guān)，但應(yīng)理解，周期通常應(yīng)受控制.由于毛細通道12、 16優(yōu)選地在凍 結(jié)-解凍周期時基本上是直立的，微流體試樣10將具有有限數(shù)目的毛 細通道12、 16，或者有限數(shù)目的現(xiàn)有通道12、 16可被使用.此外，由 于通常使用單一溶液，毛細通道12、 16無需包括擋板24.這種微流體 試樣30的示例示于圖5，其具有單個毛細通道32和密封件34.
在本實施例中，毛細通道32容納具有恰當(dāng)密度的單一溶液。使通 道32在基本上垂直取向的情況下凍結(jié)和解凍試樣30,該溶液可以建立 密度梯度36，如圖6所示。
可以使用各種合適的溶液中的任意一種例如蔗糖來建立合適的密 度梯度。依據(jù)該方法的一個方面，使用了碘化造影劑的溶液.具體而 言，造影劑碘克沙醇和/或碘海醇可用于制備期望的密度梯度，已知這 些造影劑在分餾紅細胞方面是有效的。此外，這些造影劑是水溶性的， 化學(xué)穩(wěn)定的，生物惰性的，低粘稠度，且呈現(xiàn)低的克分子滲透壓濃度.
可以作為微流體試樣10、 30的制造和供應(yīng)過程中的 一部分來執(zhí)行 該必需的凍結(jié)-解凍周期，和/或可以在測試場合執(zhí)行該凍結(jié)-解凍周 期。
現(xiàn)在一起參考圖7和8，盡管毛細通道42在凍結(jié)-解凍周期時應(yīng) 保持基本上直立，微流體試樣40可以工程設(shè)計成使得一次可以利用試 樣40上的超過一個的毛細通道42。如圖7所示，微流體試樣40示為 具有兩個微流體通道42和一個密封件44。試樣40和通道42應(yīng)具有這
樣的幾何和配置，使得當(dāng)試樣40直立和豎著被存儲時可以在每個通道 42內(nèi)建立梯度，如圖8所示.通常，這要求該兩個以上的通道42之間 被銳角分離，其中該角度足夠小使得可以在每個通道42內(nèi)建立梯度. 可以使用多個通道42從而提供測試冗余，或者使用不同的溶液密度來 測試細胞的不同部分。
應(yīng)理解，當(dāng)栽入到離心分離機內(nèi)時，試樣IO、 30、 40可以不對稱 地稱重.在這些實施例中，試樣IO、 30、 40或者可結(jié)合裝置以平衡試 樣10、 30、 40，或者允許手動平衡，使得離心分離仍可以無危險地實 施。
通常，在一個或多個通道內(nèi)建立密度梯度時，與用于建立該梯度 的方法無關(guān)，對感興趣的樣品的分析可以按照類似的方式實施-然而， 備選地，樣品可以添加到毛細通道12、 16、 32、 42,且溶液密度梯度 可以與分餾樣品成份同時形成。
現(xiàn)在參考圖9，在已經(jīng)建立梯度且密封件48已經(jīng)移除之后，感興 趣的樣品52可以施加到毛細通道50的頂部。由于紅細胞的分離是一 種平衡過程，血細胞可以沿該梯度的任一點被施加，然而，該梯度的 一端(例如，頂部)通常是施加樣品的方便位置。施加區(qū)域還可包括 溢出貯存器(未示出)，從而防止過量的樣品(例如，血液和細胞)施 加到該梯度。在施加樣品之后，梯度列經(jīng)歷附加的離心分離，直到獲 得樣品成份的期望的分離梯度54。
在獲得樣品成份的密度梯度之后，樣品可以經(jīng)歷各種分離后 (post-s印aration)工序的任意一種。例如，樣品成份可以被溶解用于 進一步分析。圖IO描述了在已經(jīng)實現(xiàn)樣品分餾之后的細胞溶解步驟. 該溶解被描述為發(fā)生在毛細通道50自身內(nèi)，通過施加強電場到毛細通 道50可以方便地實現(xiàn)這一點。已知在存在電場時，細胞會經(jīng)歷電穿孔， 或者完全溶解，視所施加電場的強度和頻率而定.細胞溶解需要至少 約100KV/m的場梯度，然而該閾值至少部分地視信號頻率及細胞懸浮 于其中的介質(zhì)而變化。直流場也可以用于樣品的溶解，但是直流場會 導(dǎo)致不期望的效應(yīng)，例如介質(zhì)和細胞中的電泳和焦耳加熱。此外，當(dāng) 電極與介質(zhì)絕緣時，直流或低頻場能夠或者不能夠產(chǎn)生充分的場梯度， 因為許多電壓將降落在絕緣層兩端.因此，有利地使用具有足夠高頻 率的交流場以避免這些問題。
用于施加電場的電極的緊密間隔可以大幅減小所需的電極源電壓
的幅值，如果電極內(nèi)建在微流體試樣IO、 30、 40自身內(nèi)，使得電極置 于毛細通道12、 16、 32、 42、 50的對立側(cè)上，則得到的電極間隔近似 等于或略微大于毛細通道寬度.由于紅細胞通常直徑約為7jim或8pm， 毛細通道可以窄至約lOOjim而無堵塞的危險，特別是如果諸如肝磷脂 或EDTA的抗凝血劑添加到'溶液.電極間隔為lOOpm時，20Vrms的源 電壓將產(chǎn)生約200KV/m的場梯度，忽略了由于存在任何中間絕緣層而 引起的電壓降落。
此外，在通過光學(xué)問詢(interrogation )來執(zhí)行樣品分析的情況下， 可以使用諸如氧化銦錫(ITO)的光學(xué)透明材料來制造電極.
可以使用模擬振蕩器(離散或集成的)或者數(shù)字函數(shù)發(fā)生器，或 者其他方法來產(chǎn)生中頻(300KHz至3MHz)信號以有效地溶解細胞. 實施簡單的振蕩器電路是相對成本有效的.然而，數(shù)字電路可以提供 增強的靈活性。此外，取決于振蕩器架構(gòu)，期望使用輸出緩沖器級從 而獲得期望的電壓電平.
與圖11的電路60相似的簡單電路能夠使用現(xiàn)貨供應(yīng)的集成部件 來產(chǎn)生高達若干MHz的20Vrms信號。如果要求更寬的電極間隔，則 通過添加升壓變壓器可以獲得顯著更高的輸出電壓(例如，高達 1000Vrms)，如圖12的電路62所示。離散電子解決方案也可以提供寬 范圍的輸出電壓，但是這些電路與集成解決方案相比更難以實施。折 衷的選擇是使用例如自舉(bootstrapped )運算放大器電路的混合方案， 其盡管比完全集成設(shè)計更復(fù)雜，但是與離散實施相比設(shè)計和表征較簡 單。仔細選擇元件，混合電路可以用于產(chǎn)生具有合理頻率響應(yīng)的高達 幾百伏特的輸出信號。
期望將電極與介質(zhì)絕緣以防止不希望的化學(xué)反應(yīng)。然而應(yīng)理解， 某些電場浪費在這種絕緣邊界上。電極和介質(zhì)之間的絕緣擋板將表現(xiàn) 為與擋板材料的介電常數(shù)成正比且與擋板厚度成反比的串聯(lián)電容，且 損耗在該擋板上的信號電壓與擋板電容和信號頻率均成反比.絕緣擋 板因此應(yīng)該盡可能薄以最大化擋板電容，最大化存在于介質(zhì)中的電場， 并允許低頻信號更好地穿透該擋板。這種擋板包括氮化硅和碳化硅. 在本文披露的實施例中，已經(jīng)制作和使用了 30-40nm的氮化硅絕緣擋 板。
依據(jù)所披露方法的一個方面，有利地在離心分薦樣品的同時施加
一溶解電場，為了將電壓傳送到旋轉(zhuǎn)的微流體試樣IO、 30、 40上的電 極，可以使用某種類型的滑動環(huán)和電刷系統(tǒng).例如，如圖13所描述， 微流體試樣66包括毛細通道(未示出)及關(guān)聯(lián)的電極68,試樣66包 括與溶解電極68電連通且也與試樣電刷72電連通的兩個滑動環(huán)70. 溶解電壓可以施加到電刷72，即使在試樣66旋轉(zhuǎn)時，使得在毛細通道 (未示出)形成施加的電場.使用任何滑動環(huán)系統(tǒng)，可能存在偶發(fā)的 接觸損耗，因此也可以與所披露的滑動環(huán)系統(tǒng)相結(jié)合地使用例如大的 接觸區(qū)域、導(dǎo)電油脂等的附加預(yù)防措施.
備選地，如圖14所示，可以通過結(jié)合到錠子76的滑動環(huán)77來施 加電場，其中微流體試樣74在該錠子76上旋轉(zhuǎn).在圖14，包含毛細 通道(未示出)和關(guān)聯(lián)電極75的微流體試樣74示為具有互補錠子76. 錠子76可以配置成包含位于錠子76內(nèi)部的信號發(fā)生電路，使得直流 功率傳遞經(jīng)過滑動環(huán)77,當(dāng)在錠子76上旋轉(zhuǎn)試樣74時，溶解信號可 以通過位于試樣74下側(cè)上的固定接頭78傳遞到試樣74。錠子76可包 含一個或多個對準(zhǔn)特征79，從而保證錠子76上的試樣接頭80與試樣 74下側(cè)上的固定接頭78之間的恰當(dāng)?shù)碾娊佑|。錠子76內(nèi)部存在足夠 大量的存儲電容器和電源濾波，這可以幫助消除對減小由于錠子電刷 81引起的噪聲的需要。依據(jù)所披露的錠子76的另一方面，可以使用同 心圓環(huán)接頭(未示出)來替代固定的試樣接頭80，由此消除了對對準(zhǔn) 特征79的需要以保證電接觸。
在又一配置中，如圖15所示，可以使用浮置在微流體試樣C上方 和下方的固定電極A和B來施加電場，由此產(chǎn)生與試樣C垂直的電場. 然而，電極A和B與介質(zhì)之間的間隙大，需要高的電壓以在梯度介質(zhì) 內(nèi)產(chǎn)生足夠的場強度。
在樣品被分離和溶解之后，樣品成份可以通過溶解血細胞探測領(lǐng) 域中公知的任意方法被探測。例如，如圖16所示，含有梯度溶解血細 胞的梯度毛細通道82包含沿著該梯度微通道的多個電阻器83，其中通 過單獨的閥門88來訪問相關(guān)的探測器區(qū)域84和出口 86。各種有源和 無源閥門可以用于此目的，如上文所述及本領(lǐng)域所7>知的。具體而言， 使用具有較低熔點的石蠟插塞可以用于在至少部分移除該插塞時形成 至探測器區(qū)域84的入口。在本實施例中，電阻器83可以被加熱以形
成氣泡，這些氣泡用于至少部分隔離該溶解血細胞組，且還提供原動
力使溶解血細胞移動經(jīng)過閥門88進入探測器區(qū)域84用于隨后的HbAlc測量。
依據(jù)本公開的另一方面，圖17描述了容納血細胞梯度的一種備選 梯度毛細通道90,本實施例中的毛細通道90連接到粒子探測器92. 一旦血細胞被探測到到達粒子探測器92,各個閥門94可被開啟以將血 細胞接收到相應(yīng)的溶解微通道96，血細胞在該微通道96中可以通過任 一上述方法被溶解，且相應(yīng)的HbA^測量可以在單獨的探測器區(qū)域98 中進行。溶解微通道96可以配置成在細胞回流時或者通過使用結(jié)合圖 16所述的電阻器83來接收血細胞.在本實施例中，每個溶解微通道 96可以耦合到分析腔體(未示出)，如前文所述.
微流體試樣IO、 30、 40、 66、 74的實施例可以用于通過樣品成份 的密度來分餾樣品成份的方法，如圖18的流程圖IOO所示.該方法可 包括在毛細通道內(nèi)建立溶液密度梯度102;將樣品施加到毛細通道 104;在毛細通道內(nèi)離心分離該樣品106;以及通過密度分餾該樣品的 成份108.在一個實施例中，該方法是用于測量糖化血色素.在本實施 例中，樣品可包含紅細胞，且離心分離樣品可建立紅細胞的多個分年 齡組。該方法還可包括測量該紅細胞的分年齡組的至少一個組的HbAlc 水平
盡管已經(jīng)參考前述工作原理示出和描述了本發(fā)明的實施例，但是 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不背離由下述權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的 精神和范圍的情況下可以進行各種形式和細節(jié)上的變化.可以想到開 口、柄、以及夾板主體的各種配置，以及封裝結(jié)與夾板的開口和柄之 間的各種可能的相互作用.本發(fā)明旨在包含所有這些備選、改進和變 型，包括本文所披露的各種元件、特征、功能和/或性能的所有新穎的 非顯而易見的組合及子組合。
權(quán)利要求
1.一種分餾樣品成份的方法，包括a)在毛細通道內(nèi)建立溶液密度梯度(102)；b)將所述樣品施加到所述毛細通道(104)；及c)離心分離所述毛細通道內(nèi)的所述樣品(106)，由此通過密度來分離所述樣品的成份(108)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所迷樣品(52)包括紅細胞。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述溶液密度梯度(26， 36， 54) 是通過在所述毛細通道(12， 16， 50)內(nèi)組合至少兩種不同溶液(20， 22)并離心分離組合的溶液來建立的.
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述兩種不同溶液(20， 22)是 通過所述毛細通道(12， 16， 50)內(nèi)的擋板(24)來隔離的，
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述擋板(24)為石蠟插塞，且 組合所述溶液包括通過加熱石蠟來移除所述插塞。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述擋板(24)為所述毛細通道 (12， 16, 50)的疏水區(qū)域，且組合所述溶液(20, 22)包括離心分離所述毛細通道(12, 16)。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述溶液密度梯度(26， 36， 54) 是通過在所述毛細通道(12， 16)內(nèi)所述溶液的至少一個凍結(jié)-解凍周 期來建立的。
8. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述樣品(52)包括紅細胞，且 分餾所述樣品的成份包括在所述溶液密度梯度(26， 36, 54)中建立紅 細胞的多個分年齡組，所述方法還包括溶解所述紅細胞分年齡組的至 少一組的紅細胞；以及測量所述紅細胞分年齡組的該至少一組的HbAlc水平。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中溶解紅細胞包括施加電場到紅細胞.
10. —種用于執(zhí)行樣品的密度梯度分餾的微流體試樣(IO， 30， 40)， 包括至少一個毛細通道(12， 16， 50 )，封閉能夠形成溶液密度梯度(26， 36， 54)的溶液；以及樣品井，與所述至少一個毛細通道連通，所述樣 品井配置成將樣品添加到所述至少一個毛細通道；其中所述微流體試樣(10)適合于在離心分離機中旋轉(zhuǎn)以在至少一個毛細通道(12)內(nèi)形成 溶液密度梯度。
11. 如權(quán)利要求10所述的微流體試樣(10， 30, 40),其中所述微流 體試樣為微流體盤，在盤上徑向地布置有多個毛細通道(12， 16， 50)， 還包括鄰近至少一個所述毛細通道(12， 16， 50)的一對電極(68),其 中該對電極(68)配置成施加電場到所述至少一個毛細通道(12， 16, 50)的容納物，
12. 如權(quán)利要求10所述的微流體試樣，其中所述至少一個毛細通道 (12， 16， 50)封閉通過擋板(24)隔離的兩種不同溶液(20， 22),且其中所述溶液被選擇為在組合并離心分離時形成溶液密度梯度(26， 36， 54),
13. 如權(quán)利要求12所述的微流體試樣，其中所述至少一個毛細通道 (12， 16， 50)封閉在暴露于一個或多個凍結(jié)-解凍周期時能夠形成溶液密度梯度(26， 36， 54)的溶液.
14. 一種用于測量糖化血色素的系統(tǒng)，包括微流體試樣(IO， 30， 40)，配置成在離心分離機內(nèi)被旋轉(zhuǎn)；至少一個毛細通道(12, 16， 50)， 位于所述微流體試樣上，封閉在離心分離時能夠形成溶液密度梯度(26， 36， 54)的溶液；樣品井，與所述毛細通道(12， 16, 50)連接并配置 成用于將包含紅細胞的樣品添加到至少一個毛細通道(12， 16， 50);離 心分離機，適合于旋轉(zhuǎn)所述微流體試樣(10， 30， 40)并將紅細胞分離 為分年齡組；以及測量裝置，配置成測量所述分年齡組的至少一組的 HbA^水平。
全文摘要
測量糖化血色素的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明公開了用于分餾樣品成份的系統(tǒng)和方法。一種分餾樣品成份的方法包括在毛細通道內(nèi)建立溶液密度梯度(102)，將樣品施加到毛細通道(104)，以及離心分離毛細通道內(nèi)的樣品(106)，由此通過密度來分離樣品的成份(108)。
文檔編號G01N1/34GK101354327SQ20081013112
公開日2009年1月28日 申請日期2008年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者D·A·泰沃爾, K·W·諾爾頓 申請人:惠普開發(fā)有限公司